Die Nutzung der EpiAirway Modell zur Charakterisierung Langfristige Host-Pathogen Interactions

Published 9/02/2011
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Immunology and Infection

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Summary

Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung von ausgedehnten bakteriellen Co-Kultur mit EpiAirways, primären humanen respiratorischen Epithel an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche gewachsen, einem biologisch relevanten

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Ren, D., Daines, D. A. Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions. J. Vis. Exp. (55), e3261, doi:10.3791/3261 (2011).

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Abstract

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) sind Menschen angepassten Gram-negative Bakterien, die wiederkehrende und chronische Infektionen der Schleimhaut der Atemwege 1 Ursache kann; 2. Um die Mechanismen, mit denen diese Organismen an und im respiratorischen Gewebe überleben, ein Modell, in dem langfristig erfolgreiche Co-Kultur von Bakterien und menschlichen Zellen durchgeführt wird, gefordert werden kann, zu studieren. Wir verwenden primären humanen respiratorischen Epithelzellen Gewebe angehoben, um die Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche, die EpiAirway Modell (MatTek, Ashland, MA). Diese sind nicht unsterblich, gut differenzierten, 3-dimensionale Gewebe, die Tight Junctions, Flimmer-und nonciliated Zellen, Becherzellen, dass Mucin zu produzieren, und behalten die Fähigkeit, Zytokine in Reaktion auf eine Infektion zu erzeugen enthalten.

Diese biologisch relevanten In-vitro-Modell des menschlichen oberen Atemwege kann in einer Reihe von Arten verwendet werden; das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, langfristige Zusammenarbeit Kultur EpiAirway Gewebe mit NTHi und zu quantifizieren zellassoziierte und verinnerlicht Bakterien im Laufe der Zeit durchführen . Wie gut, kann Mucin Produktion und die Zytokin-Profil der infizierten Co-Kulturen bestimmt werden. Dieser Ansatz verbessert existierende Verfahren in, dass viele aktuelle Protokolle verwenden untergetaucht Mono-oder Transwell Kulturen von menschlichen Zellen, die nicht fähig sind, unterstützen bakterielle Infektionen über längere Perioden 3. Zum Beispiel, wenn ein Organismus in der darüber liegenden Medien replizieren kann, kann dies zu nicht akzeptablen Niveau der Zytotoxizität und der Verlust der Wirtszellen durch, verhaftete das Experiment. Die EpiAirway Modell ermöglicht die Charakterisierung der langfristigen Wirt-Pathogen-Interaktionen. Ferner kann, da die Quelle für die EpiAirway ist normale menschliche tracheobronchialen Zellen anstatt einer immortalisierten Linie ist jeder eine ausgezeichnete Darstellung der tatsächlichen menschlichen oberen Atemwege Gewebe, sowohl in Struktur und in Funktion 4.

Bei dieser Methode werden die EpiAirway Gewebe entwöhnt von anti-mikrobiellen und Anti-Pilz-Verbindungen für 2 Tage vor der Auslieferung, und alle Verfahren sind unter Antibiotika-freien Bedingungen durchgeführt. Dies erfordert besondere Überlegungen, da beide Bakterien und primären humanen Geweben in der gleichen Biosicherheitswerkbank verwendet werden und sind Co-Kultivierung über einen längeren Zeitraum.

Protocol

1. Vorbereiten des Biosicherheitswerkbank für die EpiAirway Gewebe

  1. Das Tragen eines speziellen Laborkittel, mit Haar zurück und Handschuhen verbunden, starten Sie den laminaren Strömung. Nach 5 Minuten, verschieben Sie alle Werkzeuge im Schrank (Pipetten, Spitzen, Reaktionsgefäße usw.) auf der einen Seite, sprühen die Biosicherheit Schrankinneren und Flügel mit 70% Ethanol und wischen Sie mit sauberen Papiertüchern. Spray die gereinigte Innenraum wieder mit 70% Ethanol und trocknen lassen. Bewegen Sie die Werkzeuge, um auf der sauberen Seite und wiederholen Sie den Vorgang Ethanol.
  2. Verwenden Sie Aerosolbarriere Pipettenspitzen und engagierten Pipetten in den Schrank. Zur Verwendung einzeln verpackte sterile serologische Pipetten, vorbei am gesteckt Ende durch den laminaren Strömung, aufzubrechen, und schieben Sie die Pipette in das Kabinett, das Verwerfen der Verpackung außen.
  3. Die EpiAirway Beilagen müssen mit einer sterilen Pinzette gehandhabt werden. Legen Sie 6-Zoll-Fein-Spitze gebogenen Pinzette in selbstdichtend Sterilisation Beutel und Autoklaven. Bereiten Sie genug, um mindestens sechs pro Tag einsatzbereit.

2. Auspacken des EpiAirway Gewebe

  1. Sprühen Sie die Arbeitsfläche in der Biosicherheitswerkbank mit 70% Ethanol und wischen Sie mit sauberem Küchenpapier. Spray wieder und lassen die Oberfläche zu trocknen, bevor zu verwenden. Öffnen Sie die EpiAirway Feld und entsorgen Sie die Styropor und Verpackungsmaterial.
  2. Die EpiAirway Antibiotika-freien Medien Wartung, AIR-100-MM ABF (MM), sind Eigentum von MatTek und ist im Kit mit den Einsätzen geschickt. In der Biosicherheitswerkbank, label sechs sterile 50 ml Zentrifugenröhrchen mit den Medientyp und Datum, und lösen Sie die Kappen. Sprühen Sie die Medien-Flasche mit 70% Ethanol und öffnen im Schrank. Aliquot 25 ml MM in jedes Röhrchen mit einer neuen sterilen serologischen Pipette für jedes Rohr, ziehen Sie die Kappen, und lagern bei 4 ° C. Verwenden Sie ein frisches Aliquot MM jeden Tag.
  3. Wiederholen Sie Punkt 2.2 mit einer frischen Flasche 1 X Dulbeccos Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (D-PBS) mit Kalzium und Magnesium. Wiederholen Sie den Vorgang mit D-PBS ohne Calcium und Magnesium. Speichern Sie alle Aliquots bei 4 ° C.
  4. Die EpiAirway Einsätze AIR-100 kommen in einem 24-Well-Platte bei 4 ° C auf festen Medien-haltige Agarose, und muss in 6-well Platten für den Einsatz gebracht werden. Beschriften Sie jede Platte mit dem Datum und Beschreibung mit einem Ethanol-resistente Marker. Platz 1 Milliliter 4 ° C EpiAirway MM in jedes Well. Entfernen Sie die Transportsicherung Platte aus der Verpackung, Spray mit 70% Ethanol, und in der Biosicherheitswerkbank. Entfernen Sie das Klebeband und öffnen Sie die Platte. Mit autoklaviert Zange, entfernen Sie die feuchten Gaze über die EpiAirway Einsätze.
  5. Pick-up ein Insert mit autoklaviertem Pinzette mit einer Drehbewegung in die Freigabe aus dem Agarose-Hilfe, und in einen Napf einer 6-Well-Platte. Einige Agarose kann, um den Einsatz halten, zumal die Temperatur der Transportplatte auf Umgebungstemperatur steigt. Verwenden Sie eine sterile Wattestäbchen, um vorsichtig die Agarose aus dem Einsatz. Berühren Sie nicht die Membran, und überprüfen, dass keine Luftblasen unter der Einsätze sind gefangen. Legen Sie die Platte in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2.
  6. Lassen Sie mindestens 24 Stunden für die Gewebe in den Inkubator vor dem Start Co-Kulturen ausgleichen.

3. Wartung von EpiAirway Gewebe

  1. Mit autoklaviert Zange holen ein Insert und sanft Pipette 200 Mikroliter vorgewärmten D-PBS mit Kalzium und Magnesium auf das Gewebe und Rock des Einsatzes. Kippen Sie das Insert in einem Winkel und platzieren Sie Ihre sterile P1000 Pipettenspitze gegen die Kunststoff-Ring, dass die Membran an der Unterseite des Einsatzes hält. Berühren Sie nicht das Gewebe. Saugen Sie das D-PBS spülen und in einen markierten sterile Kryoröhrchen. Die Proben können bei -20 ° C eingefroren und untersucht für Mucin und / oder Zytokin-Expression zu einem späteren Zeitpunkt.
  2. Ändern Sie den basalen MM täglich durch Absaugen und Austauschen mit 1 Milliliter frisches MM. Verwenden Sie eine neue Barriere Pipettenspitze für jedes Well. Behandeln Sie die verwendeten Medien mit 10% Bleiche Nacht und entsorgen.

4. Inokulation von EpiAirway Gewebe

  1. Streak eine frische Kultur nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) aus gefrorenen Glycerin Lager auf Schokolade-Agar. Wachsen Sie über Nacht in einer feuchten 5% CO 2-Inkubator.
  2. Am nächsten Tag, resuspendieren einzelne Kolonien von NTHi in vorgewärmten D-PBS mit Kalzium und Magnesium zu einer OD (600 nm) von ca. 0,7. Vortex kräftig vor der Messung der optischen Dichte. Das Verhältnis der optischen Dichte auf Kolonie-bildenden Einheiten pro ml (KBE / ml) von NTHi ist, dass eine OD (600 nm) von 0,2 entspricht in etwa 1,0 x 10 8 CFU / ml. Daher ist eine OD (600 nm) von 0,7 etwa 3,5 x 10 8 CFU / ml. Dieser Algorithmus sollte für jeden NTHi Belastung vor der Impfung überprüft werden.
  3. Die EpiAirway Gewebe AIR-100 sind auf Einsätze mit einer Fläche von 0,6 cm 2 und eine 0,4 Mikron Membran gewachsen. Die Gewebe werden von ~ 8,0 x 10 5 bis ~ 1,0 x 10 6 komponiert </ Sup>-Zellen. Daher entspricht eine Impfung von 1,0 x 10 7 CFU zu einer Multiplizität der Infektion von etwa 10 bis 12. Um zu impfen, spülen jedes EpiAirway einfügen wie in 3.1, dann fügen Sie 28 Mikroliter der Bakteriensuspension in 4,2 bis der apikalen Oberfläche von jedem EpiAirway Einsatz im Biosicherheitswerkbank vorbereitet. Nicht impfen die basale MM. Return jede Platte in den Inkubator.

5. Die Quantifizierung der NTHi Inokulum

  1. Bereiten Sie eine Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)-Lösung mit 0,1% Gelatine (PBS-G), Autoklaven zu sterilisieren. Label sterile 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit der gewünschten 1:10 Verdünnungen auf der OD (600 nm) des Inokulums und aliquoten 900 Mikroliter der sterile PBS-G in jedes Röhrchen basiert.
  2. Bestimmen Sie die Anzahl der Schokolade-Agar-Platten benötigt, um den geimpften NTHi aufzuzählen. Legen Sie diese Platten in einem Luft-Inkubator auf den Kopf mit der Unterseite der Platte ruht auf der Hälfte der oben für eine Stunde. Damit wird die Platte sowohl warm bis 37 ° C und die Oberfläche zu trocknen, die Erleichterung der Drop-Beschichtung von NTHi.
  3. Starten Sie das serielle 1:10 Verdünnungen des Inokulums durch Zugabe von 100 Mikroliter der Bakteriensuspension von 4,2 auf der ersten Röhre. Vortex jeder Verdünnung kräftig für 5 Sekunden bevor die nächste. Drop 10 Mikroliter Aliquots auf den vorgewärmten und Oberfläche getrocknet Schokolade-Agar-Platten, mit der Hälfte der Platte für jede Verdünnung. Fünf bis sechs 10 Mikroliter Aliquots können auf einer Hälfte eines jeden 100 mm Platte ohne fließendes zusammen passen. Wenn trocken, statt den Kopf in einer befeuchteten 37 ° C CO 2-Inkubator über Nacht.
  4. Am nächsten Tag bestimmen die CFU / ml durch Zählen der Verdünnungen, 15-30 verschiedene Kolonien in jedem Tropfen haben und die Berechnung zurück an Ihren aktuellen lebensfähig Inokulum von NTHi.

6. Langfristige Co-Kultur mit NTHi

  1. Alle 24 Stunden, waschen Sie die Einsätze wie in 3.1, dann ist die Waschungen jedes Gewebe, das mit dem gleichen Stamm von Bakterien und bei -20 ° C in einer markierten Kryoröhrchen für zukünftige Analysen wurden geimpft Pool. Diese Proben können auf das Vorhandensein von Mucin durch Dot-Blots oder für die Expression von Zytokinen mittels ELISA getestet werden. Alternativ kann Gewebe für mRNA geerntet werden und qPCR können auf Gene von Interesse durchgeführt werden. Ändern Sie den basalen MM täglich in 3,2. Fahren Sie für die Dauer der Co-Kultur.

7. Die Ernte der EpiAirway Gewebe

  1. Bereiten Sie eine frische 1% ige Lösung von Saponin in D-PBS ohne Calcium und Magnesium-, Filter-sterilisiert und warm bis 37 ° C.
  2. Warm eine 50 ml Tube MM und anderen von D-PBS ohne Calcium und Magnesium zu 37 ° C.
  3. Bereiten Verdünnungsröhrchen wie in 5.1, sowie eine leere sterile 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen pro Platte, mit der Nummer und NTHi Belastung gekennzeichnet.
  4. Die EpiAirways kann entweder für insgesamt Zell-assoziierten Bakterien geerntet werden, die sowohl Anhänger und verinnerlicht Organismen oder für internalisierte Bakterien nur.
  5. Bestimmen Sie die Anzahl der Schokolade-Agar-Platten benötigt, um Drop-Platte der Zell-assoziierten oder überfallen NTHi, Etiketten und trocken für eine Stunde in einer Luft-Inkubator wie in 5.2.
  6. Zur Ernte insgesamt Zell-assoziierten Bakterien, spülen Sie die apikale Oberfläche der EpiAirways dreimal mit 200 Mikroliter D-PBS ohne Calcium oder Magnesium, dann kippen Sie das Insert und spülen Sie alle verbleibenden MM von der Basalmembran. Die erste Wäsche kann für eine spätere Analyse eingefroren werden; entsorgen Sie die folgenden Wäschen.
  7. Legen Sie die gewaschenen einfügen in eine neue 6-well-Platte ohne MM und Pipette 250 Mikroliter der sterile 1% Saponin-Lösung von 7,1 auf der apikalen Oberfläche der einzelnen Gewebe. Zurück zu den Inkubator für 10 Minuten.
  8. Entfernen Sie aus dem Inkubator und mit einem sterilen P1000 Pipettenspitze, schrubben die Gewebe von der Membran mit einem Hin-und Herbewegung, durch eine kreisförmige Bewegung, um das Gewebe an den Rändern des Einsatzes zu entfernen. Mit einer großen Bohrung sterile P1000 Pipettenspitze, legen Sie die Suspension in die leere beschriftet Rohr in 7,3 zubereitet. Eintragen von 250 Mikroliter D-PBS ohne Calcium oder Magnesium auf der apikalen Oberfläche der Einlage.
  9. Untersuchen Sie die CD mit einem umgekehrten Phasenkontrastmikroskop, um festzustellen, ob es eine verbleibende Gewebe geerntet werden. Wenn nötig, wieder schrubben mit einem anderen sterilen P1000 Pipettenspitze, dann fügen Sie diese Suspension auf das Rohr von 7,8 mit einer großkalibrigen sterile P1000 Pipettenspitze. Bringen Sie das Gesamtvolumen des Rohres zu 1 Milliliter mit D-PBS ohne Calcium oder Magnesium.
  10. Kräftig Wirbel der Zellsuspension bei Höchstgeschwindigkeit für 1 Minute. Mit einer sterilen 1 ml-Spritze mit einer 26-Gauge-Nadel ausgestattet, saugen die Suspension in der Spritze durch die Nadel. Langsam gehen die Suspension durch die Nadel 3-mal, dabei nicht zu Blasen zu erzeugen. Vortex kräftig wieder für 1 Minute.
  11. Mit einer großen Bohrung Pipettenspitze, Platz 100 Mikroliter der Suspension in den ersten Verdünnungsröhrchen in 7 vorbereitet.3. Vortex kräftig für fünf Sekunden, dann machen serielle 1:10 Verdünnungen. Drop-Platte den gewünschten Verdünnungen auf die Oberfläche getrocknet Schokolade-Agar-Platten.
  12. Zur Ernte verinnerlicht Bakterien nur, waschen jeden Einsatz 3 mal mit je 200 Mikroliter D-PBS ohne Calcium oder Magnesium. Bewahren und frieren die ersten Waschgang. Add Gentamicinsulfat auf vorgewärmten MM, um eine endgültige Konzentration von 100 Mikrogramm / ml. Bereiten Sie 1,5 ml Medium pro Platte geerntet werden. Ersetzen Sie die basale MM mit der Gentamicin-haltigen MM, und 300 Mikroliter Gentamicin-haltigen MM auf der apikalen Oberfläche. Legen Sie die Platte wieder in die CO 2-Inkubator für eine Stunde.
  13. Entfernen Sie die Gentamicin-haltigen MM aus der apikalen Oberfläche und waschen die apikale Oberfläche und Basalmembran des Einsatzes ausführlich mit vorgewärmten D-PBS ohne Calcium und Magnesium. Gehen Sie wie in 7,7-7,11.

8. Repräsentative Ergebnisse:

Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen (A.) nicht infizierten EpiAirway Gewebe und (B) Gewebe nach einer 5-Tage-Co-Kultur mit NTHi sind in Abbildung 1 dargestellt. Langfristige Co-Kultur mit NTHi nicht zu erheblichen Schäden an der apikalen Ergebnis Gewebe, unterstreicht den Nutzen der EpiAirway Modell. Eine graphische Darstellung, die Zahl der internalisierten Bakterien im Laufe der Zeit im Gewebe quantifiziert wird in Abbildung 2 dargestellt. Beide Ergebnisse sind recht reproduzierbar, so dass die EpiAirway Gewebe eine konsistente und biologisch relevanten In-vitro-Modell des menschlichen oberen Atemwege in die Studie NTHi Wirt-Pathogen- Wechselwirkungen.

Abbildung 1
Abbildung 1. Rasterelektronenmikroskopie EpiAirway Gewebe. A. infizierte Kontroll-Gewebe. B. Tissue nach fünf Tagen der Co-Kultur mit NTHi. Keine signifikanten Schäden an der apikalen Oberfläche ist in den infizierten Geweben beobachtet.

Abbildung 2
Abbildung 2. Anzahl der NTHi verinnerlicht im Laufe der Zeit während EpiAirway Co-Kultur. Der Stamm R2866 wurde auf etwa 1,0 x 10 7 CFU / insert (Tag 0), dann für verinnerlicht Bakterien bei jedem angegebenen Zeitpunkt geerntet geimpft. Bars repräsentieren n = 3 Wiederholungen in mindestens verdoppeln. Fehlerbalken sind SD.

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Discussion

Diese Methode erlaubt die Untersuchung der langfristigen Wirt-Pathogen-Interaktionen in einem biologisch relevanten Hintergrund von primären humanen respiratorischen Gewebe an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche. Hier haben wir NTHi als der Erreger verwendet, sondern das Zusammenspiel von Bakterien, die nicht vorstellen unannehmbar Zytotoxizität im Laufe der Zeit kann mit dieser Methode quantifiziert werden. Die EpiAirway Modell kann auch für das Studium von Viren, Medikamente oder Chemikalien, die Auswirkungen des menschlichen oberen Atemwege verwendet werden 5, 6, 7, 8. Wir haben nicht infizierten Geweben für mehr als 40 Tage, und Gewebe mit NTHi für mindestens 10 Tage infiziert gehalten. Wir gehen davon aus, dass infizierte Gewebe deutlich länger aufrechterhalten werden könne, wenn gewünscht.

Die Grenzen dieser Methode sind ähnlich wie bei einer In-vitro-Modell, einschließlich der Unfähigkeit zu rekonstruieren einem kompetenten Immunsystem in diesen Geweben. Obwohl täglich wäscht der Gewebe durchgeführt werden, um normale mukoziliäre Clearance imitieren, zur Schaffung einer natürlichen Absatzmarkt für das Mucin in diesen Geweben produziert wäre wünschenswert, 9. Weitere, mit NTHi ist bekannt, dass Mucin Expression in humanen respiratorischen Epithelzellen induzieren Kontakt, eine Verschärfung des Problems 10. Auf der anderen Seite kann die tägliche EpiAirway wäscht gespeichert und analysiert für Proteine ​​oder enzymatische Aktivitäten von Interesse, indem eine wichtige Dimension der Methode und die Erhöhung ihrer Nützlichkeit.

Ein entscheidender Schritt in der erfolgreichen Durchführung dieser Methode ist die mechanische Zerstörung des Gewebes vor drop-Beschichtung der NTHi (Schritt 7,10). Da die EpiAirways sind hoch differenziert und besteht aus mehreren Zelltypen, sind die Gewebe nicht so einfach wie ein Zellmonolayer zerfallen, auch nach Saponin Behandlung. Darüber hinaus sind NTHi notorisch anfällig für Verbindungen, die Beihilfen in der Disaggregation von Geweben. Deshalb haben wir festgestellt, dass das Bestehen der Zellsuspension durch ein 26-Gauge-Nadel verbessert unsere Fähigkeit, konsistente und reproduzierbare Quantifizierung von verinnerlichten oder Zell-assoziierten Bakterien zu erzeugen.

Sobald diese Technik beherrscht wird, kann es auch verwendet, um die relative Fähigkeit von mutierten Bakterienstämme, um zu überleben als ihre Wildtyp-Eltern im Vergleich zu untersuchen, so dass die Ermittler auf die Auswirkungen der spezifischen genetischen Mutationen zu charakterisieren.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgements

Wir möchten Patrick Hayden (MatTek) für hilfreiche Diskussionen danken, und Robert Smith und Libby Perry of Georgia Health Sciences University für ihre EM Fähigkeiten. Diese Studie wurde von NIDCD gewähren DC010187 zu DAD finanziert

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Saponin Calbiochem 558255-25GM 1% in D-PBS without calcium or magnesium, filter sterilize
1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline with calcium and magnesium Lonza Inc. 17-513Q
1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline without calcium or magnesium Lonza Inc. 17-515Q
EpiAirway antibiotic-free tissues MatTek Corp. AIR-100-ABF
EpiAirway antibiotic-free maintenance media MatTek Corp. AIR-100-MM-ABF Supplied with kit
10X phosphate-buffered saline solution EMD Millipore 6506 Dilute to 1X before use
Gelatin JT Baker 2124-01 Add to a final concentration of 0.1% in 1 X PBS and autoclave
Difco GC Medium Base (chocolate agar) VWR international 90002-016 Autoclave 36 g in 500 ml ddH2O and cool to 60°C
BBL Hemoglobin (chocolate agar) VWR international 90000-662 Autoclave 10 g in 500 ml ddH2O, cool to 60°C and mix with the GC medium base above
BD BBL IsoVitaleX enrichment (chocolate agar) VWR international 90000-414 Cool the mixture of GC medium base and hemoglobin to 55°C and add 10 ml of rehydrated IsoVitaleX, pour chocolate agar plates
Dissecting forceps, fine tip, curved VWR international 82027-406
Self-sealing sterilization pouches VWR international 89140-802
Gentamicin sulfate, 10 mg/ml Lonza Inc. 17-519Z Add 10 microliters/ml to EpiAirway MM for the gentamicin kill

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References

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