Author Produced

الاشتقاق الثقافات Oligodendrocyte المخصب وOligodendrocyte نيورون / Myelinating المشارك من الثقافات في مرحلة ما بعد الولادة مناديل الفئران

Neuroscience
 

Summary

توضح هذه المقالة الطرق لاستخلاص اليورانيوم من السكان الفئران الخلايا السليفة oligodendrocyte (OPCs) في الثقافة الأولية ، والتي تفرق لإنتاج oligodendrocytes ناضجة (شريان الحياة). بالإضافة ، فإن هذا التقرير يصف التقنيات لانتاج الفئران myelinating المشترك الثقافات OPCs بذر الماوس على سرير neurite من الخلايا العصبية الظهرية الماوس العقدة الجذر (DRGNs).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues. J. Vis. Exp. (54), e3324, doi:10.3791/3324 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تحديد الآليات الجزيئية الكامنة وراء التنمية رأ ليس فقط ضروري لتعزيز معرفتنا البيولوجيا الرتب الأخرى ، ولكن أيضا لفهم الآثار المرضية للأمراض المزيل مثل التصلب المتعدد (MS). تدرس عادة الخليوي تطوير النماذج الأولية مع ثقافة الخلية. زراعة الخلايا الأولية يسهل تقييم لإعطاء نوع من الخلايا من خلال توفير بيئة تسيطر عليها ، وخالية من المتغيرات الدخيلة التي تكون موجودة في الجسم الحي. في حين أن الثقافات رأ المستمدة من الفئران وفرت كمية هائلة من نظرة ثاقبة البيولوجيا OL ، وقد اجتمعت جهود مماثلة في إرساء ثقافات رأ من الفئران مع العقبات الرئيسية. تطوير أساليب عملية شريان الحياة لثقافة الفئران الأولية لا بد من أجل الاستفادة من خطوط الماوس المعدلة وراثيا المتوفرة.

وقد وصفت وسائل متعددة لاستخراج OPCs من أنسجة القوارض ، بدءا من neurosphere الاشتقاق ، والفرق تنقية التصاق immunopurification 1-3. بينما تقدم العديد من أساليب النجاح ، والأكثر ثقافة واسعة تتطلب مرات و / أو معدات مكلفة / الكواشف. للتحايل على هذا ، وتنقية OPCs من أنسجة الفئران مع تكييف الطريقة الموصوفة في الأصل من قبل Vellis مكارثي & دي 2 هو المفضل. هذا الأسلوب ينطوي على OPCs جسديا فصل من ثقافة الدبقية المختلطة المستمدة من القشور القوارض الولدان. والنتيجة هي مجموعة من السكان OPC المنقى التي يمكن أن تكون متمايزة في ثقافة OL - المخصب. هذا النهج هو جذابة بسبب الوقت القصير نسبيا على ثقافتها وشرط ضروري لعوامل النمو أو الأضداد immunopanning.

في حين استكشاف آليات التنمية رأ في ثقافة المنقى غني بالمعلومات ، فإنه لا يوفر البيئة الأكثر ملاءمة فيزيولوجيا لتقييم المايلين غمد تشكيل. وشارك في زرع شريان الحياة للسودان مع الخلايا العصبية تقديم نظرة ثاقبة على الأسس الجزيئية التي تنظم رأ بوساطة تكون الميالين من المحاور. بالنسبة للعديد من رأ / عصبون شارك في دراسات ثقافة ، وقد أثبتت الخلايا العصبية الظهرية العقدة الجذر (DRGNs) لتكون من نوع الخلايا العصبية في الاختيار. وهي مثالية للثقافة بالتعاون مع عملية شريان الحياة الخاصة بهم نظرا لسهولة استخراج ، كمية ضئيلة من الخلايا الملوثة ، وتشكيل أسرة neurite الكثيفة. بينما تم نشر الدراسات التي تستخدم الفئران / الماوس myelinating xenocultures 4-6 ، طريقة لاستخلاص هذه رأ / DRGN myelinating شارك في ثقافات ما بعد الولادة من أنسجة الفئران لم يتم وصفها. هنا نقدم طرق تفصيلية بشأن كيفية إنتاج مثل هذه الثقافات على نحو فعال ، جنبا إلى جنب مع أمثلة من النتائج المتوقعة. هذه الطرق مفيدة لمعالجة المسائل ذات الصلة بالتنمية رأ / الوظيفة myelinating ، وأدوات مفيدة في مجال علم الأعصاب.

Protocol

بيان الأخلاق

وقد اهتم الفئران المستخدمة في هذا العمل وفقا للالمجلس الكندي للرعاية الحيوان (CCAC) المبادئ التوجيهية. تم الحصول على الموافقة الأخلاقية للتجارب التي أجريت من جامعة أوتاوا جنة رعاية الحيوان تحت رقم بروتوكول OGH - 119.

1. تشريح -- الولدان الماوس لاستخراج القشرة OPC

  1. التضحية P0 - P2 الماوس وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
  2. تشريح الدماغ ووضع في طبق بتري تحتوي على الجليد الباردة MEM (المضادات الحيوية مجانا).
  3. نقل الطبق إلى مجهر تشريح.
  4. باستخدام مشرط مع الدماغ الجانب الظهري يصل ، وجعل شق sagittally الضحلة على طول الحافة الإنسية الأكثر من كل القشرة (الشكل 1A). هذا ينبغي أن تمر إلا من خلال شق في طبقة السحائي بغية تسهيل إزالتها.
  5. استخدام ملقط غرامة يميل إلى تقشر السحايا بطريقة جانبية. إذا فعلت بعناية ، يمكن إزالة هذه الطبقة في قطعة واحدة. أثناء هذه الخطوة ، إزالة بصيلات الشم.
  6. مع الدماغ بطني الجانب المتابعة ، وجعل شق عميق السهمي حيث يلتقي اللحاء المنطقة البطنية من الدماغ البيني (الشكل 1B).
  7. مع الجانب الظهري الدماغ المتابعة ، فصل القشور من الدماغ المتوسط ​​عن طريق التحديق في النسيج الإنسي إلى الوحشي أزياء (الشكل 1C ، ج "). إزالة أي السحايا المتبقية في هذه الخطوة.
  8. النرد كل القشرة إلى ما يقرب من 4 قطع ونقل بلطف لأنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 350 ميكرولتر من الدماغ MEM الفأر الواحد. إبقاء الأنبوب على الجليد حتى يتم معالجة كافة الفئران.
  9. كرر الخطوات من 1،1-1،8 عن الفئران المتبقية.

2. تفكك قشرات الولدان وصيانة ثقافات مختلطة الدبقية

ملاحظة : ينبغي تجنب إدخال فقاعات في الخلية أثناء تعليق كافة الخطوات التالية.

  1. إضافة أنبوب 15 مل مخروطي يحتوي على تشريح أدمغة حديثا إلى 37 درجة مئوية لحمام الماء 3 دقائق.
  2. نقل العقل لغطاء نسيج الثقافة العقيمة.
  3. تمر بلطف قشرات مكعبات خلال قمة ماصة P1000 لتوليد أجزاء أصغر. توقف مرة واحدة pipetting لا توجد قطعة الدماغ كبيرة بما يكفي لعرقلة تدفق سلس للتعليق من خلال التلميح ماصة.
  4. إضافة 75 ميكرولتر من محلول غراء OPC في الدماغ في أنبوب مخروطي الشكل. يجب أن يكون الحل غراء OPC مسبقا في درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة قبل الاستخدام.
  5. احتضان في حمام الماء ° 37 مئوية لمدة 20 دقيقة. تقريبا كل دقيقة 2 ، عكس بلطف أنبوب لمنع تراكم الأنسجة. خلال هذا الوقت ، وإضافة 5 مل من وسائل الإعلام مختلطة إلى كل ثقافة الدبقية بولي - L - يسين (PLL) مغلفة (1 ملغ / مل) T25 قارورة (واحد لكل قارورة الدماغ الماوس) ، والمكان في 37 درجة مئوية في نسيج الثقافة الحاضنة 8.5 ٪ CO 2.
  6. بعد 20 دقيقة ، مقابل تعليق الأنسجة لغطاء المحرك ومعقمة إضافة 2 مل من وسائل الإعلام مختلطة الثقافة الدبقية في الدماغ إلى الأنبوب. اسمحوا الجلوس لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح لتعطيل الحل غراء OPC.
  7. قسامة تعليق النسيج إلى 5 مل من أنابيب بلاستيكية. يجب أن يكون عدد من الأنابيب مطابقة عدد من العقول تشريح ، مما أدى إلى ما يقرب من 2.5 مل في أنبوب.
  8. باستخدام العقيمة اللهب مصقول ماصة باستير الزجاج ، يسحن بلطف الأنسجة في كل أنبوب. متمزج ببطء في البداية ، وزيادة السرعة تدريجيا كقطع فصل. متمزج حوالي 10-15 مرة ، ولكن هذا العدد قد تختلف استنادا إلى كفاءة الهضم.

ملاحظة : وكيل سحن سيؤدي إلى تفكك النسيج الفقراء ، في حين أن الإفراط في سحن سوف تؤثر سلبا على سلامة الخلية. من المهم أن لا يعرض فقاعات في الحل ، لأن هذا سوف يؤثر بشدة بقاء الخلية.

  1. مرة واحدة لا توجد كتل الأنسجة المرئية المتبقية في التعليق ، ونقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على 4 مل من وسائل الإعلام مختلطة في الدماغ الدبقية الثقافة (أي 4 = 16 مل أدمغة مختلطة وسائل الإعلام الثقافة الدبقية).
  2. بلطف عكس أنبوب مخروطي 50 مل وكرر لأنابيب المتبقية 5 مل.
  3. قسامة تعليق خلية مجمعة في أنابيب مخروطية 15 مل (حوالي 6.5 مل في أنبوب مل 15). يجب أن يكون عدد الأنابيب 15 مل يطابق عدد تشريح أدمغة.
  4. أنابيب الطرد المركزي في 1200 دورة في الدقيقة (~ 300 غ) لمدة 5 دقائق.
  5. نضح بعناية طاف وإضافة 1 مل من الحارة مختلطة وسائل الإعلام لثقافة الدبقية كل أنبوب 15 مل المخروطية.
  6. resuspend ببطء بيليه مع طرف ماصة P1000 ، والحرص على عدم إدخال الفقاعات. إضافة تعليق كل خلية من الأنبوب إلى القارورة قبل معايرتها T25 PLL مغلف بالمطاط ، مما يجعل الحجم الإجمالي للثقافة وسائل الإعلام إلى 6 مل.
  7. ضع القوارير في نسيج الثقافة حاضنة لل3-4 ساعات للسماح للخلايا لإرفاق الركيزة PLL. إجراء تغيير وسائل الإعلام الكاملة pipetting من وسائل الإعلام ، وإضافة 6 مل من وسائل الإعلام الجديدة المختلطة للثقافة الدبقية القوارير. هذه الخطوة يزيل الكثير من الحطامبسبب سحن ، ويعزز قابلية الثقافة. إذا المطلوب رأ / DRGN المشترك الثقافات ، تشير إلى المادة 3 من هذا البروتوكول.
  8. بعد 3 أيام من الثقافة ، وإجراء تغيير 03/02 وسائل الاعلام عن طريق إزالة 4 مل من وسائل الإعلام ، واستبدالها ب 4 مل من وسائل الاعلام ثقافة جديدة مختلطة الدبقية. عند هذه النقطة ، ينبغي أن يكون أحادي الطبقة نجمية تتشكل على قاعدة قوارير.
  9. في يوم 6 ، وأداء وسائط أخرى 03/02 التغيير وتكملة القوارير مع التركيز النهائي للانسولين ميكروغرام / 5 مل. عند هذه النقطة ، ينبغي أن يكون أحادي الطبقة نجمية تكون مرئية بوضوح ، وعلى رأسها OPCs سيتم المتكاثرة.

3. DRGN العزلة

ملاحظة : للإنتاج رأ / DRGNs المشترك الثقافات ، وينبغي وضع DRGNs اليوم بعد جيل ثقافة الدبقية مختلطة. وتزرع هذين النوعين الثقافة بشكل مستقل ، وبعد الجمع بين 90-10 يوما.

  1. التضحية P5 - P10 الماوس وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
  2. استخراج العمود الفقري ، ونقل إلى طبق بيتري نظيفة.
  3. تقليم بعيدا كما الكثير من العضلات والعظام والعمود الفقري من قدر الإمكان (الشكل 1D ، 'د) ، وهذا سيخفف من تشريح العقد الجذرية الظهرية (DRGs).
  4. نقل العمود الفقري لقطع طبق بيتري بطني جديدة تصل إلى جنب. باستخدام مقص تشريح والبدء caudally ، وقطع إعلامي من خلال العمود الفقري بطريقة طولية.
  5. باستخدام اثنين من أزواج من الملقط ، نقب بلطف فتح العمود الفقري لفضح الحبل الشوكي.
  6. ويمكن الاطلاع على DRGs تحت والوحشي للنخاع الشوكي. باستخدام الملقط يميل غرامة ، وإزالة بلطف DRGs مع تفادي الأضرار التي لحقت العقد (الشكل 1E).
  7. نقل إلى حل DRGs إزالة الجليد الباردة هانك ملح مخزنة (HBSS ، خالية من المضادات الحيوية) في طبق بتري جديدة. ينبغي للمشرح تهدف لاستخراج 40 DRGs في الماوس (الشكل 1F).
  8. بمجرد أن يتم استخراج DRGs ، تقليم DRGs أي جذور طويلة بشكل مفرط (الشكل 1G ، 'ز) لتقليل تلوث إدخال الخلايا في الثقافة (الخلايا الدبقية ، الخلايا الليفية).
  9. نقل DRGs لأنبوب الطرد المركزي 1.5 مل تحتوي على 500 ميكرولتر من HBSS الجليد الباردة.
  10. أجهزة الطرد المركزي في 1200 دورة في الدقيقة (~ 300 غ) لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية لبيليه في DRGs.
  11. نقل أنابيب الطرد المركزي لغطاء نسيج الثقافة العقيمة وإزالة HBSS من الأنابيب.
  12. إضافة 500 ميكرولتر من قبل حرارة (20 دقيقة عند 37 درجة مئوية) حل DRG غراء ، واحتضان الأنابيب في المياه 37 درجة مئوية لمدة الحمام 10 دقيقة. عكس كل الأنابيب 2 دقيقة لمنع تجميع الأنسجة.
  13. كرر الخطوة 3.10.
  14. إزالة الحل غراء DRG وإضافة 500 ميكرولتر من قبل حرارة (20 دقيقة عند 37 درجة مئوية) كولاجيناز الحل. احتضان في حمام الماء ° 37 مئوية لمدة 10 دقيقة ، عكس كل دقيقة 2.
  15. كرر الخطوة 3.10.
  16. طاف إزالة وإضافة 1 مل من وسائل الاعلام DRGN. عكس مرات عدة أنبوب.
  17. كرر الخطوة 3.10.
  18. كرر الخطوة 3.16.
  19. معطف العقيمة اللهب الزجاج المصقول ماصة باستور مع ألبومين المصل البقري (BSA) عن طريق pipetting حل جيش صرب البوسنة 0.25 ٪ في عدة مرات HBSS. سيتم طلاء مع حل جيش صرب البوسنة منع DRGs من الانضمام إلى جدران ماصة الزجاج.
  20. يسحن في DRGs مع ماصة BSA المغلفة برفق في البداية ، وزيادة كثافة مع بدء الفصل بين كتل أخرى. متمزج حوالي 10-15 مرة ، ولكن هذا الرقم يعتمد على درجة من الهضم ، وعدد DRGs في الأنبوب.
  21. متى تم تحقيق الانفصال ، تمرير تعليق من خلال تصفية 50 ميكرومتر في طبق بتري معقمة تحتوي على 7 مل من وسائل الاعلام DRGN. وسوف يقضي على الكثير من الترشيح الانقاض من التعليق الخلية ، على الرغم من أن هذه الخطوة ليست حرجة.
  22. احتضان طبق بيتري عند 8.5 ٪ CO 2 لنحو 1.25 ساعة.
  23. معطف عدة coverslips 12 ملم مع LN2 (10 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني) في صحن 24 - جيدا خلال هذه الفترة الحضانة.
  24. بمجرد الانتهاء من الحضانة ، ومراقبة طبق بيتري تحت حقل مشرق. ويتم تحديد الخلايا DRGNs كما كبيرة المرحلة جسديا ، والظلام. دوامة طبق بيتري برفق لرفع أي DRGNs الالتزام.

ملاحظة : العديد من الخلايا الملوثة وانضمت بشدة على طبق بيتري ، وبالتالي إثراء التعليق الخاص خلية لDRGNs.

  1. تعليق نقل الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل. الشطف بلطف الطبق مع 4 مل من وسائل الاعلام لجمع أي DRGN DRGNs المتبقية. نقل إضافية 4 مل في أنبوب مخروطي الشكل.
  2. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1200 دورة في الدقيقة (~ 300 غ).
  3. وطاف نضح resuspend الكرية في 500 ميليلتر من وسائل الإعلام DRGN الطازجة.
  4. حساب عدد DRGNs أسفرت باستخدام عدادة الكريات. لا شك أن نعتمد فقط على DRGNs ، وغيرها من أنواع الخلايا لا. ويمكن التعرف من خلال هذه DRGNs كبيرة أجسام الخلايا كروية.
  5. البذور 30،000-50،000 DRGNs إلى كل ساترة LN2 المغلفة في 1 مل من وسائل الاعلام DRGN ، والمكان في 37 درجة مئوية في نسيج الثقافة حاضنة CO 2 و 8.5 ٪ بين عشية وضحاها.
  6. في صباح اليوم التالي ، بإجراء تغيير كامل وسائل الاعلام عن طريق استبدال DRGNوسائل الاعلام مع وسائل الاعلام رأ (ناقص CNTF) مع التركيز النهائي من القلم 1 ٪ / بكتيريا و 10 ميكرومتر FuDR.
  7. في أيام 3 و 5 ، تنفيذ تغيير وسائل الإعلام 3 / 4 مع وسائل الإعلام نفسها كما في الخطوة 3.30.
  8. في يوم 7 ، إجراء تغيير كامل مع وسائل الاعلام وسائل الاعلام رأ (ناقص CNTF ، القلم / بكتيريا ، FuDR).
  9. في يوم 9 ، ينبغي أن يكون تشكيل DRGNs سرير neurite واسعة النطاق ، ونحن الآن على استعداد ليكون التعاون مع OPCs مثقف.

4. تنقية OPCs من ثقافات مختلطة الدبقية لإنشاء OL - المخصب الثقافات أو رأ / DRGN شارك ثقافات

  1. في يوم 9 من ثقافة الدبقية المختلطة ، ونقل إلى قوارير شاكر المداري في 5 ٪ CO 2 نسيج الثقافة الحاضنة. ضع القوارير على رأس القوارير الفارغة T25 لمنع أي الحرارة المتولدة من شاكر المداري من التأثير سلبا على الثقافات المختلطة الدبقية. السماح للثقافات لكي تتوازن هذه حاضنة جديدة لمدة 1 ساعة.
  2. مرة واحدة في قوارير ومعايرتها ، يهز القوارير في 50 دورة في الدقيقة لمدة 45 دقيقة. الغرض من هذا هو اهتزاز لإزالة أي خلايا ملتصقة فضفاضة من تلويث أحادي الطبقة.
  3. نقل الخلايا إلى الأنسجة هود ثقافة وإزالة كافة وسائل الإعلام من القوارير. استبدال 4 مل من وسائل الاعلام ثقافة جديدة مختلطة الدبقية تستكمل مع 5 ميكروغرام / مل الانسولين.
  4. ضع القوارير ليعيدوه الى شاكر ، والسماح للتوازن لحوالي 3 ساعات.
  5. مرة واحدة في قوارير ومعايرتها ، ربط بشكل آمن إلى شاكر المداري ، ويهز قوارير لحوالي 16 ساعة في دورة في الدقيقة 220 (بين عشية وضحاها).
  6. في صباح اليوم التالي ، إذا هي عملية شريان الحياة التي يمكن زراعتها في غياب DRGNs (أي OL - أغنت الثقافة) ، ومعطف عدة العقيمة coverslips 12 ملم مع LN2 (10 ميكروغرام / مل في PBS) لمدة 1 ساعة. نقل coverslips إلى 24 الأطباق جيدا ، وتغسل مع PBS يعقبه غسل ​​الإعلام OL. إضافة 1 مل من وسائل الإعلام إلى كل رأ جيدا ويوازن في CO 2 و 8.5 ٪.
  7. CO يوازن 10 سم نسيج ثقافة الأطباق في 5 2 ٪ لمدة 30 دقيقة. وسوف تكون هناك حاجة طبق واحد عن كل قارورة 2. وسوف تستخدم هذه لتخصيب اليورانيوم من الالتصاق الفرق OPCs مع وقف التنفيذ.
  8. مرة واحدة في موازنة 30 دقيقة قد مرت فترة ، ونقل وسائل الإعلام من قوارير اهتزت إلى الأطباق. يجب على كل صحن استقبال وسائل الاعلام في الفترة من 2 القوارير ، أي ما يعادل حوالي 8 مل من تعليق خلية في صحن 10 سم.
  9. احتضان الأطباق في 5 ٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة ، في حين يوفر دفع لطيف عند علامة 15 دقيقة. وهذا يساعد على منع دفع OPCs من الانضمام إلى صحن 10 سم.
  10. بمجرد اكتمال الحضانة ، ودراسة ميدانية تحت أطباق مشرق. كما يتم تحديد OPCs كتل زنزانة صغيرة ، وعادة من 3-5 خلايا ولكن في بعض الأحيان شكل مجاميع كبيرة تشبه neurospheres. وينبغي أن العديد من الخلايا النسب غير رأ الالتزام بحزم على قاعدة اللوحة. بلطف دوامة لوحات لفصل أي OPCs انضمت فضفاضة ، ونقل تعليق خلية من كل لوحة في أنبوب 15 مل المخروطية.
  11. أجهزة الطرد المركزي في 1200 دورة في الدقيقة (~ 300 غ) لمدة 5 دقائق.
  12. Resuspend الكرية في 1 مل من وسائل الاعلام رأ مع طرف ماصة P1000 ، تليها إعادة تعليق مع طرف ماصة P200.
  13. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
  14. لإثراء - OL الثقافات ، وبذور 25000 -- 50000 OPCs إلى كل ساترة LN2 12 ملم المغلفة في الحجم النهائي من وسائل الإعلام 1 ر مل.
  15. لرأ / DRGN المشترك الثقافات ، وأداء وسائل الإعلام الكاملة رأ (ناقص CNTF) التغيير على DRGNs من المقطع [3] ، وإضافة بلطف 50000 الخلايا من الخلية OPC تعليق التخصيب. الحرص على عدم تعطيل السرير neurite DRGN خلال إضافة OPCs.
  16. مكان الثقافات في الحاضنة 37 درجة مئوية في 8.5 ٪ CO 2 ، وحتى تجنب إزالة التثبيت. سوف OPCs الفئران حساسة للتغيرات في درجة الحموضة ، والعزل من الحاضنة تغيير درجة الحموضة وسائل الإعلام OL. لاحظ أيضا ، وسوف درهم إضافة إلى 2 O الآبار الفارغة المحيطة الثقافات الخلية منع التبخر وسائل الإعلام والثقافة ، وبالتالي تقليل التقلبات في تركيزات المواد المذابة في وسائل الاعلام الرتب الأخرى. هذا وسوف توفر بيئة أكثر اتساقا لOPCs.

5. تجهيز الثقافات المناعي للفحص المجهري

  1. الإصلاح الثقافات مع الميثانول بنسبة 100 ٪ عند -20 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ، أو بارافورمالدهيد 3 ٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  2. Permeabilize coverslips بنسبة 0.1 ٪ تريتون - X - 100 لمدة 10 دقيقة ، مع غسل الفوسفات مخزنة المالحة كتلة (PBS) و لمدة 1 ساعة في مصل الماعز 10 ٪.
  3. احتضان coverslips مع الأجسام المضادة الأولية مخففة في عرقلة الحل بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  4. غسل coverslips 3 مرات مع برنامج تلفزيوني ، واحتضان مع الأضداد اليكسا - ثر الثانوية مترافق (Invitrogen) المخفف في عرقلة الحل لمدة 45 دقيقة.
  5. ملون مباين مع 4 "،6 - diamidino - 2 - phenylindole (دابي) وتغسل coverslips عدة مرات مع برنامج تلفزيوني.
  6. جبل في الفلورية coverslips داكو تصاعد المتوسط.
  7. تحليل الشرائح عن طريق الفحص المجهري المناعي. في هذا البروتوكول ، وتم تحليل الشرائح مع إما مضان زايس 200M Axiovert المقلوبمجهر أو LSM زايس الليزر META 510 مجهر المسح مبائر.

6. استخراج البروتين كامل الخلية من رأ التخصيب الثقافات

  1. إزالة 24 جيد من الثقافات وحاضنة باردة على الجليد لمدة 3 دقائق.
  2. إزالة بعناية وسائل الإعلام ، وإضافة 10-20 ميكرولتر من تحلل العازلة (50 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 0.1 ٪ SDS ، 0.5 ٪ deoxycholate الصوديوم ، 1 ٪ تريتون - X - 100 ، مع pepstatin 0.1 ٪ ، أبروتينين ، PMSF ، leupeptin ، orthovanadate الصوديوم) على كل بئر (ويقترح ما لا يقل عن 8 آبار في العينة).
  3. كشط الآبار باستخدام مجموعة واسعة من عيار غيض ماصة P1000 ، ونقل إلى lysate مل أنبوب الطرد المركزي 1.5.
  4. تمرير lysate خلال حقنة نصف عيار 30 حوالي 15 مرة ، والبرد على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  5. أنابيب الطرد المركزي في 14000 دورة في الدقيقة (~ 20000 ز) لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  6. طاف لنقل أنابيب أجهزة الطرد المركزي الجديدة ، وتخزينها في -80 درجة مئوية.

7. SDS - PAGE تحليل البروتين الثقافة المخصب - OL

  1. حل 30 ميكروغرام لكل عينة من البروتين في تقليل العازلة SDS - PAGE على مستوى المواد الهلامية البولي أكريلاميد 12 ٪.
  2. نقل المواد الهلامية شبه الجافة على الأغشية PVDF.
  3. الأغشية كتلة لمدة 1 ساعة في 5 ٪ مسحوق الحليب الخالي من الدسم في TBST (10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0 ، 150 مم كلوريد الصوديوم ، 0.1 ٪ توين - 20).
  4. احتضان الأغشية مع الأجسام المضادة الأولية مخففة في عرقلة الحل لمدة 1 ساعة.
  5. غسل الأغشية 3 مرات مع TBST لمدة 10 دقيقة.
  6. احتضان الأغشية مع HRP - مترافق الأجسام المضادة الثانوية لمدة 45 دقيقة في عرقلة الحل.
  7. غسل الأغشية عدة مرات مع TBST ، واحتضان مع ECL أمرشام بلس الغربية كاشف الكشف النشاف (GE للرعاية الصحية) لمدة 5 دقائق.
  8. اكتشاف بروتين مع عصابات معيار الفيلم التصوير العلمي.

8. ممثل النتائج :

في هذا البروتوكول ، ويتم توسيع OPCs على المونولاير نجمية داخل ثقافة الدبقية مختلطة. هذا مستمد من ثقافة مختلطة الدبقية P0 - P2 القشرة الماوس الولدان. في يوم 1 في المختبر (DIV1) ، وثقافة مختلطة تحتوي على خلايا الدبقية مع morphologies متفاوتة من وجهة نظر المجهر النقيض المرحلة (الشكل 2A). في DIV3 ، وهو أحادي الطبقة نجمية يبدأ النموذج على قاعدة القارورة ، وعلى DIV8 ، يمكن بوضوح ملاحظة OPCs على سطح أحادي الطبقة. في DIV9 ، وصلت كثافة انتشار OPCs تكون كافية لتنقية عن طريق هز عالية السرعة بين عشية وضحاها المداري. بمجرد الانتهاء من عملية التنقية ، والنتيجة هي الخلية السكان OPC التخصيب. DIV1 في مرحلة ما بعد تنقيتها ، ومورفولوجيا OPCs بسيطة ، وتوسيع نطاق العمليات قليلة (الشكل 2B). في تنقية DIV3 آخر ، وقد مددت خلايا meshwork معقدة من العمليات ، تذكرنا عملية شريان الحياة غير ناضجة. في تنقية DIV6 آخر ، وسوت عملية شريان الحياة للتنقية والمتوقعة النشرة هياكل شبيهة الغشاء. هذا التطور المورفولوجي هو نموذجي من النضج في المختبر من شريان الحياة.

المجهري يشير المناعي للخلايا وتنقيته من OL - النسب (الشكل 3A). في البداية أعرب المصنف OPCs شوندروتن بروتيوغليكان سلفات (NG2) ، وتتطور إلى الميلين المرتبطة بروتين سكري (MAG) عملية شريان الحياة غير ناضجة إيجابية في غضون ثلاثة أيام بذر آخر (الشكل 3B). في DIV6 ، وكثير من البروتين المايلين عن عملية شريان الحياة الأساسية (MBP) ، وتمتلك نموذجية مورفولوجيا رأ ناضجة. وكميا في المئة OL - نسب الخلايا في نقاط زمنية مختلفة لتحديد نقاء الثقافات OL - المخصب (الشكل 3C). في آخر لتنقية DIV1 والثقافات هي 50 ± 14 ٪ NG2 OPCs هاء + ، مع عدم وجود هاء + + MBP MAG أو عملية شريان الحياة هاء. هذا يدل على تنقية OL - نسب الخلايا في مرحلة تمهيدية في وقت البذر ، مع أعداد ضئيلة من عملية شريان الحياة المتباينة. في DIV3 ، شريان الحياة في العديد من الخلايا المتمايزة MAG هاء + (24 ± 5.9 ٪) في حين أن بعض الإبقاء على النمط الظاهري السلائف ، وتبقى NG2 + (13 ± 8.0 ٪). في DIV3 ، وهي نسبة صغيرة من الخلايا MAG هاء + (3.2 1.2 ٪) هي أيضا تعبير عن MBP. في DIV6 ، 20 ± 5.9 ٪ من المجموعة الاستشارية للألغام وعملية شريان الحياة + في حين قمت 12 ± 7.3 ٪ كما تستمر NG2 + OPCs هاء. بالإضافة إلى ذلك ، 21 ± 9.3 ٪ من الخلايا داخل الثقافة هي شريان الحياة MBP + هاء في هذه النقطة الزمنية. SDS - PAGE يبين التحليل التعبير متدرجة من 3' - فسفودايستراز 2'3' - دوري - النوكليوتيدات (CNP) MBP والثقافة خلال فترة 6 أيام ، مما يدل على زيادة قدرة OPCs في الثقافة التفريق عضال في عملية شريان الحياة الناضجة (الشكل 3D ). بشكل جماعي ، وهذه البيانات تضع هذا الأسلوب كوسيلة لانتاج نظام الثقافة OL - المخصب المناسب للدراسة من النضج رأ OPCs.

هذا البروتوكول أيضا وصف أساليب لإنشاء رأ / DRGN المشترك الثقافات باستخدام مصادر الأنسجة الفئران فقط. ومع ذلك ، من أجل إنتاج المشارك الثقافة ، لا بد أولا أن يكون المثقف DRGNs وحده لانتاج شبكة neurite كافية. وتزرع هذه الثقافات ما بعد الولادة الخلايا العصبية الفئران لمدة 9 أيام في وسائل الاعلام المصل منخفضة ب 10 ميكرومتر مكملات FuDR لمنع انتشار الخلايا الليفية وتلويث GL الاتحاد العالمي للتعليم الخلايا. على مدى 9 أيام في المختبر ، DRGNs معزولة انتاج سرير neurite الكثيفة (الشكل رقم 4A). هذا السرير هو neurite immunopositive للعلامات العصبية neurofilament 200 (NF) وTuj1 (الشكل رقم 4B). عند هذه النقطة ، يمكن إضافة OPCs المنقى إلى أسرة neurite ، ومثقف ل6 أيام إضافية لإنتاج myelinating المشترك الثقافات.

في DIV6 من رأ / DRGN المشترك والثقافة ، والعديد من MBP + لقد لاحظ عملية شريان الحياة يمكن ان يكون من بين neurites NF DRGN + هاء (الشكل 5A). بناء على فحص دقيق ، وتدل عملية شريان الحياة لاجراء اتصالات مع العديد من neurites DRGN ، مغمد في كثير من الأحيان مع MBP + غشاء هاء (الشكل 5B ، ج).

الشكل 1
الشكل 1. الصور مجهر تشريح جوانب معينة من القشرة الماوس الولدان والعزلة DRG. (أ) عرض الظهرية من مخ الفأر الولدان المستخرج حديثا. الخطوط المنقطة تشير إلى المنطقة التي يجب أن تكون فتحات لتسهيل إزالة طبقة السحائي (ب) عرض بطني من الدماغ ، والخطوط المنقطة تشير إلى المنطقة حيث قشرة الدماغ البيني يفي البطني. ولا بد من بذل الشقوق العميقة على طول الخطوط المنقطة للمساعدة في عزل القشور (ج ج ') تصوير مرئي لكيفية ابعاد القشرة بعيدا عن بقية المخ. (د) طازجة معزولة العمود الفقري الماوس P5 - P10 قبل تقليم بعيدا العضلات والعظام الزائدة (د ') (ه) موقع DRGs داخل العمود الفقري (و) العدد التقريبي للDRGs أن تكون معزولة عن بعضها الماوس (ز) DRG مع جذور طويلة والتي تتطلب التشذيب قبل الهضم الأنزيمي. خط منقط يشير إلى المنطقة التي ينبغي أن يقص جذور (ز ') DRG آخر الجذر التشذيب.

الشكل 2
الشكل 2. يتم توسيع OPCs ضمن ثقافة الدبقية المختلطة ، وتنقيتها ، ومتمايزة في وقت لاحق بوصفها ثقافة OL - المخصب. (أ) على النقيض من الصور المرحلة الثقافات الدبقية مختلطة في مراحل مختلفة من التنمية. في DIV1 ، تظهر الخلايا مستديرة مع عدد قليل من الخلايا التي سويت بالأرض. التقسيم الطبقي للثقافة الدبقية مختلطة يبدأ في DIV3 ، حيث تشكل الخلايا النجمية المونولاير موحدة على قاعدة القارورة ، التي يعتمد عليها OPCs تتكاثر. وينظر العديد من OPCs في DIV8 (سهام) انضمت إلى سطح المونولاير نجمية (ب) وبمجرد تنقية الثقافة من الدبقية المختلطة ، وقد مددت DIV1 OPCs فقط بعض العمليات. في DIV3 ، فقد مددت خلايا العديد من العمليات ، تذكرنا المرحلة المتوسطة شريان الحياة. في DIV6 ، شريان الحياة بالارض (النجمة) ويبدو أن إنتاج أوراق الغشائي (خط متقطع). أشرطة النطاق ، 50 ميكرومتر.

الشكل 3
الشكل 3. توصيف OL - أغنت الثقافة. (أ) الصور متحد البؤر المعزولة من عملية شريان الحياة في مراحل مختلفة من التنمية. NG2 + لقد قمت OPCs مورفولوجيا بسيطة ، في حين أن عملية شريان الحياة + MAG لقد تملك arborous عمليات متعددة. MBP + لقد قمنا بمد عملية شريان الحياة الغشائي النخاعين مثل الأوراق. مقياس بار ، و 50 ميكرومتر (ب) تنقية OL - النسب كما تنشأ خلايا OPCs ، والتفريق في + لقد MAG ، شريان الحياة MBP + لقد أكثر من 6 DIV. في DIV1 ، كل OPCs هي + لقد NG2 ، في حين لا يتم MAG + + هاء أو MBP هاء. في DIV3 ، MAG + + لقد قمت وMBP قليلة هي شريان الحياة واضحا الآن. غالبية عملية شريان الحياة وماج وMBP + اشتركوا في DIV6 ، مع NG2 القليلة المتبقية + OPCs هاء. مقياس شريط ، و 100 ميكرومتر (ج) متوسط ​​القيم ± SD الخلايا OL - النسب في المئة في مراحل مختلفة من التنمية أكثر من 6 DIV. في DIV1 ، كافة الخلايا OL - النسب هي NG2 + هاء ، والمحاسبة لمدة 50 ± 14 ٪ من مجموع خلايا داخل الثقافة. في DIV3 وDIV6 ، OL - النسب حساب الخلايا على التوالي لمدة 36 ± 6.8 ٪ و 32 ± 8.4 ٪ من مجموع الخلايا ، التي تتألف من نسب متفاوتة من NG2 + هاء ، MAG + + لقد وMBP عملية شريان الحياة هاء (د) القيام SDS - PAGE على البروتين المستمدة من الثقافات OL - المخصب مما يدل على التعبير متدرجة من علامات OL - CNP وMBP خلال الفترة DIV الثقافة 6.

الشكل 4
الشكل 4. توصيف بذر DRGN قبل OPC الثقافة. (أ) المرحلة على النقيض من الصور من DRGNs خلال الفترة DIV ثقافة ما قبل 9 OPC البذر. DRGNs تنشأ كما كبيرة جسديا الخلايا مع بعض العمليات ، وإنتاج شبكة neurite معقدة على نحو متزايد. مقياس شريط ، و 100 ميكرومتر (ب) الصور متحد البؤر الثقافات DRGN الثابتة في DIV9 (قبل البذر OPC) وملون لخلية عصبية محددة وعلامات Tuj1 NF200. أنتجت DRGNs شبكة neurite التي قد تكون على المصنف OPCs لإنتاج رأ / DRGN myelinating المشترك الثقافات. مقياس بار ، و 50 ميكرومتر.

الأنف والحنجرة "> الشكل 5
الشكل 5. عملية شريان الحياة المشتركة مع المثقفين نتيجة DRGNs في رأ بوساطة التفاف neurites DRGN مع MBP + غشاء هاء. (أ) صورة 4 - مبائر مجال المونتاج لDIV6 رأ / DRGN الثقافة المشتركة. MBP كثيرة يمكن أن ينظر إلى عملية شريان الحياة + لقد التفاعل مع سرير الكامنة neurite DRGN. مقياس شريط ، و 100 ميكرومتر (ب) عرض تضخيم مبائر MBP من عملية شريان الحياة + لقد التفاف neurites DRGN متعددة. مقياس بار ، و 50 ميكرومتر (ج) التكبير الرقمي في المنطقة تدل في (ب) حيث يتم لف neurite DRGN مع غشاء OL. مقياس بار ، و 25 ميكرومتر.

Discussion

هذا التقرير يصف طريقة لعزل OPCs الفئران عن التمايز في الثقافات OL - OL المخصب أو / DRGN المشترك الثقافات. عند المثقف وحده ، OPCs تفرق في عملية شريان الحياة MBP + هاء ، وإنتاج النخاعين مثل أوراق غشائي. عندما تضاف إلى أسرة DRGN neurite ، شريان الحياة في غلف neurites DRGN مع MBP + غشاء هاء. هذا النموذج يفيد التحقيق في الأسس التي تحكم معقدة رأ بوساطة ensheathment محواري.

في حين أن قيمة كبيرة ، وإنشاء مثل هذه الثقافات يشكل تحديا تقنيا. على وجه الخصوص ، وتشمل الجوانب تطالب كفاءة الهضم الأنسجة / التفكك ، والحفاظ على توازن درجة الحموضة ثقافة الإعلام ، والتغيرات DRGN وسائل الإعلام. من المهم أن نرى أن طول الهضم ، ويجري استيعاب كمية الأنسجة وكمية سحن يؤثر على فعالية ونتيجة نهاية تفارق الأنسجة. ليس من غير المألوف بالنسبة للباحثين من ذوي الخبرة للحصول على غلة الخلوية منخفضة من فصل أنسجة الجهاز العصبي. بالإضافة إلى ذلك ، OPCs الفئران تميل إلى أن تكون حساسة للتغيرات في درجة الحموضة وسائل الإعلام والثقافة ، وخاصة في ظل الظروف القلوية. الحفاظ على الثقافات في CO 2 و 8.5 ٪ يهدف إلى منع حدوث ذلك ، تظهر منذ OPCs على تحمل الظروف الحمضية أفضل بقليل الأساسية. فيما يتعلق DRGNs التغذية ، ويجب إجراء تغييرات وسائل الإعلام بسرعة حتى لا يجفف الخلايا العصبية ، ومع ذلك ، يجب أن يكون لطيف حتى لا تعطل السرير neurite النامية. وسائل الاعلام قد المفاجئ التغييرات طرد من السرير neurite الركيزة ، ويؤدي على الأرجح في التفكك التام من ساترة.

ميزة المحتملة لهذا النظام النموذجي يلقي بظلاله بشكل كبير طبيعته تطالب تقنيا. ميزة واحدة من هذا النظام هو استخدام ما بعد الولادة الفئران لاشتقاق ثقافة الخلية ، ملتفا على ضرورة التضحية تربية الإناث لحصاد الأنسجة الجنينية. ميزة أخرى هي عدم وجود شرط لعوامل النمو (GFS) للتوسع في OPCs. ثقافات مختلطة الدبقية توفير بيئة تدعم نشر OPCs ، ويفترض أن يعود إلى وجود عوامل التغذية نجمية المشتقة. أساليب أخرى ، مثل الاشتقاق عبر neurospheres 7،8 ، تعتمد على خصائص مولد للتفتل من GFS مثل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) ، عامل نمو البشرة (EGF) وصفائح المستمدة عامل النمو (PDGF) للتوسع OPC. وبالمثل ، وذلك باستخدام ما بعد الولادة (P5 - 10) الفئران ليتجنب DRGNs شرط المكمل لثقافة الإعلام مع عامل نمو الاعصاب (NGF) ، وهو عامل التغذية العصبية اللازمة للبقاء على قيد الحياة في المختبر من DRGNs الجنينية 9 و 10. فمن مصلحة لتجنب استخدام NGF كما أنه يؤثر سلبا على قدرة myelinating عملية شريان الحياة عند المثقف مع DRGNs 4. تجنب استخدام GF - تستكمل وسائل الإعلام أيضا فوائد اقتصادية ، إذ أن هذه الكواشف تصبح مكلفة عند استخدامها على نطاق واسع.

ولعل أهم فائدة من هذا النموذج هو ثقافة الاشتقاق من الماوس فقط الأنسجة ، وبالتالي توفير الفرص لاستخلاص كل من OPCs وDRGNs من تشكيلة واسعة من خطوط الفأر المعدل وراثيا. وهذا يسمح لدراسة كل من و / أو DRGN OPC محددة الخصائص التي تحكم تكون الميالين. وسوف يكون هذا أهمية خاصة بالنسبة للتوضيح التفاعلات مستقبلات / يجند تنظيم رأ بوساطة تكون الميالين من المحاور. في كل شيء ، هذه التقنية هي ذات قيمة كبيرة بالنسبة للبحوث علم الأعصاب بسبب تطبيقاتها نحو فهم الاشارات الجزيئية الكامنة وراء تكون الميالين.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذا المشروع من خلال منحة من جمعية التصلب المتعدد لكندا RKRWO هي المستفيدة من دراسية لمن جمعية التصلب المتعدد في كندا. حقوق السحب الخاصة هي المستفيدة من المنح الدراسية ما بعد الدكتوراه من جمعية التصلب المتعدد من كندا والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Multicell 319-005-CL
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Invitrogen 14170-112
Minimum Essential Media (MEM) GIBCO, by Life Technologies 12360-038
Fetal Bovine Serum (FBS) GIBCO, by Life Technologies 10091-148
Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) GIBCO, by Life Technologies 15140-122
GlutaMAX Invitrogen 35050-061
Poly-l-lysine Sigma-Aldrich P2636
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503
Human merosin purified protein (LN2) EMD Millipore CC085
Recombinant rat ciliary neurotrophic factor (CNTF) PeproTech Inc 450-50
L-thyroxine Biochemika 89430
Holo-transferrin Sigma-Aldrich T0665
B27 supplement GIBCO, by Life Technologies 0080085-SA
Bovine insulin Sigma-Aldrich I6634
3,3',5-Triiodo-L-thyronine Sigma-Aldrich I6634
Progesterone Sigma-Aldrich P8783
Putrescine Sigma-Aldrich P7505
Sodium Selenite Sigma-Aldrich S5261
5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FuDR) Sigma-Aldrich F0503
Papain solution Worthington Biochemical LS003126
DNaseI Roche Group 1010159001
L-cysteine Sigma-Aldrich C7352
24-well tissue culture dishes Cellstar 662-160
T25-tissue culture flasks with vent cap Corning 430639
10 cm tissue culture dishes Corning 430167
10 cm petri dish Fisher Scientific 0875713
Collagenase A Roche Group 103578
CellTrics 50 μm filter (optional) PARTEC 04-004-2327
Myelin Basic Protein (MBP) Antibody AbD Serotec MCA409S
NG2 antibody EMD Millipore AB5320
Myelin-Associated Glycoprotein (MAG) antibody EMD Millipore MAB1567
2',3'-Cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNP) antibody Covance SMI-91R-100
Actin pan Ab-5 antibody Fitzgerald 10R-A106AX
Neurofilament-200 (NF) antibody Sigma-Aldrich N4142
Tubulin beta-3 chain (Tuj1) antibody EMD Millipore MAB5544
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11008
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A21422
Alexa Fluor 647 goat anti-rat (IgG) (H+L) secondary antibody Invitrogen A21247
Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody Bio-Rad 170-6516
Goat anti-rat IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-2065
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542

Media Recipes

100X OL-Supplement*

IngredientAmount to add
DMEM100 mL
BSA1.02 g
Progesterone0.6 mg
Putrescine161 mg
Sodium Selenite0.05 mg
3,3',5-Triiodo-L-thyronine4 mg

*Store at -80 °C in 250 μL aliquots

OL media

IngredientAmount to add
DMEM23.75 mL
100X OL-Supplement250 μL
Bovine insulin (from 1 mg/mL stock)125 μL
GlutaMAX250 μL
Holo-transferrin (from 33 mg/mL stock)37.5 μL
B27 Supplement500 μL
FBS125 μL
CNTF (from 50 ng/μL stock)25 μL

Mixed glial culture media (made up in DMEM)

IngredientFinal concentration
FBS10%
Pen/Strep (0.33% from stock)33 units/mL Penicillin and 33 μg/mL Streptomycin
GlutaMAX1%

DRGN media (made up in DMEM)

IngredientFinal concentration
FBS10%
Pen/Strep (1% from stock)100 units/mL Penicillin and 100 μg/mL Streptomycin

Digestion Solution Recipes:

OPC papain solution (made up in MEM)

IngredientFinal concentration
Papain solution1.54 mg/mL
L-cysteine360 μg/mL
DNaseI60 μg/mL

DRG papain solution (made up in HBSS)

IngredientFinal concentration
Papain1.54 mg/mL
L-cysteine360 μg/mL

DRG Collagenase A solution (made up in HBSS)

IngredientFinal concentration
Collagenase A4 mg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Avellana-Adalid, V. Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential. J Neurosci Res. 45, 558-570 (1996).
  2. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
  3. Barres, B. A. Cell death and control of cell survival in the oligodendrocyte lineage. Cell. 70, 31-46 (1992).
  4. Chan, J. R. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43, 183-1891 (2004).
  5. Camara, J. Integrin-mediated axoglial interactions initiate myelination in the central nervous system. J Cell Biol. 185, 699-712 (2009).
  6. Ishibashi, T. Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses. Neuron. 49, 823-832 (2006).
  7. Chen, Y. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat Protoc. 2, 1044-1051 (2007).
  8. Pedraza, C. E. Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors. Glia. 56, 1339-1352 (2008).
  9. Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors. J Neurosci. 12, 1896-1905 (1992).
  10. Greene, L. A. Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons. Dev Biol. 58, 106-113 (1977).

Comments

46 Comments

  1. very nice video and presentation....

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 28, 2011 - 12:44 PM
  2. Nice explanation. I have been carrying out this procedure for some time now and find that it works quite well.

    How many OPCs you generally obtain from a single mouse brain?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 26, 2012 - 4:35 PM
  3. Hi - thanks for your comment, typically I yield about ²00,000 OPCs per mouse brain (on average).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 1:04 AM
  4. Excellent. I am using B6 mice, usually P4-5 (because we also take cerebellar neurons from these same pups). I usually yield between 100-130,000 cells/brain. I see some differences in our protocols (I seed three brains/T75, use trypsin instead of papain, etc.). What steps have you found to dramatically increase your OPC yield post shake-off?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 12:17 PM
  5. The largest factor in OPC yield is the efficiency of your digestion (ie. minimal cell death). In addition, the age of the mice from which you isolate the mixed glial cultures is a factor. I think if you go too far past P², many OPCs will be postmitotic, and therefore limit their proliferation capacity. I usually try to go as young as possible (P0) as this seems to work best. If you absolutely need to use P4-P5, maybe try to culture your monolayers longer than 9 days - try waiting ² weeks prior to shake off. Hope this helps - RO

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 1:06 PM
  6. Thanks for the great info. That is interesting, as many of the protocols for the "DeVellis-method" use different enzymatic preparations (trypsin +/- EDTA, +/- DNAase, papain, etc.). I had basically adapted my rat OPC protocol for mice, but am realizing that they are just not the same. I will trip your papain method and let you know how things pan out. Also, is there a reason you use T²5 flasks instead of combining brains into a T75?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 4:55 PM
  7. No there is no specific reason for using T²5, simply this is what I have always been using. I would imagine combining 3 mice into a T75 flask would roughly be the same thing. Good Luck!

    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 12:00 PM
  8. Hi Ryan, nice video and explanation. Do you do lectin panning to further get rid of microglia or do you find that a 30 min incubation at 37 degrees is enough? Also, how do you know cells are ready to shake? are they always ready at day 9? what do you look for specifically?
    thank you

    Reply
    Posted by: luisa t.
    April 10, 2013 - 12:39 PM
  9. hello...I have gone through this video...very nicely presented...but I have one doubt that if I put the flasks on shaker which only maintains temp and speed but not CO² level, the pH will change...would it not allow the OPCs to survive at all??? and can I use HEPES in medium to solve this problem???
    M willingly waiting for your reply....

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 4, 2012 - 12:35 PM
  10. Thank you for your comment, you are correct in that it will not work without CO² buffering. HEPES buffer will likely not solve this problem either. I'm afraid you will absolutely need to have CO² buffering for this isolation to work.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 11:56 AM
  11. Hi, very INFORMATIVE video, I zalak parikh working on glial cells. In your protocol you are not using any filter after papain digestion but I am facing one problem of Fibroblasts contamination. What could be the possible solution for this problem?
    thank you
    Zalak.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 24, 2012 - 7:59 AM
  12. Hi Zalak, thanks for your comment. What glial cell type are you trying to culture? Oligodendrocytes, astrocytes or microglia? I have never experienced fibroblast contamination.. are you sure they are fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 24, 2012 - 10:47 AM
  13. Hi there. Excellent video, very informative. I was just wondering if you can incubate the flasks in 5% CO² instead of 8% CO²?
    Thanks
    Matt

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 11, 2012 - 12:48 PM
  14. Hi Matt, Actually no, you need to have these at at least 8.5% CO² - otherwise you will have trouble establishing your mixed glial cultures - Good luck

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 11, 2012 - 10:22 PM
  15. Hi Ryan. Very nice video and presentation.
    I have to establish a DRG neuronal culture. Majority of all the papers I've read are using a embryonic source of DRG unlike you using post-natal mouse. What do you think will be the major difference between the cultures of the two??

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 1, 2012 - 12:23 PM
  16. Hi Lipi,
    You're right most papers use embryonic DRGs. The benefit of using post-natal DRGs is that you don't have to sacrifice the mother, and if you use P5-P10 mice, there is no need to use nerve growth factor (in my hands). Embryonic DRG neurons require NGF supplementation to the media for their survival. In terms of the difference between cultures, embryonic dervied ones may have a bit more contaminating cells, since I find they divide pretty quickly. Otherwise I imagine they would be the same as post-natal derived cultures. Good luck!

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    October 1, 2012 - 4:37 PM
  17. Thank you Ryan.

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 3, 2012 - 2:39 AM
  18. Thank you Ryan.

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 3, 2012 - 2:51 AM
  19. Great article Ryan. I had a question for you. Our lab generates mixed glial cell cultures by isolating NPCs from P1 mouse pup brains,expanding the NPCs via neurospheres in the presence of GFs, and then plating the spheres on matrigel for subsequent differentiation without GFs. My main goal in using the neurosphere protocol is to obtain OPCs, but I routinely get only ²0-30% O1+ OPCs following 8 days of differentiation on matrigel. GFAP+ astrocytes seem to dominate the whole culture, with OPCs growing on top of them. I wanted to try to incorporate your protocol into the neurosphere protocol by dissociating the spheres using TrypLE or Accutase, plating them on Poly-D-Lysine, letting the astrocytes grow to confluency while having OPCs proliferate on top, and then use the shaking technique to isolate OPCs. Do you think this is possible? When we perform in vitro studies with the NPCs, we usually plate the neurospheres on matrigel for a day and then trypsinize the cells for seeding into new dishes. Not only do I think the trypsin digest kills many OPCs, but I also remove astrocytes from the matrigel that then contaminate my cultures. Thanks for the help!

    Reply
    Posted by: Brett M.
    November 3, 2012 - 7:37 PM
  20. Hi Brett - To answer your question, yes I think it would be possible to do what you are suggesting. However, it seems to be a pretty roundabout approach. I think the more streamlined approach would be to simply seed your dissociated P1 neural cells onto PLL substrate to generate a monolayer. That way you would avoid having to generate neurospheres (which I imagine takes about 10 days) and then subsequently generating an astrocyte monolayer with the spheres (which would take another 10+ days). In my experience, OPCs don't like trypsin. If you wanted, you could try 0.05% Trypsin instead of 0.²5% and that seems to be more gentle. And if you don't incubate for too long, most astrocytes should remain on the plate. Hope this helps! -Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    November 5, 2012 - 12:14 PM
  21. Ryan, thanks for the help! I tried your protocol and everything appeared to go well. However, one issue I ran into occurred during the overnight shaking step and subsequent differential adhesion assay to isolate a more pure population of OPCs. What I noticed was that after the overnight shaking I had many large oligospheres (maybe 10-²0 cells in size). These spheres did not stick down during the 30 minute plate incubation and I had difficulties trying to dissociate them as you described using the P1000 and P²00 tips. When I took the cells counts and plated the cells onto chamber slides, many smaller clumps remained and stuck down to the matrix. However, the clumps did not flatten out on the gel matrix very well (like neurospheres do) and eventually flaked off after about 5 days of cultures, leaving only sparse population of OPCs. Have you ever encountered this problem? I was thinking of seeding at a higher cells density than what you describe in the protocol.

    Reply
    Posted by: Brett M.
    December 2, 2012 - 10:21 PM
  22. Hi Brett - sounds like you're doing everything right. Normally I see lots of these "oligospheres" as a result of the overnight shaking protocol. However, I find that these are not the majority of OPCs, as there are many single cells and cells in clumps of ²-4. The oligospheres are difficult to dissociate, and due to this, I generally do not go out of my way to try and break them up. In my hands, these spheres spread out very nicely after about ²4hrs on Laminin-² substrate. You can try to seed at higher densities if you like, but the seeding density should be determined based on the experiment you want to conduct. For example, if you want to perform immunocytochemistry, it may not be ideal to have a very dense cell culture. Also, it's possible the clumps aren't super compatible with your matrix substrate - I always use Laminin. I hope this helps :)

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    December 3, 2012 - 11:42 AM
  23. HI Ryan, very informative and nice presentation. I have tried your protocol and everything seem to work fine except at the overnight shaking. There were very few OPCs isolated and it seems there are still many OPCs adhere to the astrocytes. Have you encounter this issue?

    Reply
    Posted by: Esther W.
    December 13, 2012 - 3:25 AM
  24. Hi Esther, Thanks for your comment. How many OPCs are you yielding per mouse? I usually yield on average ²00,000 OPCs per mouse brain, but this is quite variable. At times I have yielded 500,000 or 50,000 per brain, and I'm not sure what accounts for this variability. In any case, you will never dissociate 100% of the OPCs from the monolayer, I've noticed a lot remain stuck. My advice would be to simply give it another shot and see if your yields are a bit higher next time. Hope this helps - RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    December 16, 2012 - 5:35 PM
  25. Thanks Ryan for your advice. My yield is definitely much lower than yours. I will definitely try another round. :)

    Reply
    Posted by: Esther W.
    December 16, 2012 - 8:24 PM
  26. HI Ryan, I face the problem of getting immature OPC instead of mature OPC after 6 days of OL-enriched culture. What is your view?

    Reply
    Posted by: Esther W.
    January 23, 2013 - 2:51 AM
  27. Hi Esther, you should always expect to have some OPCs that don't differentiate during the timecourse. However, the majority of OLs should at least be expressing MAG, if not MBP at DIV6. My guess would be that your media is not exactly correct. Make sure that all the ingredients are at the correct concentration in your 100x OL-supplement stock - especially tri-iodothyronine and L-thyroxine (4mg per 100mL). I hope this helps, let me know if you still have problems.

    Posted by: Ryan O.
    January 23, 2013 - 12:56 PM
  28. Thanks Ryan for replying. I have added tri-iodothyronine only as there is no mentioned of L-thyronine in the 100x OL-supp recipe. Can i still add L-thyronine when the OL-enriched is on DIV5?

    Posted by: Esther W.
    January 23, 2013 - 8:05 PM
  29. Thanks for notifying me of this mistake, I'll notify the editorial team ASAP. Yes you can try to add it on DIV5, but no guarantees this will drive them any farther since they are aleady 5 days in. Give the protocol a second try, and let me know if the lack of differentiation still occurs. -Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    January 24, 2013 - 12:47 AM
  30. Hi Luisa thanks for your comment :) I don't do lectin panning, as I find that incubation on the culture plates is enough to get rid of most of them, but if you're having a problem with microglia that is an additional option. I usually shake on day 9, but I've found you can shake anywhere from 9 to 1² days, but any longer than that you will get less OPCs. Generally if you see a lot of cells on top of the astrocyte monolayer, they are ready to go. However in my experience this dŒsn't really happen before day 9. Hope this helps RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    April 10, 2013 - 2:28 PM
  31. Hi Ryan.Thanks for this protocol. I did exactly what you have described in this protocol, except the shaking step. I did it without CO2, but the caps are tightly sealed, how is it possible that CO2 will effect pH of tightly sealed flask? My yield was very low, besides I had fibroblast contamination as well. I used uncoated flasks as well, because once during the shaking all the layer came off the bottom of the flask, what do you think would be the reason for this?.And in my experience when FBS is used in OPC culture media it made OPC's to differentiate to astrocytes rather then oligodendrocytes.Overall I couldnt replicate this procedure unfortunately and trying to find other methods..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 20, 2014 - 5:33 PM
  32. Hi Aysel - from what you describe in your message, you didn't follow my protocol.

    1) So you didn't shake the flasks? Or you didn't use the same method of shaking?

    2) As far as I know, all standard tissue culture incubators have some level of CO2 buffering (usually 5%). Strictly speaking, if you tighten the cap of your flasks, there will be no gas exchange between the incubator and the flask, if you are using plugged caps. I use vent-capped flasks (0.22um pore), so gas exchange occurs between the flask and the incubator when the caps are tight. To answer your question, CO2 buffering will have little-to-no effect on the pH of the media if you are using tightly-screwed plugged flask caps.

    3) I haven't experienced fibroblast contamination in my cultures, I imagine this would be a dissection issue. The only source of fibroblasts I can imagine would be from the meninges, so be sure to fully remove this prior to dissociation of the cortex. Unless you are confusing fibroblasts for astrocytes. Too many astrocytes is a result of too much agitation at the differential adhesion step.

    4) I have always used coated flasks, in my experience OPCs will not adhere to uncoated surfaces. I am willing to bet you'll get almost no OPCs if you continue to use uncoated flasks. If you want you can try to use other substrates such as PDL, poly-O-ornithine, collagen etc.

    5) I haven't noticed any significant transformation of OPCs into astrocytes in the presence of FBS. I imagine this might occur more frequently in immortalized OPC cell lines. Perhaps that's what you are thinking of.

    I hope this helps, otherwise best of luck in your research.

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 20, 2014 - 8:52 PM
  33. Hi Ryan, thank you ver much for detailed answer. Sorry for my english, i couldnt explain good.
    I did the shaking of course but without putting shaker inside the CO2 incubator, I did shaking at 37 degree incubation only and at 180 rpm. Because the flasks are uncoated(I have used uncoated flasks for rat OPC"s without problem, that is why I tried this way with mouse as well) I hesitated to increase rpm to 240 or so, to prevent astrocyte detachment, and I also think that fibroblast contamination is because of the meninges. Second time I will prevent it.
    It is good to know that I must use coated flasks, I will try again, if you say so.
    Thank you so much, good luck to too..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 21, 2014 - 6:22 AM
  34. Hi Again,
    Alright - I strongly suggest to put the shaker in the incubator for the overnight shake, as I have found this to be a crucial step in maintaining pH balance. The media on your cells should always be a rich red colour (indicative of a balanced pH) all the time. Mouse OPCs are very sensitive to pH, and will die with too much fluctuation. If during your shaking, the media becomes at all purple-ish or yellow-ish, your OPC yield will drastically reduce. I wouldn't be surprised either if this was a contributing factor to the monolayer detachment you experienced previously. There is a significant difference in the in vitro behaviour/viability of mouse OPCs as compared to rat, hence the generation of this protocol. Your best bet is to simply follow this protocol exactly as is.

    Thanks for your comment, and good luck,
    Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 21, 2014 - 12:25 PM
  35. Hi.
    One more question Ryan, about amount of the brains seeded, I was seeding 2 rat brains/ T75 flask , in the mouse case to obtain same amount of cells seeded I was using 6 brains per flask. Would you suggest to use 3-4 instead of six? and if i seed 6 animals should I increase concentration of insulin added to mixed culture media? Overall what would be optimum amount of brains per T75 flask in your opinion? Does it matter to much? Because here you use 1 brainper T25 flask.
    Thanks again..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 26, 2014 - 4:20 PM
  36. Hi Aysel,
    Again, your best bet for success is to follow the protocol exactly as is - T25 flasks are what this method has been optimized for. I suppose T75 flasks have 3 times the surface area, so in theory 3 mice would have to be seeded to a T75 to yield the same cell density. I've never tried this protocol with T75 flasks, and I know that different culture vessels have different impact on growth and survival of OLs.
    Best - RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 27, 2014 - 10:47 AM
  37. Hi Ryan . I want to say that I replicated the procedure exactly as here, and have got very good yield, but I have 1 more question to you, majority of OPCs die in the differentiation media after 6-7 days of incubation. You indicated that it is important not to distrub them until fixation, but how do you do the medium chage, I put 1 ml media first day and did 2/3 media change each 3 days, I seeded all cells to one 24 well format plate, at each time points(3 d, 6 d, 9 d) I transfer the slides to new plate and fix them there and do medium change for rest of the slides. By the way I culture OPCs at 5% CO2, becaue I have only 2 options 5% and 10%, i cant adjust ph of the incubators at this time point. Is it the contributing factor for death of the cells after 4-5 days of incubation?

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    March 19, 2014 - 2:43 PM
  38. Hi Aysel - I'm glad to hear things are looking up -

    1. I don't suggest differentiating the OLs for longer than 6 days. If you're finding they are not differentiating fast enough, you can add 4 mg of L-Thyroxine to the 100X OL-supplement (see the media recipe list above).

    2. It is normal to lose OLs over the time course of differentiation. That being said, you don't want to encourage death by moving the cells or culturing at low pH. You should not be changing the media of the purified OL cultures at any point - they do not require media changes. The protocol also says to culture the OLs at 8.5% CO2. Since you have access to both 5 and 10% CO2 incubators, and 8.5 is closer to 10 than it is to 5, I suggest culturing them at 10%.

    3. Rather than culturing all of your time points in one dish, use 3 dishes (one for 3 days, one for 6 etc). That way, you won't have to disturb your other time points.

    4. Do not remove the coverslips from the wells of your 24 well dish during fixation - simply add concentrated PFA directly into the media and allow to fix for about 15 mins at room temp.

    Sounds like you're almost there, Best of luck - Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    March 19, 2014 - 3:58 PM
  39. Let me write it again to see if I have understood you correct, you say dont do any media change ever, neither at 3 days or 6 days or further? The other things I will try what you suggest, culturing and seeding in different plates at 10% CO2
    I want to thank you a lot for your help and all of the explanations.
    Thanks ..
    Best,
    Aysel

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    March 19, 2014 - 4:22 PM
  40. Thats correct :)
    You're very welcome,

    Ryan

    Posted by: Ryan O.
    March 19, 2014 - 5:49 PM
  41. Hi Ryan,

    Thanks for sharing this protocol, looks really good and will try it out. I have a couple of questions regarding your protocol and was hoping you could shed some light on some problem I am experiencing at the moment.

    With regards to what you have just described, we actually perform a very similar mixed glial culture on P0-P3 rat brains. Our isolation stages are very similar with the exception we use DNAse1 and L-cysteine along with Papain. Upon plating our cell suspensions the flasks are densely populated with microglia on top, then opc's below and then astrocytes. We basically shake off our microglia before doing the overnight shake for the OPC's.

    My question is how do you get rid/ not see any microglia in your mouse cultures? Is it also possible to obtain microglia from your method?

    We are currently experiencing problems with obtaining OPC's from our overnight shake (in rat). The cells look healthy when in culture with the microglia but once the microglia are removed and we perform the steps required to plate the OPC's we have a lot of contaminants in with the cells, almost like long fibrous structures that are stained by trypan blue. We still obtain + 5 million OPC's but the cells do not look healthy and the morphology is not consistent with OPC's. Upon plating these cells they fail to show characteristics of OPCs and a lot die off. I will mention we do not shake in an incubator but in an orbital shaker at 250rpm with the caps sealed tight and parafilm. Have you ever encountered this?

    Many thanks .

    Reply
    Posted by: Graeme I.
    February 9, 2015 - 1:06 PM
  42. Hi Graeme, thanks for your question.
    We do in fact get microglia in our mixed cultures, but we remove them prior to the overnight shake with a slow short shake (as in the rat method). These shaken off microglia are a very pure population, and can be cultured separately if desired.
    With regard to the problems you’re encountering shaking your rat cultures, I can’t say I’ve experienced anything quite like what you’re describing. It almost sounds like your cultures are suffering from contamination (maybe yeast?). We’ve experienced contamination a couple of times, and it resulted in much of the monolayer dissociating from the base of the flask during the overnight shake. If you like, you can send me a pic of the fibrous structures in the hopes that I could recognize what they are (romea077@uottawa.ca).
    We have never had luck shaking flasks in an orbital shaker – we exclusively use tissue culture incubators with vented caps. One risk of using an orbital shaker is they pose a threat for contamination, as they are often used for bacterial cultures.
    I hope this helps and best of luck,
    Ryan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 20, 2015 - 11:12 AM
  43. Hi Ryan,

    Thanks for your reply.

    I tried the protocol and achieved very nice OPC's so everything seems ok there.

    With regards to what I was seeing after my rat OPC shake, I believe it not to be of any contamination but more something coming out of solution in our media. As a test I shook DMEM10% in a T75 flask, 37 degrees, 250rpm overnight. The next day I took an aliquot and looked at it with trypan blue. To my surprise I saw the same fibrous clumps that I was seeing after the OPC shake

    . My DMEM only contains FBS and pen-step so this has to be something in FBS. My most recent shake off I decided to shake off 5 flasks with DMEM 10% and 5 flasks with OPC media (our OPC media contains 2.5ml FBS vs 50ml in DMEM). The next day after following normal protocol I counted the cells from both conditions. The OPC media flasks had almost none of the fibrous clumps whereas the DMEM flasks had alot. I can now partially get round this problem by filtering with 40uM strainer but have you ever heard or seen this kind of thing. We have used several batches if FBS so it cannot be that every batch has precipitated proteins in it but perhaps what were doing is causing precipitation of FBS proteins that are affecting the OPC's?

    Thanks

    Graeme

    Reply
    Posted by: Graeme I.
    March 15, 2015 - 4:16 PM
  44. Hi Ryan,

    Is your FBS from Invitrogen decomplemented ? If so did you buy decomplemented or did you heat it at 56*C and for how long.

    Thanks

    Reply
    Posted by: Ludovic D.
    February 24, 2017 - 10:40 AM
  45. Hi Ludovic,
    I've used FBS that has been heat-inactivated by the manufacturer, and I've also used FBS that I've heat inactivated myself. For the latter, if memory serves, about 30 minutes at roughly 50 degrees C should do the trick (water bath).
    Good luck, Ryan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 26, 2017 - 11:49 AM
  46. Hi Ryan,
    I am wondering if you have any experience with adding Cre Recombinase Adenovirus to the cultures? And if you think a particular day would be best to add it? I was thinking of adding it on D8 (1 day before the full media change) but wasn't sure if adding virus and then shaking the cells would cause too much stress?
    Thanks,
    Megan

    Reply
    Posted by: Megan R.
    April 30, 2018 - 2:39 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics