Author Produced

Вывод Обогащенный олигодендроцитов культур и олигодендроцитов / Нейрон Myelinating сотрудничества культур от Послеродовые мышей тканей

Neuroscience
 

Summary

В этой статье описываются методы для получения обогащенного популяции мышиные клетки-предшественники олигодендроцитов (OPC) в первичной культуре, которые отличают производить зрелые олигодендроциты (ВЛ). Кроме того, в настоящем докладе описываются методы для получения мышиных myelinating совместно культур путем посева мыши OPCs на нейритов кровать мыши задний корешок ганглиозных нейронов (DRGNs).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues. J. Vis. Exp. (54), e3324, doi:10.3791/3324 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Определение молекулярного механизмов, лежащих OL развития не только решающее значение для углубления нашего знания OL биологии, но также имеет значение для понимания патогенеза демиелинизирующих заболеваний, таких как рассеянный склероз (РС). Сотовая развития обычно учился у моделей первичной культуры клеток. Первичные культуры клеток облегчает оценку данного типа клеток, обеспечивая контролируемой среде, свободной от посторонних переменных, которые присутствуют в естественных условиях. Хотя OL культур, полученных от крыс предоставили огромное количество понимание OL биологии, аналогичные усилия на создание OL культур от мышей был встречен с серьезными препятствиями. Разработка методов к культуре мышиных первичной ВЛ необходимо для того, чтобы воспользоваться доступными трансгенных линий мышей.

Различные способы для извлечения OPCs от грызунов ткани были описаны, начиная от neurosphere вывод, очистка дифференциальных адгезии и immunopurification 1-3. Хотя многие методы предлагают успеха, большинство из них требуют обширных раза культуры и / или дорогостоящего оборудования / реагентов. Чтобы обойти это, очищая OPCs из мышиной ткани с адаптацией метода первоначально описывается Маккарти и де Vellis 2 является предпочтительным. Этот метод включает физическое разделение OPCs от смешанной культуры глиальных основе коры новорожденных грызунов. В результате население очищенной OPC, которые могут быть дифференцированы в OL-обогащенного культуры. Такой подход является привлекательным из-за относительно короткий промежуток времени культура и ненужные требования факторы роста или immunopanning антител.

Изучая механизмы развития ПР в очищенной культуры является информативным, но он не обеспечивает наиболее физиологически соответствующую среду для оценки миелиновой оболочки образования. Сотрудничество культивирования ВЛ с нейронами придаст понимание молекулярной основы регулирующих OL-опосредованной миелинизации аксонов. Для многих OL / нейрона со-культурологи, задний корешок ганглиозных нейронов (DRGNs) оказались нейрона тип выбора. Они идеально подходят для совместной культуре с ВЛ-за их легкости добычи, минимальное количество загрязняющих клеток и образованием плотных кровати аксонов. Хотя исследования с использованием крысы / мыши myelinating xenocultures были опубликованы 4-6, метод получения таких OL / DRGN myelinating совместно культур от послеродовой мышиных тканей не было описано. Здесь мы приведем подробные описания методов, о том, как эффективно производить такие культуры, наряду с примерами ожидаемых результатов. Эти методы полезны для решения вопросов, связанных с развитием OL / myelinating функции, и являются полезным инструментом в области нейронауки.

Protocol

Этика Заявление

Мышей, используемых в этой работе были заботу в соответствии с Канадским советом по уходу животных (CCAC) руководящих принципов. Этическое одобрение для экспериментов была получена из Университета Оттавы Animal Care Комитета по номеру протокола OGH-119.

1. Dissection - неонатальная коры мыши для OPC добычи

  1. Жертва P0-P2 мыши в соответствии с ведомственным руководящим принципам.
  2. Рассеките мозга и место в чашке Петри содержащие ледяной MEM (антибиотиков).
  3. Передача блюдо, чтобы вскрытие микроскопом.
  4. Использование скальпеля с боковыми мозг спинной вверх, сделать мелкий разрез sagittally по самым медиального края каждой коры (рис. 1а). Этот разрез должен проходить только через менингеальные слой, чтобы облегчить его удаление.
  5. Использование тонкой наконечником щипцы шелушиться мозговых оболочек в боковой моды. Если все сделано аккуратно, этот слой может быть удален в одной части. Во время этого шага, удаление обонятельных луковиц.
  6. С мозга вентральной стороной вверх, сделайте глубокий надрез сагиттальной, где кора отвечает вентральной области промежуточного мозга (рис. 1b).
  7. С мозг спинной стороной вверх, отдельно от коры мозга, поддев ткань в медиальной к боковым моды (рис. 1в, с '). Удалить остатки мозговых оболочек на этот шаг.
  8. Dice каждого кора приблизительно в 4 части и аккуратно передачи 15 мл коническую трубку, содержащую 350 мкл MEM мозга мыши пер. Держите пробирку на льду, пока все мыши были обработаны.
  9. Повторите шаги 1,1-1,8 для остальных мышей.

2. Диссоциация новорожденных коры и обслуживания смешанных культурах глиальных

Примечание: введение пузырьков в клеточной суспензии следует избегать во все следующие шаги.

  1. Добавить 15 мл коническую трубку с только что расчлененный мозги 37 ° С водяной бане в течение 3 мин.
  2. Передача мозги стерильной капот культуры ткани.
  3. Осторожно пройти кубиками коры через P1000 кончика пипетки для создания более мелкие фрагменты. Стоп пипетирования раз Есть нет мозга части достаточно большой, чтобы нарушить плавное течение суспензии через кончика пипетки.
  4. Добавить 75 мкл OPC папаин раствора на мозг в конической трубе. Решение OPC папаин должны быть предварительно нагревают при 37 ° С в течение 20 минут перед использованием.
  5. Инкубируйте в 37 ° С на водяной бане 20 мин. Примерно через каждые 2 минуты, аккуратно переверните трубку для предотвращения агрегации ткани. За это время, добавляют 5 мл смешанного глиальных питательных сред для каждого поли-L-лизин (PLL) покрытием (1 мг / мл) T25 колбу (один флакон в мозг мыши), и место в 37 ° C культуре ткани инкубаторе при 8,5% СО 2.
  6. Через 20 мин, возвращение ткани подвеске стерильной капот и добавить 2 мл смешанного глиальных медиакультуры в мозг трубки. Дайте настояться в течение 10 мин при комнатной температуре, чтобы инактивации решение OPC папаин.
  7. Алиготе ткани суспензии в 5 мл трубы пластиковые. Количество трубок должно совпадать с количеством мозгов рассеченные, в результате чего около 2,5 мл на трубе.
  8. Использование стерильных пламени полированное стекло пипетки Пастера осторожно растирают ткани в каждую пробирку. Растирают сначала медленно, и постепенно увеличивать скорость как части диссоциируют. Растирают примерно в 10-15 раз, однако это число может меняться в зависимости от эффективности пищеварения.

Примечание: В-растиранием приведет к плохой диссоциация ткани, в то время как чрезмерное растиранием негативно скажется на жизнеспособности клеток. Важно, чтобы не вводить пузырьков в раствор, так как это серьезно повлиять на жизнеспособность клеток.

  1. Как только Есть никаких видимых сгустков ткани оставшиеся в суспензии, трансфер в 50 мл коническую трубку с 4 мл смешанного глиальных медиакультуры в мозг (то есть, 4 мозги = 16 мл смешанного глиальных питательных сред).
  2. Аккуратно переверните 50 мл коническую трубку и повторить для оставшихся 5 мл пробирок.
  3. Алиготе объединенных клеточной суспензии в 15 мл конические пробирки (примерно 6,5 мл на 15 мл трубки). Число 15 мл труб должны совпадать с количеством мозгов расчленены.
  4. Центрифуги трубы при 1200 оборотов в минуту (~ 300 г) в течение 5 мин.
  5. Тщательно аспирата супернатант и добавьте 1 мл теплой смешанных глиальных СМИ культуру каждые 15 мл коническую трубку.
  6. Медленно ресуспендирования гранулу P1000 наконечником пипетки, соблюдая осторожность, чтобы не вводить пузыри. Добавить клеточной суспензии из каждой пробирки с предварительно уравновешенную PLL покрытием колбы T25, оказание общего объема культуральной среды до 6 мл.
  7. Место колбы в культуре ткани инкубаторе в течение 3-4 часов, чтобы позволить клеткам прикрепляться к субстрату PLL. Выполните полное изменение средств массовой информации с помощью пипетки из средств массовой информации, и добавить 6 мл свежего смешанного глиальных питательных сред для колб. Этот шаг снимает большую часть мусоравызванные растиранием, а также способствует культуры жизнеспособность. Если OL / DRGN совместно культур желательны, обратитесь к разделу 3 настоящего протокола.
  8. После 3 дней культуры, выполняют в 2 / 3 средств массовой информации изменения, удалив 4 мл средствах массовой информации, и замене 4 мл свежего смешанного глиальных медиа культуры. На данный момент, астроцитов монослоя должно быть формирование на базе колб.
  9. На 6-й день, совершать другие 2 / 3 средств массовой информации изменения и дополнения колбы с конечной концентрации 5 мкг / мл инсулина. На данный момент, астроцитов монослоя должны быть четко видны, на вершине которой OPCs будет пролиферирующих.

3. DRGN изоляции

Примечание: Для получения OL / DRGNs совместно культур, DRGNs должны быть установлены на следующий день после смешанной глиальных поколения культуры. Оба типа культуры выращивают самостоятельно, так и комбинированные через 9-10 дней.

  1. Жертва P5-P10 мыши в соответствии с ведомственным руководящим принципам.
  2. Извлечение позвоночника, и трансфер в чистую чашку Петри.
  3. Trim прочь столько мышцы и кости от позвоночника возможно (рис. 1, г, д '), поскольку это облегчит вскрытие спинной ганглий корня (ДРГ).
  4. Передача отделаны позвоночника к новой чашки Петри вентральной стороной вверх. Использование рассечение ножницами и начиная каудально, вырезать медиально через позвоночник в продольной моде.
  5. С помощью двух пар пинцетов, мягко взломать позвоночника подвергать спинного мозга.
  6. ДРГ можно найти снизу и сбоку от спинного мозга. Использование тонкой наконечником пинцетом, осторожно удалите ДРГ, избегая при этом повреждения ганглиев (рис. 1д).
  7. Передача удалены ДРГ в буфер соль ледяной Хэнка решение (HBSS, антибиотиков) в новую чашку Петри. Прозектором должна быть направлена ​​на извлечение 40 ДРГ на мышь (рис. 1е).
  8. После ДРГ были извлечены, отделка ДРГ любой чрезмерно длинные корни (рис. 1 г, д '), чтобы минимизировать введения загрязняющих клеток в культуре (глиальные клетки, фибробласты).
  9. Передача ДРГ в 1,5 мл центрифужную пробирку, содержащую 500 мкл ледяной HBSS.
  10. Центрифуга при 1200 оборотов в минуту (~ 300 г) в течение 5 мин при 4 ° С до гранул ДРГ.
  11. Передача центрифужные пробирки для стерильных капот культуры ткани и удалить HBSS из труб.
  12. Добавить 500 мкл предварительно нагревается (20 мин при 37 ° С) DRG папаин решение, и инкубировать пробирки в 37 ° С на водяной бане 10 мин. Обратить труб каждые 2 мин, чтобы предотвратить ткани агрегации.
  13. Повторите шаг 3.10.
  14. Удалить решение DRG папаин и добавить 500 мкл предварительно нагревается (20 мин при 37 ° С) Коллагеназа решение. Инкубируйте в 37 ° С водяной бане в течение 10 минут, переворачивая каждые 2 мин.
  15. Повторите шаг 3.10.
  16. Удалить супернатант и добавьте 1 мл DRGN СМИ. Обратить трубки в несколько раз.
  17. Повторите шаг 3.10.
  18. Повторите шаг 3.16.
  19. Пальто стерильным пламенем полированного стекла с пипеткой Пастера бычьего сывороточного альбумина (БСА) с помощью пипетки раствор 0,25% BSA в HBSS в несколько раз. Покрытие раствором БСА будет препятствовать ДРГ от присоединения к стенам стеклянной пипетки.
  20. Измельченного в порошок ДРГ с BSA покрытием пипетки осторожно сначала, и с увеличением интенсивности раз сгустки начинают диссоциирующего. Растирают примерно в 10-15 раз, однако это число зависит от степени пищеварения, а число ДРГ в трубке.
  21. После диссоциации достигается, проходят суспензии через 50 мкм фильтр в стерильную чашку Петри с 7 мл DRGN СМИ. Фильтрация позволит устранить большую часть мусора из клеточной суспензии, хотя этот шаг не является критическим.
  22. Инкубировать чашки Петри на уровне 8,5% CO 2 примерно на 1,25 часа.
  23. Пальто несколько 12 мм покровные с LN2 (10 мкг / мл в PBS) в 24-луночных блюдо в течение этого времени инкубации.
  24. После инкубации закончен, наблюдать чашке Петри при ярком поле. DRGNs определены как большие здоровые, фаза темных клеток. Swirl чашке Петри осторожно, чтобы снять любые придерживался DRGNs.

Примечание: Многие загрязняющие клетки будут сильно привязаны к чашке Петри, обогащая тем самым ваш клеточной суспензии для DRGNs.

  1. Передача клеточной суспензии в 15 мл коническую трубку. Осторожно промыть посуду с 4 мл DRGN средств информации собирать любые остаточные DRGNs. Передача дополнительных 4 мл в коническую трубку.
  2. Центрифуга в течение 5 мин при 1200 оборотов в минуту (~ 300 г).
  3. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок в 500 мкл свежей среды DRGN.
  4. Подсчитать количество дали DRGNs использованием гемоцитометра. Будьте уверены, чтобы рассчитывать только DRGNs, а не другие типы клеток. DRGNs можно определить по их больших сферических тел клетки.
  5. Семенной 30,000-50,000 DRGNs каждому LN2 покрытием покровное в 1 мл DRGN средства массовой информации, и места в 37 ° C культуре ткани инкубатор на 8,5% CO 2 за одну ночь.
  6. Следующим утром, выполните полное изменение средств массовой информации, заменив DRGNсредах с OL СМИ (минус CNTF) с конечной концентрации 1% Pen / Strep и 10 мкМ ФУДР.
  7. О днях 3 и 5, выполнить изменения 3 / 4 средств массовой информации с тем же СМИ, как в шаге 3.30.
  8. На 7 день, выполните полное изменение сред с OL СМИ (минус CNTF, Пен / Strep, ФУДР).
  9. В День 9, DRGNs должны сформировали обширную кровать аксонов, и теперь готов к совместной культивировали с OPCs.

4. Очистка OPCs из смешанных глиальных культур для создания OL-обогащенной культурами или OL / DRGN совместно культур

  1. В День 9 из смешанных глиальные культуры, передача колб для орбитальный шейкер в 5% CO 2 культуре ткани инкубатора. Место колбы на вершине пустой колбы T25, чтобы предотвратить любое тепло, возникающее при орбитальном шейкере с отрицательно сказывается смешанных глиальных культурах. Разрешить культур, чтобы уравновесить к этому новому инкубаторе в течение 1 часа.
  2. После колбы имеют уравновешенный, встряхните колбы на 50 оборотов в минуту в течение 45 мин. Цель этого дрожания для удаления свободно присоединенными загрязняющих клетки монослоя.
  3. Перемещение ячеек на капот культуры ткани и удалить все СМИ из фляги. Заменить на 4 мл свежей смешанных глиальных питательных сред с добавлением 5 мкг / мл инсулина.
  4. Место колбы обратно на шейкере, и позволить, чтобы уравновесить в течение примерно 3 часов.
  5. После колбы уравновешенной, закрепить их надежно орбитальный шейкер, и встряхнуть колбы в течение примерно 16 часов при 220 оборотов в минуту (на ночь).
  6. Следующим утром, если ВЛ должны быть выращены в отсутствии DRGNs (то есть, OL-обогащенного культуры), пальто несколько стерильных 12 мм покровные с LN2 (10 мкг / мл в PBS) в течение 1 часа. Передача покровные до 24-и посуду, стирать с PBS следуют OL мыть средствами массовой информации. Добавить 1 мл OL СМИ в каждую лунку и равновесие на уровне 8,5% CO 2.
  7. Уравновешивать 10 см блюда культуры тканей на уровне 5% CO 2 в течение 30 мин. Один блюдо будет необходимо на каждые 2 колбы. Они будут использованы для дифференциальной адгезии обогащение приостановлено OPCs.
  8. После 30 минут уравновешивания период прошел, передача информации из потрясен колбы к блюдам. Каждое блюдо должно получать средства массовой информации от 2 колбы, равная примерно 8 мл клеточной суспензии на 10 см блюдо.
  9. Инкубируйте блюда в 5% CO 2 в течение 30 мин, обеспечивая при этом нежный толчок в 15 мин марки. Этот толчок поможет предотвратить OPCs от присоединения к 10 см блюдо.
  10. После инкубации завершения изучения блюд при ярком поле. OPCs определяются как небольшие пряди ячейки, как правило, из 3-5 клеток, но иногда образуют крупные агрегаты напоминающие нейросферы. Многие не-ПР клетки линии должны быть накрепко привязанным к базе пластины. Аккуратно водоворот пластин отделить любой свободно придерживаться OPCs и передачи клеточной суспензии из каждой пластины в 15 мл коническую трубку.
  11. Центрифуга при 1200 оборотов в минуту (~ 300 г) в течение 5 мин.
  12. Ресуспендируют гранул в 1 мл OL сред с P1000 пипетки, после ресуспендирования с P200 кончиком пипетки.
  13. Граф клеток с использованием гемоцитометра.
  14. Для обогащенного-ПР культур, семян 25000 - 50000 OPCs на каждые 12 мм LN2 покрытием покровное в конечном объеме 1 мл OL СМИ.
  15. Для OL / DRGN совместно культур, выполните полную OL СМИ (минус CNTF) изменений на DRGNs из секции [3], и осторожно добавить 50000 клеток от OPC-обогащенного клеточной суспензии. Будьте осторожны, чтобы не нарушать постельный DRGN нейритов во время добавления OPCs.
  16. Место культуры в 37 ° С инкубатор на 8,5% CO 2, и избежать удаления до фиксации. Мышей OPCs чувствительны к изменениям рН, и удаления из инкубатора изменит рН OL СМИ. Также следует отметить, добавление дН 2 O в пустой скважины окружающих культурах клеток предотвращает испарение культуру средств массовой информации, что позволяет минимизировать колебания концентрации растворенных веществ внутри ПР СМИ. Это обеспечит более согласованную среду для OPCs.

5. Обработка культур для микроскопии иммунофлуоресценции

  1. Fix культур с 100% метаноле при -20 ° С в течение 10 мин, или 3% параформальдегида при комнатной температуре в течение 15 мин.
  2. Permeabilize покровные с 0,1% Triton-X-100 в течение 10 мин, смойте с фосфатным буфером блок физиологический раствор (PBS) и в течение 1 часа в 10% козьего сыворотки.
  3. Инкубируйте покровные с первичными антителами разбавленный в блокировании решения ночи при 4 ° C.
  4. Вымойте покровные 3 раза PBS, и инкубировать с Alexa Fluor-сопряженных вторичными антителами (Invitrogen) разводят в блокировании решения в течение 45 мин.
  5. Контрастирующая с 4 ',6-diamidino-2-фенилиндола (DAPI) и промойте покровные несколько раз PBS.
  6. Горы в покровных DAKO флуоресцентные монтажа среды.
  7. Анализ слайды с помощью иммунофлюоресценции микроскопии. В этом протоколе, слайды были проанализированы либо с Zeiss Axiovert 200M перевернутой флуоресценциимикроскопа или Zeiss LSM 510 META лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.

6. Всего добыча белки клетки от OL-обогащенного культур

  1. Удалить 24-луночных культуры из инкубатора и прохладной на льду в течение 3 мин.
  2. Осторожно удалите средства массовой информации, и добавить 10-20 мкл лизирующего буфера (50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 0,1% SDS, 0,5% натрия дезоксихолата, 1% Triton-X-100, с 0,1% пепстатина, апротинин, PMSF, leupeptin, ортованадата натрия) в каждую лунку (не менее 8 скважин на образец предлагается).
  3. Очистите скважин с использованием широким отверстием P1000 пипетки и передачи лизат в 1,5 трубки центрифуги мл.
  4. Pass лизат через 30 ½ калибра шприц примерно в 15 раз, и холод на льду в течение 30 мин.
  5. Пробирки центрифужные при 14000 оборотов в минуту (~ 20000 г) в течение 15 мин при 4 ° C.
  6. Передача супернатант новые трубы центрифуги, и хранить при температуре -80 ° C.

7. SDS-PAGE анализа на обогащенных-ПР культуры белка

  1. Решение 30 мкг белка в образце в снижении буфер SDS-PAGE на стандартных 12% поли-акриламид гели.
  2. Полусухой передачи гели на мембраны ПВДФ.
  3. Блок мембраны в течение 1 часа в 5% обезжиренного сухого молока в TBST (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 150 мМ NaCl, 0,1% Твин-20).
  4. Инкубируйте мембран с первичными антителами разбавленный в блокировании решения в течение 1 часа.
  5. Вымойте мембраны 3 раза TBST течение 10 мин.
  6. Инкубируйте мембран с HRP-сопряженных вторичными антителами в течение 45 минут в блокировании решения.
  7. Вымойте мембран несколько раз TBST, и инкубировать с Amersham ECL Plus западных промокательной обнаружения реагента (GE Healthcare) в течение 5 мин.
  8. Обнаружение белка полосы со стандартными научный фильм изображений.

8. Представитель Результаты:

В этом протоколе OPCs будут расширены на астроциты монослоя в рамках смешанной глиальные культуры. Это смешанная глиальных культуры происходит от P0-P2 новорожденных коры мыши. На 1-й день в пробирке (div1), смешанные глиальные культуры содержит клетки с различной морфологией с точки зрения фазового контраста микроскопии (рис. 2а). На div3, астроцитов монослоя начинает формироваться на базе колбу, и в div8, OPCs можно четко наблюдать на поверхности монослоя. На DIV9, пролиферирующих OPCs достигли достаточной плотности, чтобы быть очищен ночь высокоскоростных орбитальную встряхивания. После процесса очистки была завершена, в результате OPC-обогащенного клеточной популяции. На div1 с должностями очистки, OPCs имеют простой морфологии, расширяя несколько процессов (рис. 2б). На div3 сообщение очистки, клетки расширили комплекс сети из процессов, напоминающих незрелые ВЛ. На DIV6 сообщение очистки, очищенный ВЛ имеют плоские и прогнозируемых листовки типа мембранных структур. Это морфологическое развитие характерно в пробирке созревание ВЛ.

Иммунофлуоресценции микроскопии указывает очищенные клетки в OL-линии (рис. 3а). Сеяные OPCs сначала выразить хондроитин сульфат протеогликаны (NG2), и развиваться в миелин-связанный гликопротеин (МАГ) положительные незрелых ВЛ в ​​течение трех дней после посева (рис. 3б). На DIV6, многие ВЛ выразить основному белку миелина (ОБМ), и обладают типичным зрелым OL морфологии. Процент OL-линии клетки количественно в различные моменты времени, чтобы определить чистоту OL-обогащенной культурами (рис. 3в). На div1 сообщение очищения, культуры 50 ± 14% NG2 OPCs положительному, без каких-ве MAG + или MBP Положительный ВЛ. Это означает, очищенный OL-линии клетки находятся в стадии предшественников при посеве времени, с незначительным числом дифференцированных ВЛ. На div3, многие ВЛ дифференцировались в MAG Положительный клетках (24 ± 5,9%), а некоторые сохраняют предшественником фенотип, и остаются NG2 + (13 ± 8,0%). На div3, небольшая часть MAG Положительный клеток (3,2 1,2%), также выразив MBP. На DIV6, 20 ± 5,9% от ВЛ являются MAG Положительный то время как 12 ± 7,3% сохранится как NG2 Положительный OPCs. Кроме того, 21 ± 9,3% клеток в культуре MBP Положительный ВЛ в это время точка. SDS-PAGE анализ показывает, градуированных выражение 2'3'-циклических нуклеотидов 3'-фосфодиэстеразы (CNP) и MBP течение 6 дней культуры периода, далее демонстрируя способность OPCs в культуре неизлечимо дифференцироваться в зрелые ВЛ (рис. 3d ). В совокупности эти данные устанавливает этот метод как средство производства OL-обогащенный культурой систему, пригодную для изучения OL созревания от OPCs.

Этот протокол также описывает методы создания OL / DRGN совместного использования культур мышиных только источники ткани. Однако, для того, чтобы произвести со-культуры, DRGNs должны сначала быть культурными только, чтобы произвести достаточно разветвленная сеть аксонов. Эти послеродовой мышиной культурах нейронов выращивают в течение 9 дней в странах с низким сыворотки среде с 10 добавок ФУДР мкМ для предотвращения распространения загрязнения фибробластов и GL IAL клеток. В течение 9 дней в лабораторных условиях, изолированных DRGNs производить плотные кровать аксонов (рис. 4а). Это нейритов кровать иммунопозитивных для нейронов нейрофиламентов маркеров 200 (NF) и Tuj1 (рис. 4б). На данный момент, очищенный OPCs могут быть добавлены к нейритов кровати, и культивировали в течение еще 6 дней, чтобы произвести myelinating совместно культур.

На DIV6 О. Л. / DRGN совместно культуры, многие MBP Положительный ВЛ можно наблюдать среди NF Положительный нейритов DRGN (рис. 5а). При ближайшем рассмотрении, ВЛ являются свидетельством вступить в контакт с многочисленными нейритов DRGN, часто вкладывающийся их MBP + ве мембраны (рис. 5, б, в).

Рисунок 1
Рисунок 1. Препарирование микроскоп изображений отдельных аспектов новорожденных мышей коры и DRG изоляции. () Спинной зрения только что извлеченные неонатального мозга мыши. Пунктирные линии показывают области, где разрезы должны быть сделаны, чтобы облегчить удаление менингеальные слоя. (Б) вид снизу головного мозга, пунктирные линии показывают области, где кора отвечает вентральной промежуточного мозга. Глубокие разрезы должны быть сделаны по пунктирным линиям, чтобы помочь изоляции коры. (С-с ') визуальной информации о том, как вырвать коры от остальной части мозга. (Г) свежевыделенных P5-P10 мыши позвоночника до обрезки излишки мышц и костей (D '). (е) Расположение ДРГ в позвоночнике. (е) приблизительное количество ДРГ, которые должны быть изолированы друг от мыши. (г) DRG с длинными корнями, которые требуют обрезка до ферментативного пищеварения. Пунктирная линия указывает на область, где корни должны быть сокращены. (Д ') DRG сообщение корневой обрезки.

Рисунок 2
Рисунок 2. OPCs будут расширены в рамках смешанной глиальные культуры, очищают, а затем дифференцируются OL-обогащенного культуры. (А) этап контрастные изображения смешанного глиальных культурах на различных стадиях развития. На div1, клетки появляются круглые с несколькими уплощенных клеток. Стратификация смешанных глиальные культуры начинается в div3, где астроцитов образуют единую монослоя в основании колбы, на котором OPCs размножаться. Многие OPCs видны на div8 (стрелки) присоединилась к поверхности астроцитов монослоя. (Б) Как только очищенный от смешанных глиальные культуры, div1 OPCs распространили лишь несколько процессов. На div3, клетки распространились многие процессы, напоминающие промежуточной стадии ВЛ. На DIV6, сплющенные ВЛ (звездочка), похоже, производятся мембранных листов (пунктирная линия). Шкала баров, 50 мкм.

Рисунок 3
Рисунок 3. Характеристика OL-обогащенного культуры. () Конфокальной изображения изолированных ВЛ на разных стадиях развития. NG2 Положительный OPCs имеют простую морфологию, тогда как MAG ВЛ Положительный обладают несколькими arborous процессов. MBP Положительный ВЛ расширили мембранных миелин-подобных листов. Шкала бар, 50 мкм. (Б) чистый OL-линии клетки возникают как OPCs и дифференцируются в MAG + В.Е., ВЛ MBP + ве более 6 DIV. На div1, все OPCs являются NG2 Положительный, в то время ни один из них MAG положительному или MBP + ве. На div3, MAG положительные и несколько MBP ВЛ Положительный теперь очевидна. Большинство ВЛ являются MAG и MBP + ве на DIV6, с немногих оставшихся NG2 Положительный OPCs. Шкала бар, 100 мкм. (С) средние значения ± стандартное отклонение от процентов OL-линии клеток на разных стадиях развития в течение 6 DIV. На div1, все OL-линии клетки NG2 положительному, что составляет 50 ± 14% от общего числа клеток в культуре. На div3 и DIV6, OL-клетки линии соответственно составляет 36 ± 6,8% и 32 ± 8,4% от общего числа клеток, состоящий из различных пропорциях NG2 положительному, MAG положительные и MBP Положительный ВЛ. (Г) SDS-PAGE осуществляется на белка, полученного из обогащенного OL-культуры демонстрируют градуированных выражение OL-маркеры CNP и MBP более 6 период культуры DIV.

Рисунок 4
Рисунок 4. Характеристика культуры DRGN предварительно OPC посева. () Фазового контраста изображения DRGNs за 9 DIV культуры предвыборный период OPC посева. DRGNs возникают как большие здоровые клетки с несколько процессов, и производить более сложные нейритов сети. Шкала бар, 100 мкм. (Б) конфокальной образы DRGN культур зафиксирована на DIV9 (до OPC посева) и окрашивали на нейрон-специфических маркеров Tuj1 и NF200. DRGNs дали нейритов сети, на которых OPCs может быть заполнена на производство OL / DRGN myelinating совместно культур. Шкала бар, 50 мкм.

ЛОР "> Рисунок 5
Рисунок 5. ВЛ совместно культивировали с DRGNs привести к OL-опосредованной упаковки DRGN нейритов с MBP + ве мембраны. () 4-полевой конфокальной изображение монтаж DIV6 OL / DRGN совместно культуры. Многие MBP Положительный ВЛ можно увидеть взаимодействия с основной кровати нейритов DRGN. Шкала бар, 100 мкм. (Б) увеличенное конфокальной зрения MBP Положительный ВЛ упаковки нескольких нейритов DRGN. Шкала бар, 50 мкм. (С) Цифровое увеличение региона, обозначенного в (б), где DRGN аксонов в настоящее время завернутый с О. Л. мембраны. Шкала бар, 25 мкм.

Discussion

В настоящем докладе описывается метод выделения мышиных OPCs для дифференциации OL-обогащенного культур или OL / DRGN совместно культур. При культивировании в одиночку, OPCs дифференцироваться в MBP Положительный ВЛ, производить миелин-подобных мембранных листов. При добавлении к DRGN нейритов кровати, ВЛ окутывать DRGN нейритов с MBP + ве мембраны. Эта модель преимущества исследование комплекса основы руководящий OL-опосредованного аксонального ensheathment.

Хотя большую ценность, создание такой культуры является технически сложным. В частности, требуя аспекты включают в себя эффективное пищеварение ткани / диссоциации, обеспечение сбалансированной рН культуральной среды, а также средств массовой информации DRGN изменения. Важно учитывать, что длина пищеварения, количество ткани переваривается и количество растиранием влияет на эффективность и конечный результат ткани диссоциации. Это не является необычным для опытных исследователей для получения низких сотовой выходы из диссоциированных нервной ткани системы. Кроме того, мышиные OPCs, как правило, чувствительны к изменению рН культуральной среды, особенно в щелочных условиях. Поддержание культур на уровне 8,5% CO 2 направлена ​​на предотвращение этого, так как OPCs видимому, лучше терпеть слегка кислой среде над основными. Что касается кормления DRGNs, средства массовой информации изменения должны быть выполнены быстро, чтобы не пересушивает нейронов, однако, должны быть нежными, чтобы не нарушить развивающихся нейритов постели. Резкие изменения информации могут выбить нейритов кровать от субстрата, и, вероятно, привести к его полной диссоциации с покровным.

Потенциальные достоинства этой модели система значительно затмевает ее технически сложных природы. Одно из преимуществ этой системы является использование послеродовых мышей для сотовых выводе культуры, в обход необходимости жертвовать размножающихся самок собрать эмбриональной ткани. Еще одним преимуществом является отсутствие потребности в ростовых факторов (GFS) для расширения OPCs. Смешанные глиальных культурах обеспечить условия, способствующие распространению OPCs, предположительно, из-за присутствия астроцитов происхождения трофических факторов. Другие методы, такие как вывод через нейросферы 7,8, полагаться на митогенных свойства GFs, таких как основной фактор роста фибробластов (bFGF), эпидермальный фактор роста (EGF) и тромбоцитарный фактор роста (PDGF) для расширения OPC. Аналогично, используя послеродовой (С-5-10) для мышей DRGNs избегает требование пополнения питательных сред с фактор роста нервов (ФРН), нейротрофических факторов, необходимых для выживания в пробирке эмбриональных DRGNs 9, 10. Интересно, чтобы избежать использования NGF как это отрицательно влияет на myelinating мощностью ВЛ при культивировании с DRGNs 4. Отказ от использования GF-дополнены СМИ также имеет экономические преимущества, так как эти реагенты стать дорогостоящим при использовании на больших масштабах.

Возможно, наиболее важным преимуществом этой культуры модели является ее происхождение от мыши только ткани, тем самым обеспечивая возможности для получения как фотобарабанов и DRGNs из различных трансгенных линий мышей. Это дает возможность изучения как DRGN и / или OPC-определенные свойства, которые управляют миелинизации. Это будет особенно важно для выяснения рецептор / лиганд регулирующих OL-опосредованной миелинизации аксонов. В целом, этот метод имеет большое значение по отношению к неврологии исследования из-за ее приложения к пониманию молекулярных сигналов основной миелинизации.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Этот проект был профинансирован за счет гранта от нескольких общества рассеянного склероза Канады RKRWO является получателем Студенчество из нескольких общества рассеянного склероза Канады. SDR является получателем пост-докторские стипендии от нескольких общества рассеянного склероза в Канаде и канадских институтов исследований в области здравоохранения.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Multicell 319-005-CL
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Invitrogen 14170-112
Minimum Essential Media (MEM) GIBCO, by Life Technologies 12360-038
Fetal Bovine Serum (FBS) GIBCO, by Life Technologies 10091-148
Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) GIBCO, by Life Technologies 15140-122
GlutaMAX Invitrogen 35050-061
Poly-l-lysine Sigma-Aldrich P2636
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503
Human merosin purified protein (LN2) EMD Millipore CC085
Recombinant rat ciliary neurotrophic factor (CNTF) PeproTech Inc 450-50
L-thyroxine Biochemika 89430
Holo-transferrin Sigma-Aldrich T0665
B27 supplement GIBCO, by Life Technologies 0080085-SA
Bovine insulin Sigma-Aldrich I6634
3,3',5-Triiodo-L-thyronine Sigma-Aldrich I6634
Progesterone Sigma-Aldrich P8783
Putrescine Sigma-Aldrich P7505
Sodium Selenite Sigma-Aldrich S5261
5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FuDR) Sigma-Aldrich F0503
Papain solution Worthington Biochemical LS003126
DNaseI Roche Group 1010159001
L-cysteine Sigma-Aldrich C7352
24-well tissue culture dishes Cellstar 662-160
T25-tissue culture flasks with vent cap Corning 430639
10 cm tissue culture dishes Corning 430167
10 cm petri dish Fisher Scientific 0875713
Collagenase A Roche Group 103578
CellTrics 50 μm filter (optional) PARTEC 04-004-2327
Myelin Basic Protein (MBP) Antibody AbD Serotec MCA409S
NG2 antibody EMD Millipore AB5320
Myelin-Associated Glycoprotein (MAG) antibody EMD Millipore MAB1567
2',3'-Cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNP) antibody Covance SMI-91R-100
Actin pan Ab-5 antibody Fitzgerald 10R-A106AX
Neurofilament-200 (NF) antibody Sigma-Aldrich N4142
Tubulin beta-3 chain (Tuj1) antibody EMD Millipore MAB5544
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11008
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A21422
Alexa Fluor 647 goat anti-rat (IgG) (H+L) secondary antibody Invitrogen A21247
Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody Bio-Rad 170-6516
Goat anti-rat IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-2065
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542

Media Recipes

100X OL-Supplement*

IngredientAmount to add
DMEM100 mL
BSA1.02 g
Progesterone0.6 mg
Putrescine161 mg
Sodium Selenite0.05 mg
3,3',5-Triiodo-L-thyronine4 mg

*Store at -80 °C in 250 μL aliquots

OL media

IngredientAmount to add
DMEM23.75 mL
100X OL-Supplement250 μL
Bovine insulin (from 1 mg/mL stock)125 μL
GlutaMAX250 μL
Holo-transferrin (from 33 mg/mL stock)37.5 μL
B27 Supplement500 μL
FBS125 μL
CNTF (from 50 ng/μL stock)25 μL

Mixed glial culture media (made up in DMEM)

IngredientFinal concentration
FBS10%
Pen/Strep (0.33% from stock)33 units/mL Penicillin and 33 μg/mL Streptomycin
GlutaMAX1%

DRGN media (made up in DMEM)

IngredientFinal concentration
FBS10%
Pen/Strep (1% from stock)100 units/mL Penicillin and 100 μg/mL Streptomycin

Digestion Solution Recipes:

OPC papain solution (made up in MEM)

IngredientFinal concentration
Papain solution1.54 mg/mL
L-cysteine360 μg/mL
DNaseI60 μg/mL

DRG papain solution (made up in HBSS)

IngredientFinal concentration
Papain1.54 mg/mL
L-cysteine360 μg/mL

DRG Collagenase A solution (made up in HBSS)

IngredientFinal concentration
Collagenase A4 mg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Avellana-Adalid, V. Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential. J Neurosci Res. 45, 558-570 (1996).
  2. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
  3. Barres, B. A. Cell death and control of cell survival in the oligodendrocyte lineage. Cell. 70, 31-46 (1992).
  4. Chan, J. R. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43, 183-1891 (2004).
  5. Camara, J. Integrin-mediated axoglial interactions initiate myelination in the central nervous system. J Cell Biol. 185, 699-712 (2009).
  6. Ishibashi, T. Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses. Neuron. 49, 823-832 (2006).
  7. Chen, Y. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat Protoc. 2, 1044-1051 (2007).
  8. Pedraza, C. E. Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors. Glia. 56, 1339-1352 (2008).
  9. Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors. J Neurosci. 12, 1896-1905 (1992).
  10. Greene, L. A. Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons. Dev Biol. 58, 106-113 (1977).

Comments

46 Comments

  1. very nice video and presentation....

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 28, 2011 - 12:44 PM
  2. Nice explanation. I have been carrying out this procedure for some time now and find that it works quite well.

    How many OPCs you generally obtain from a single mouse brain?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 26, 2012 - 4:35 PM
  3. Hi - thanks for your comment, typically I yield about ²00,000 OPCs per mouse brain (on average).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 1:04 AM
  4. Excellent. I am using B6 mice, usually P4-5 (because we also take cerebellar neurons from these same pups). I usually yield between 100-130,000 cells/brain. I see some differences in our protocols (I seed three brains/T75, use trypsin instead of papain, etc.). What steps have you found to dramatically increase your OPC yield post shake-off?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 12:17 PM
  5. The largest factor in OPC yield is the efficiency of your digestion (ie. minimal cell death). In addition, the age of the mice from which you isolate the mixed glial cultures is a factor. I think if you go too far past P², many OPCs will be postmitotic, and therefore limit their proliferation capacity. I usually try to go as young as possible (P0) as this seems to work best. If you absolutely need to use P4-P5, maybe try to culture your monolayers longer than 9 days - try waiting ² weeks prior to shake off. Hope this helps - RO

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 1:06 PM
  6. Thanks for the great info. That is interesting, as many of the protocols for the "DeVellis-method" use different enzymatic preparations (trypsin +/- EDTA, +/- DNAase, papain, etc.). I had basically adapted my rat OPC protocol for mice, but am realizing that they are just not the same. I will trip your papain method and let you know how things pan out. Also, is there a reason you use T²5 flasks instead of combining brains into a T75?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 4:55 PM
  7. No there is no specific reason for using T²5, simply this is what I have always been using. I would imagine combining 3 mice into a T75 flask would roughly be the same thing. Good Luck!

    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 12:00 PM
  8. Hi Ryan, nice video and explanation. Do you do lectin panning to further get rid of microglia or do you find that a 30 min incubation at 37 degrees is enough? Also, how do you know cells are ready to shake? are they always ready at day 9? what do you look for specifically?
    thank you

    Reply
    Posted by: luisa t.
    April 10, 2013 - 12:39 PM
  9. hello...I have gone through this video...very nicely presented...but I have one doubt that if I put the flasks on shaker which only maintains temp and speed but not CO² level, the pH will change...would it not allow the OPCs to survive at all??? and can I use HEPES in medium to solve this problem???
    M willingly waiting for your reply....

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 4, 2012 - 12:35 PM
  10. Thank you for your comment, you are correct in that it will not work without CO² buffering. HEPES buffer will likely not solve this problem either. I'm afraid you will absolutely need to have CO² buffering for this isolation to work.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 11:56 AM
  11. Hi, very INFORMATIVE video, I zalak parikh working on glial cells. In your protocol you are not using any filter after papain digestion but I am facing one problem of Fibroblasts contamination. What could be the possible solution for this problem?
    thank you
    Zalak.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 24, 2012 - 7:59 AM
  12. Hi Zalak, thanks for your comment. What glial cell type are you trying to culture? Oligodendrocytes, astrocytes or microglia? I have never experienced fibroblast contamination.. are you sure they are fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 24, 2012 - 10:47 AM
  13. Hi there. Excellent video, very informative. I was just wondering if you can incubate the flasks in 5% CO² instead of 8% CO²?
    Thanks
    Matt

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 11, 2012 - 12:48 PM
  14. Hi Matt, Actually no, you need to have these at at least 8.5% CO² - otherwise you will have trouble establishing your mixed glial cultures - Good luck

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 11, 2012 - 10:22 PM
  15. Hi Ryan. Very nice video and presentation.
    I have to establish a DRG neuronal culture. Majority of all the papers I've read are using a embryonic source of DRG unlike you using post-natal mouse. What do you think will be the major difference between the cultures of the two??

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 1, 2012 - 12:23 PM
  16. Hi Lipi,
    You're right most papers use embryonic DRGs. The benefit of using post-natal DRGs is that you don't have to sacrifice the mother, and if you use P5-P10 mice, there is no need to use nerve growth factor (in my hands). Embryonic DRG neurons require NGF supplementation to the media for their survival. In terms of the difference between cultures, embryonic dervied ones may have a bit more contaminating cells, since I find they divide pretty quickly. Otherwise I imagine they would be the same as post-natal derived cultures. Good luck!

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    October 1, 2012 - 4:37 PM
  17. Thank you Ryan.

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 3, 2012 - 2:39 AM
  18. Thank you Ryan.

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 3, 2012 - 2:51 AM
  19. Great article Ryan. I had a question for you. Our lab generates mixed glial cell cultures by isolating NPCs from P1 mouse pup brains,expanding the NPCs via neurospheres in the presence of GFs, and then plating the spheres on matrigel for subsequent differentiation without GFs. My main goal in using the neurosphere protocol is to obtain OPCs, but I routinely get only ²0-30% O1+ OPCs following 8 days of differentiation on matrigel. GFAP+ astrocytes seem to dominate the whole culture, with OPCs growing on top of them. I wanted to try to incorporate your protocol into the neurosphere protocol by dissociating the spheres using TrypLE or Accutase, plating them on Poly-D-Lysine, letting the astrocytes grow to confluency while having OPCs proliferate on top, and then use the shaking technique to isolate OPCs. Do you think this is possible? When we perform in vitro studies with the NPCs, we usually plate the neurospheres on matrigel for a day and then trypsinize the cells for seeding into new dishes. Not only do I think the trypsin digest kills many OPCs, but I also remove astrocytes from the matrigel that then contaminate my cultures. Thanks for the help!

    Reply
    Posted by: Brett M.
    November 3, 2012 - 7:37 PM
  20. Hi Brett - To answer your question, yes I think it would be possible to do what you are suggesting. However, it seems to be a pretty roundabout approach. I think the more streamlined approach would be to simply seed your dissociated P1 neural cells onto PLL substrate to generate a monolayer. That way you would avoid having to generate neurospheres (which I imagine takes about 10 days) and then subsequently generating an astrocyte monolayer with the spheres (which would take another 10+ days). In my experience, OPCs don't like trypsin. If you wanted, you could try 0.05% Trypsin instead of 0.²5% and that seems to be more gentle. And if you don't incubate for too long, most astrocytes should remain on the plate. Hope this helps! -Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    November 5, 2012 - 12:14 PM
  21. Ryan, thanks for the help! I tried your protocol and everything appeared to go well. However, one issue I ran into occurred during the overnight shaking step and subsequent differential adhesion assay to isolate a more pure population of OPCs. What I noticed was that after the overnight shaking I had many large oligospheres (maybe 10-²0 cells in size). These spheres did not stick down during the 30 minute plate incubation and I had difficulties trying to dissociate them as you described using the P1000 and P²00 tips. When I took the cells counts and plated the cells onto chamber slides, many smaller clumps remained and stuck down to the matrix. However, the clumps did not flatten out on the gel matrix very well (like neurospheres do) and eventually flaked off after about 5 days of cultures, leaving only sparse population of OPCs. Have you ever encountered this problem? I was thinking of seeding at a higher cells density than what you describe in the protocol.

    Reply
    Posted by: Brett M.
    December 2, 2012 - 10:21 PM
  22. Hi Brett - sounds like you're doing everything right. Normally I see lots of these "oligospheres" as a result of the overnight shaking protocol. However, I find that these are not the majority of OPCs, as there are many single cells and cells in clumps of ²-4. The oligospheres are difficult to dissociate, and due to this, I generally do not go out of my way to try and break them up. In my hands, these spheres spread out very nicely after about ²4hrs on Laminin-² substrate. You can try to seed at higher densities if you like, but the seeding density should be determined based on the experiment you want to conduct. For example, if you want to perform immunocytochemistry, it may not be ideal to have a very dense cell culture. Also, it's possible the clumps aren't super compatible with your matrix substrate - I always use Laminin. I hope this helps :)

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    December 3, 2012 - 11:42 AM
  23. HI Ryan, very informative and nice presentation. I have tried your protocol and everything seem to work fine except at the overnight shaking. There were very few OPCs isolated and it seems there are still many OPCs adhere to the astrocytes. Have you encounter this issue?

    Reply
    Posted by: Esther W.
    December 13, 2012 - 3:25 AM
  24. Hi Esther, Thanks for your comment. How many OPCs are you yielding per mouse? I usually yield on average ²00,000 OPCs per mouse brain, but this is quite variable. At times I have yielded 500,000 or 50,000 per brain, and I'm not sure what accounts for this variability. In any case, you will never dissociate 100% of the OPCs from the monolayer, I've noticed a lot remain stuck. My advice would be to simply give it another shot and see if your yields are a bit higher next time. Hope this helps - RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    December 16, 2012 - 5:35 PM
  25. Thanks Ryan for your advice. My yield is definitely much lower than yours. I will definitely try another round. :)

    Reply
    Posted by: Esther W.
    December 16, 2012 - 8:24 PM
  26. HI Ryan, I face the problem of getting immature OPC instead of mature OPC after 6 days of OL-enriched culture. What is your view?

    Reply
    Posted by: Esther W.
    January 23, 2013 - 2:51 AM
  27. Hi Esther, you should always expect to have some OPCs that don't differentiate during the timecourse. However, the majority of OLs should at least be expressing MAG, if not MBP at DIV6. My guess would be that your media is not exactly correct. Make sure that all the ingredients are at the correct concentration in your 100x OL-supplement stock - especially tri-iodothyronine and L-thyroxine (4mg per 100mL). I hope this helps, let me know if you still have problems.

    Posted by: Ryan O.
    January 23, 2013 - 12:56 PM
  28. Thanks Ryan for replying. I have added tri-iodothyronine only as there is no mentioned of L-thyronine in the 100x OL-supp recipe. Can i still add L-thyronine when the OL-enriched is on DIV5?

    Posted by: Esther W.
    January 23, 2013 - 8:05 PM
  29. Thanks for notifying me of this mistake, I'll notify the editorial team ASAP. Yes you can try to add it on DIV5, but no guarantees this will drive them any farther since they are aleady 5 days in. Give the protocol a second try, and let me know if the lack of differentiation still occurs. -Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    January 24, 2013 - 12:47 AM
  30. Hi Luisa thanks for your comment :) I don't do lectin panning, as I find that incubation on the culture plates is enough to get rid of most of them, but if you're having a problem with microglia that is an additional option. I usually shake on day 9, but I've found you can shake anywhere from 9 to 1² days, but any longer than that you will get less OPCs. Generally if you see a lot of cells on top of the astrocyte monolayer, they are ready to go. However in my experience this dŒsn't really happen before day 9. Hope this helps RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    April 10, 2013 - 2:28 PM
  31. Hi Ryan.Thanks for this protocol. I did exactly what you have described in this protocol, except the shaking step. I did it without CO2, but the caps are tightly sealed, how is it possible that CO2 will effect pH of tightly sealed flask? My yield was very low, besides I had fibroblast contamination as well. I used uncoated flasks as well, because once during the shaking all the layer came off the bottom of the flask, what do you think would be the reason for this?.And in my experience when FBS is used in OPC culture media it made OPC's to differentiate to astrocytes rather then oligodendrocytes.Overall I couldnt replicate this procedure unfortunately and trying to find other methods..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 20, 2014 - 5:33 PM
  32. Hi Aysel - from what you describe in your message, you didn't follow my protocol.

    1) So you didn't shake the flasks? Or you didn't use the same method of shaking?

    2) As far as I know, all standard tissue culture incubators have some level of CO2 buffering (usually 5%). Strictly speaking, if you tighten the cap of your flasks, there will be no gas exchange between the incubator and the flask, if you are using plugged caps. I use vent-capped flasks (0.22um pore), so gas exchange occurs between the flask and the incubator when the caps are tight. To answer your question, CO2 buffering will have little-to-no effect on the pH of the media if you are using tightly-screwed plugged flask caps.

    3) I haven't experienced fibroblast contamination in my cultures, I imagine this would be a dissection issue. The only source of fibroblasts I can imagine would be from the meninges, so be sure to fully remove this prior to dissociation of the cortex. Unless you are confusing fibroblasts for astrocytes. Too many astrocytes is a result of too much agitation at the differential adhesion step.

    4) I have always used coated flasks, in my experience OPCs will not adhere to uncoated surfaces. I am willing to bet you'll get almost no OPCs if you continue to use uncoated flasks. If you want you can try to use other substrates such as PDL, poly-O-ornithine, collagen etc.

    5) I haven't noticed any significant transformation of OPCs into astrocytes in the presence of FBS. I imagine this might occur more frequently in immortalized OPC cell lines. Perhaps that's what you are thinking of.

    I hope this helps, otherwise best of luck in your research.

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 20, 2014 - 8:52 PM
  33. Hi Ryan, thank you ver much for detailed answer. Sorry for my english, i couldnt explain good.
    I did the shaking of course but without putting shaker inside the CO2 incubator, I did shaking at 37 degree incubation only and at 180 rpm. Because the flasks are uncoated(I have used uncoated flasks for rat OPC"s without problem, that is why I tried this way with mouse as well) I hesitated to increase rpm to 240 or so, to prevent astrocyte detachment, and I also think that fibroblast contamination is because of the meninges. Second time I will prevent it.
    It is good to know that I must use coated flasks, I will try again, if you say so.
    Thank you so much, good luck to too..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 21, 2014 - 6:22 AM
  34. Hi Again,
    Alright - I strongly suggest to put the shaker in the incubator for the overnight shake, as I have found this to be a crucial step in maintaining pH balance. The media on your cells should always be a rich red colour (indicative of a balanced pH) all the time. Mouse OPCs are very sensitive to pH, and will die with too much fluctuation. If during your shaking, the media becomes at all purple-ish or yellow-ish, your OPC yield will drastically reduce. I wouldn't be surprised either if this was a contributing factor to the monolayer detachment you experienced previously. There is a significant difference in the in vitro behaviour/viability of mouse OPCs as compared to rat, hence the generation of this protocol. Your best bet is to simply follow this protocol exactly as is.

    Thanks for your comment, and good luck,
    Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 21, 2014 - 12:25 PM
  35. Hi.
    One more question Ryan, about amount of the brains seeded, I was seeding 2 rat brains/ T75 flask , in the mouse case to obtain same amount of cells seeded I was using 6 brains per flask. Would you suggest to use 3-4 instead of six? and if i seed 6 animals should I increase concentration of insulin added to mixed culture media? Overall what would be optimum amount of brains per T75 flask in your opinion? Does it matter to much? Because here you use 1 brainper T25 flask.
    Thanks again..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 26, 2014 - 4:20 PM
  36. Hi Aysel,
    Again, your best bet for success is to follow the protocol exactly as is - T25 flasks are what this method has been optimized for. I suppose T75 flasks have 3 times the surface area, so in theory 3 mice would have to be seeded to a T75 to yield the same cell density. I've never tried this protocol with T75 flasks, and I know that different culture vessels have different impact on growth and survival of OLs.
    Best - RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 27, 2014 - 10:47 AM
  37. Hi Ryan . I want to say that I replicated the procedure exactly as here, and have got very good yield, but I have 1 more question to you, majority of OPCs die in the differentiation media after 6-7 days of incubation. You indicated that it is important not to distrub them until fixation, but how do you do the medium chage, I put 1 ml media first day and did 2/3 media change each 3 days, I seeded all cells to one 24 well format plate, at each time points(3 d, 6 d, 9 d) I transfer the slides to new plate and fix them there and do medium change for rest of the slides. By the way I culture OPCs at 5% CO2, becaue I have only 2 options 5% and 10%, i cant adjust ph of the incubators at this time point. Is it the contributing factor for death of the cells after 4-5 days of incubation?

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    March 19, 2014 - 2:43 PM
  38. Hi Aysel - I'm glad to hear things are looking up -

    1. I don't suggest differentiating the OLs for longer than 6 days. If you're finding they are not differentiating fast enough, you can add 4 mg of L-Thyroxine to the 100X OL-supplement (see the media recipe list above).

    2. It is normal to lose OLs over the time course of differentiation. That being said, you don't want to encourage death by moving the cells or culturing at low pH. You should not be changing the media of the purified OL cultures at any point - they do not require media changes. The protocol also says to culture the OLs at 8.5% CO2. Since you have access to both 5 and 10% CO2 incubators, and 8.5 is closer to 10 than it is to 5, I suggest culturing them at 10%.

    3. Rather than culturing all of your time points in one dish, use 3 dishes (one for 3 days, one for 6 etc). That way, you won't have to disturb your other time points.

    4. Do not remove the coverslips from the wells of your 24 well dish during fixation - simply add concentrated PFA directly into the media and allow to fix for about 15 mins at room temp.

    Sounds like you're almost there, Best of luck - Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    March 19, 2014 - 3:58 PM
  39. Let me write it again to see if I have understood you correct, you say dont do any media change ever, neither at 3 days or 6 days or further? The other things I will try what you suggest, culturing and seeding in different plates at 10% CO2
    I want to thank you a lot for your help and all of the explanations.
    Thanks ..
    Best,
    Aysel

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    March 19, 2014 - 4:22 PM
  40. Thats correct :)
    You're very welcome,

    Ryan

    Posted by: Ryan O.
    March 19, 2014 - 5:49 PM
  41. Hi Ryan,

    Thanks for sharing this protocol, looks really good and will try it out. I have a couple of questions regarding your protocol and was hoping you could shed some light on some problem I am experiencing at the moment.

    With regards to what you have just described, we actually perform a very similar mixed glial culture on P0-P3 rat brains. Our isolation stages are very similar with the exception we use DNAse1 and L-cysteine along with Papain. Upon plating our cell suspensions the flasks are densely populated with microglia on top, then opc's below and then astrocytes. We basically shake off our microglia before doing the overnight shake for the OPC's.

    My question is how do you get rid/ not see any microglia in your mouse cultures? Is it also possible to obtain microglia from your method?

    We are currently experiencing problems with obtaining OPC's from our overnight shake (in rat). The cells look healthy when in culture with the microglia but once the microglia are removed and we perform the steps required to plate the OPC's we have a lot of contaminants in with the cells, almost like long fibrous structures that are stained by trypan blue. We still obtain + 5 million OPC's but the cells do not look healthy and the morphology is not consistent with OPC's. Upon plating these cells they fail to show characteristics of OPCs and a lot die off. I will mention we do not shake in an incubator but in an orbital shaker at 250rpm with the caps sealed tight and parafilm. Have you ever encountered this?

    Many thanks .

    Reply
    Posted by: Graeme I.
    February 9, 2015 - 1:06 PM
  42. Hi Graeme, thanks for your question.
    We do in fact get microglia in our mixed cultures, but we remove them prior to the overnight shake with a slow short shake (as in the rat method). These shaken off microglia are a very pure population, and can be cultured separately if desired.
    With regard to the problems you’re encountering shaking your rat cultures, I can’t say I’ve experienced anything quite like what you’re describing. It almost sounds like your cultures are suffering from contamination (maybe yeast?). We’ve experienced contamination a couple of times, and it resulted in much of the monolayer dissociating from the base of the flask during the overnight shake. If you like, you can send me a pic of the fibrous structures in the hopes that I could recognize what they are (romea077@uottawa.ca).
    We have never had luck shaking flasks in an orbital shaker – we exclusively use tissue culture incubators with vented caps. One risk of using an orbital shaker is they pose a threat for contamination, as they are often used for bacterial cultures.
    I hope this helps and best of luck,
    Ryan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 20, 2015 - 11:12 AM
  43. Hi Ryan,

    Thanks for your reply.

    I tried the protocol and achieved very nice OPC's so everything seems ok there.

    With regards to what I was seeing after my rat OPC shake, I believe it not to be of any contamination but more something coming out of solution in our media. As a test I shook DMEM10% in a T75 flask, 37 degrees, 250rpm overnight. The next day I took an aliquot and looked at it with trypan blue. To my surprise I saw the same fibrous clumps that I was seeing after the OPC shake

    . My DMEM only contains FBS and pen-step so this has to be something in FBS. My most recent shake off I decided to shake off 5 flasks with DMEM 10% and 5 flasks with OPC media (our OPC media contains 2.5ml FBS vs 50ml in DMEM). The next day after following normal protocol I counted the cells from both conditions. The OPC media flasks had almost none of the fibrous clumps whereas the DMEM flasks had alot. I can now partially get round this problem by filtering with 40uM strainer but have you ever heard or seen this kind of thing. We have used several batches if FBS so it cannot be that every batch has precipitated proteins in it but perhaps what were doing is causing precipitation of FBS proteins that are affecting the OPC's?

    Thanks

    Graeme

    Reply
    Posted by: Graeme I.
    March 15, 2015 - 4:16 PM
  44. Hi Ryan,

    Is your FBS from Invitrogen decomplemented ? If so did you buy decomplemented or did you heat it at 56*C and for how long.

    Thanks

    Reply
    Posted by: Ludovic D.
    February 24, 2017 - 10:40 AM
  45. Hi Ludovic,
    I've used FBS that has been heat-inactivated by the manufacturer, and I've also used FBS that I've heat inactivated myself. For the latter, if memory serves, about 30 minutes at roughly 50 degrees C should do the trick (water bath).
    Good luck, Ryan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 26, 2017 - 11:49 AM
  46. Hi Ryan,
    I am wondering if you have any experience with adding Cre Recombinase Adenovirus to the cultures? And if you think a particular day would be best to add it? I was thinking of adding it on D8 (1 day before the full media change) but wasn't sure if adding virus and then shaking the cells would cause too much stress?
    Thanks,
    Megan

    Reply
    Posted by: Megan R.
    April 30, 2018 - 2:39 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics