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Ableitung von Enriched Oligodendrozyten Kulturen und Oligodendrozyten / Neuron myelinisierenden Co-Kulturen von Post-Natal Mausgeweben

Neuroscience
 

Summary

Dieser Artikel beschreibt Methoden zur Ableitung von angereicherten Populationen von murinen Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) in primären Kultur, die, um zu reifen Oligodendrozyten (OLS) produzieren differenzieren. Darüber hinaus beschreibt dieser Bericht Techniken zur Herstellung murine myelinisierenden Co-Kulturen durch Impfen Maus OPCs auf einen Neuriten Bett Maus Spinalganglien Neuronen (DRGNs).

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O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues. J. Vis. Exp. (54), e3324, doi:10.3791/3324 (2011).

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Abstract

Identifizierung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen OL Entwicklung ist nicht nur entscheidend für die Förderung unserer Kenntnis der OL Biologie, sondern hat auch Implikationen für das Verständnis der Pathogenese der demyelinisierenden Erkrankungen wie Multiple Sklerose (MS). Cellular Entwicklung wird allgemein mit primären Zellkultur-Modellen untersucht. Primäre Zellkultur erleichtert die Auswertung eines bestimmten Zelltyp durch die Bereitstellung einer kontrollierten Umgebung, frei von der Störvariablen, die in vivo sind. Während OL Kulturen von Ratten abgeleitet eine große Menge an Einsicht in OL Biologie zur Verfügung gestellt haben, hat ähnliche Bemühungen zur Schaffung OL Kulturen aus Mäusen, die mit großen Hindernissen erfüllt. Entwicklung von Methoden zur Kultur murine primäre OLs ist zwingend notwendig, um die Vorteile der zur Verfügung stehenden transgenen Mauslinien zu nehmen.

Mehrere Methoden zur Extraktion von OPCs von Nagetier Gewebe beschrieben worden, von Neurosphäre Ableitung, Differential Haftung Reinigung und immunopurification 1-3. Während viele Methoden Erfolg bieten, verlangen die meisten umfangreichen Kultur-mal und / oder teure Ausrüstung / Reagenzien. Um dies zu umgehen, ist reinigend OPCs aus murinen Gewebe mit einer Anpassung der Methode ursprünglich von McCarthy & de VELLIS 2 beschrieben bevorzugt. Bei dieser Methode wird die räumliche Trennung OPCs aus einer gemischten Gliazellen Kultur von neugeborenen Nagern Cortex abgeleitet. Das Ergebnis ist eine gereinigte OPC Bevölkerung, die in eine OL-angereicherten Kultur unterschieden werden können. Dieser Ansatz ist aufgrund seiner relativ kurzen Kulturzeit und der unnötige Voraussetzung für Wachstumsfaktoren oder Immunopanning Antikörper ansprechend.

Während der Erkundung der Mechanismen der OL Entwicklung in eine gereinigte Kultur ist informativ, bietet es keine der physiologisch relevanten Umfeld für die Beurteilung der Myelinscheide Bildung. Co-Kultivierung OLS mit Neuronen würden Einblick in die molekularen Grundlagen zur Regelung OL-vermittelte Myelinisierung von Axonen zu verleihen. Für viele OL / Neuron Co-Kultur-Studien haben Spinalganglien Neuronen (DRGNs) nachweislich das Neuron Art der Wahl sein. Sie sind ideal für Co-Kultur mit OLs durch ihre einfache Extraktion, minimale Menge an kontaminierenden Zellen und die Bildung von dichten Neuriten Betten. Während Studien mit Ratte / Maus myelinisierenden xenocultures veröffentlicht worden sind 4-6, ein Verfahren zur Ableitung solcher OL / DRGN myelinisierenden Co-Kulturen von postnatalen murinen Gewebe wurde nicht beschrieben. Hier präsentieren wir Ihnen detaillierte Methoden auf, wie man effektiv produzieren solche Kulturen, zusammen mit Beispielen von den erwarteten Ergebnissen. Diese Methoden sind nützlich für die Behandlung relevanten Fragen OL Entwicklung / myelinisierenden Funktion und sind nützliche Werkzeuge im Bereich der Neurowissenschaften.

Protocol

Ethics Statement

Die Mäuse in dieser Arbeit verwendet wurden gemäß den kanadischen Rates über Animal Care (CCAC) Richtlinien betreut. Ethische Zulassung für Experimente wurde von der University of Ottawa Animal Care Committee unter Protokoll-Nummer OGH-119 erhalten.

1. Dissection - neonatalen Maus Kortex für die OPC-Extraktion

  1. Sacrifice P0-P2-Maus nach den Richtlinien des Instituts.
  2. Präparieren Sie die Gehirn und in eine Petrischale mit eiskaltem MEM (Antibiotika-frei).
  3. Übertragen Sie die Schüssel zu einer Dissektionsmikroskop.
  4. Mit einem Skalpell mit dem Gehirn dorsal nach oben, um einen flachen Schnitt sagittal entlang der medialen Kante der Hirnrinde (Abb. 1a). Dieser Schnitt sollte nur durch die Hirnhäute Schicht übergeben, um deren Entfernung zu erleichtern.
  5. Verwenden Sie feine Spitze Pinzette Abziehen der Meningen in eine seitliche Mode. Wenn es vorsichtig, kann diese Schicht in einem Stück entfernt werden. In diesem Schritt entfernen Sie die Riechkolben.
  6. Mit dem Gehirn Bauchseite-up, einen tiefen Einschnitt sagittal, wo die Rinde entspricht dem ventralen Bereich des Zwischenhirns (Abb. 1b).
  7. Mit dem Gehirn dorsal-up, trennen Sie die Rinden vom Mittelhirn von neugierigen das Gewebe in einer medial nach lateral Mode (Abb. 1c, c '). Entfernen Sie alle verbleibenden Meningen bei diesem Schritt.
  8. Dice jeder Kortex in ca. 4 Stück und schonend in ein 15 ml konische Röhrchen mit 350 ul MEM pro Maus Gehirn zu übertragen. Halten Sie das Röhrchen auf Eis, bis alle Mäuse verarbeitet worden sind.
  9. Wiederholen Sie die Schritte 1,1-1,8 für die übrigen Mäuse.

2. Die Dissoziation von Neugeborenen Kortex und Wartung von gemischten Gliazellen Kulturen

Hinweis: Die Einführung von Blasen in der Zellsuspension sollte während alle der folgenden Schritte vermieden werden.

  1. Die 15 ml konische Röhrchen mit den frisch präparierten Gehirnen zu einem 37 ° C Wasserbad für 3 min.
  2. Transfer Gehirn, um eine sterile Gewebekultur Kapuze.
  3. Vorsichtig passieren gewürfelt Kortex durch einen P1000 Pipettenspitze in kleinere Fragmente zu generieren. Stoppen Pipettieren einmal dort kein Gehirn Stücke sind groß genug, um einen reibungslosen Ablauf der Suspension durch die Pipettenspitze zu stören.
  4. Add 75 ul OPC Papain-Lösung pro Kopf in den konischen Rohr. Die OPC-Papain-Lösung muss bei 37 vorgewärmt werden ° C für 20 min vor dem Gebrauch.
  5. Inkubieren bei 37 ° C Wasserbad für 20 min. Etwa alle 2 Minuten sanft das Röhrchen, um Gewebe-Aggregation verhindern. Während dieser Zeit werden 5 ml der gemischten Gliazellen Kulturmedien zu jedem Poly-L-Lysin (PLL) beschichtet (1 mg / mL) T25 Kolben (eine Flasche pro Maus Gehirn), und in einem 37 ° C Gewebekultur-Inkubator bei 8,5% CO 2.
  6. Nach 20 min wieder das Gewebe Suspension auf die sterile Haube und 2 mL von gemischten Gliazellen Kulturmedien pro Kopf um das Rohr. Lassen Sie sitzen für 10 Minuten bei Raumtemperatur zur Inaktivierung des OPC Papain-Lösung zu ermöglichen.
  7. Aliquot des Gewebes Suspension in 5 ml Plastikröhrchen. Die Anzahl der Rohre muss mit der Anzahl der Gehirne seziert, was in etwa 2,5 ml pro Röhrchen.
  8. Mit einem sterilen schwer poliertem Glas Pasteur Pipette vorsichtig verreiben das Gewebe in jeder Röhre. Man reibt zunächst langsam, nach und nach die Geschwindigkeit erhöhen, als Stücke zu distanzieren. Man reibt ca. 10-15 mal, aber diese Zahl kann basierend auf der Wirksamkeit der Verdauung variieren.

Hinweis: Unter-Verreibung wird in armen Dissoziation des Gewebes führen, während over-Verreibung wird sich negativ auf die Lebensfähigkeit der Zellen auswirken. Es ist wichtig, nicht einführen Blasen in die Lösung, da dies ernsthafte Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen.

  1. Sobald keine sichtbaren Gewebe Klumpen übrigen in der Suspension sind, zu einem 50 ml konischen Röhrchen mit 4 ml der gemischten Gliazellen Kulturmedien pro Kopf (dh 4 Köpfe = 16 mL gemischten Gliazellen Kulturmedien) zu übertragen.
  2. Vorsichtig auf den Kopf der 50 mL konischen Rohr, und wiederholen Sie für die restlichen 5 ml-Röhrchen.
  3. Aliquot der gepoolten Zellsuspension in 15 ml konische Röhrchen (ca. 6,5 ml pro 15 ml Tube). Die Zahl der 15-ml-Röhrchen mit der Anzahl der Gehirne seziert.
  4. Zentrifugieren bei 1200 Umdrehungen pro Minute (~ 300 g) für 5 min.
  5. Vorsichtig absaugen des Überstandes und 1 mL warmen gemischten Gliazellen Kulturmedien zu je 15 ml konischen Rohr.
  6. Langsam das Pellet mit einem P1000 Pipettenspitze man aufpassen, nicht zu Blasen führen. Fügen Sie die Zellsuspension aus jeder Röhre ein voräquilibriert PLL-beschichteten T25 Kolben, wodurch die Gesamtmenge der Kulturmedien zu 6 mL.
  7. Legen Sie die Flaschen in einem Gewebekultur-Inkubator für 3-4 Stunden, damit die Zellen an die PLL Substrat befestigen. Führen Sie eine vollständige Medienwechsel durch Pipettieren aus den Medien und Zugabe von 6 ml frischem gemischten Gliazellen von Nährmedien in die Flaschen. Dieser Schritt entfernt einen Großteil der Trümmerverursacht durch die Verreibung und fördert die Kultur Lebensfähigkeit. Wenn OL / DRGN Co-Kulturen gewünscht werden, § 3 dieses Protokolls beziehen.
  8. Nach 3 Tagen Kultur, führen Sie eine 2 / 3 Medien ändern, indem 4 mL von Medien und Ersetzen mit 4 ml frisch gemischten Gliazellen Kulturmedien. An dieser Stelle sollte ein Astrozyten Monoschicht auf der Basis der Flaschen werden bilden.
  9. Am Tag 6, führen Sie einen anderen 2 / 3 Medien ändern und ergänzen die Flaschen mit einer Endkonzentration von 5 mg / ml Insulin. An dieser Stelle sollte ein Astrozyten Monoschicht deutlich sichtbar sein, auf dem sich OPCs werden proliferierenden wird.

3. DRGN Isolation

Hinweis: Zur Herstellung von OL / DRGNs Co-Kulturen, DRGNs etablierten sollte am Tag nach gemischten Gliazellen Kultur Generation. Beide Typen sind unabhängig Kultur gewachsen, und kombiniert nach 9-10 Tagen.

  1. Sacrifice P5-P10 Maus nach den Richtlinien des Instituts.
  2. Entpacken Sie die Wirbelsäule und die Übertragung auf eine saubere Petrischale.
  3. Trim entfernt so viel Muskeln und Knochen aus der Wirbelsäule wie möglich (Abb. 1d, d '), da dies die Zerlegung der Spinalganglien (DRGs) zu erleichtern.
  4. Übertragen Sie die getrimmt Wirbelsäule, um eine neue Petrischale Bauchseite-up. Mit Dissektion Schere und beginnt kaudal, medial Schnitt durch die Wirbelsäule in eine longitudinale Mode.
  5. Mit zwei Pinzetten, hebeln öffnen Sie die Wirbelsäule das Rückenmark freizulegen.
  6. DRGs können unter gefunden werden und lateral des Rückenmarks. Mit feinen Spitzen einer Pinzette vorsichtig entfernen Sie die DRGs, während Vermeidung von Schäden an den Ganglien (Abb. 1e).
  7. Übertragen Sie die entfernt DRGs gepuffert Salz eiskalte Hank-Lösung (HBSS, Antibiotika-frei) in eine neue Petrischale. Die Dissektor sollte Ziel auf 40 DRGs pro Maus (Abb. 1f) zu extrahieren.
  8. Sobald die DRGs extrahiert wurden, schneiden Sie die DRGs einer übermäßig langen Wurzeln (Abb. 1 g, g '), um die Einführung von kontaminierenden Zellen in der Kultur (Glia-Zellen, Fibroblasten) zu minimieren.
  9. Übertragen Sie die DRGs zu einer 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen mit 500 mL eiskaltem HBSS.
  10. Zentrifugation bei 1200 rpm (~ 300 g) für 5 min bei 4 ° C zu Pellets der DRGs.
  11. Übertragen Sie die Zentrifugenröhrchen in eine sterile Gewebekultur Haube und entfernen Sie die HBSS aus den Rohren.
  12. Add 500 mL vorgewärmtes (20 min bei 37 ° C) DRG Papain-Lösung, und die Röhrchen in einem 37 ° C Wasserbad für 10 min. Kehren Sie die Rohre alle 2 min, um Gewebe-Aggregation verhindern.
  13. Wiederholen Sie Schritt 3.10.
  14. Entfernen Sie die DRG Papain-Lösung und fügen 500 mL vorgewärmtes (20 min bei 37 ° C) Collagenase A-Lösung. Inkubieren bei 37 ° C Wasserbad für 10 min, Invertieren alle 2 min.
  15. Wiederholen Sie Schritt 3.10.
  16. Überstand entfernen und 1 mL DRGN Medien. Röhrchen mehrmals kippen.
  17. Wiederholen Sie Schritt 3.10.
  18. Wiederholen Sie Schritt 3.16.
  19. Coat ein steriles schwer poliertem Glas Pasteurpipette mit Rinderserumalbumin (BSA) durch Pipettieren einer Lösung von 0,25% BSA in HBSS mehrmals. Die Beschichtung mit BSA-Lösung wird der DRGs aus an den Wänden der Glaspipette zu verhindern.
  20. Man reibt die DRGs mit dem BSA-beschichteten Pipette vorsichtig auf den ersten, und mit zunehmender Intensität einmal Klumpen beginnen distanziert. Man reibt ca. 10-15 mal, aber diese Zahl ist abhängig vom Grad der Verdauung, und die Anzahl der DRGs pro Röhre.
  21. Nach Dissoziation erreicht ist, passieren die Suspension durch ein 50 um-Filter in eine sterile Petrischale mit 7 ml DRGN Medien. Filtration beseitigt einen Großteil der Trümmer aus der Zellsuspension, obwohl dieser Schritt ist nicht kritisch.
  22. Inkubieren Sie die Petrischale mit 8,5% CO 2 für ca. 1,25 Stunden.
  23. Coat mehrere 12 mm Deckgläser mit LN2 (10 ug / mL in PBS) in einer 24-well Schale während dieser Inkubationszeit.
  24. Nach der Inkubation beendet ist, beachten Sie die Petrischale unter Hellfeld. DRGNs werden als große Körper, dunkle Phase-Zellen identifiziert. Swirl der Petrischale vorsichtig, um keine eingehalten DRGNs Aufzug.

Hinweis: Viele kontaminierenden Zellen wird stark auf die Petrischale geklebt haben, damit Anreicherung Ihrer Zellsuspension für DRGNs.

  1. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 15 ml konischen Rohr. Vorsichtig spülen Sie die Schale mit 4 ml DRGN Medien, um restliche DRGNs sammeln. Übertragen Sie die zusätzlichen 4 mL der konischen Rohr.
  2. Zentrifugieren Sie für 5 min bei 1200 rpm (~ 300 g).
  3. Saugen Sie den Überstand und das Pellet in 500 ml frisches DRGN Medien.
  4. Berechnen Sie die Anzahl der ergab DRGNs mit einer Zählkammer. Achten Sie darauf, zählen nur die DRGNs, und nicht andere Zelltypen. DRGNs können durch ihre großen kugelförmigen Zellkörper identifiziert werden.
  5. Seed 30.000-50.000 DRGNs jedem LN2-beschichteten Deckglas in 1 ml DRGN Medien und in einem 37 ° C Gewebekultur-Inkubator mit 8,5% CO 2 über Nacht.
  6. Am nächsten Morgen, führen Sie eine vollständige Medien ändern, indem die DRGNMedien mit OL Medien (minus CNTF) mit einer Endkonzentration von 1% Pen / Strep und 10 uM FUDR.
  7. An den Tagen 3 und 5, führen Sie eine 3 / 4 Medien ändern sich mit den gleichen Medien wie in Schritt 3.30.
  8. Am Tag 7, eine vollständige Medien ändern sich mit OL Medien (minus CNTF, Pen / Strep, FUDR).
  9. Am Tag 9, sollte der DRGNs ein umfangreiches Neuriten Bett gebildet haben, und sind nun bereit zu sein Co-Kultivierung mit OPC.

4. Reinigung von OPCs aus gemischten Gliazellen Kulturen für die Einrichtung eines OL-angereicherten Kulturen oder OL / DRGN Co-Kulturen

  1. Am Tag 9 der gemischten Gliazellen Kultur, überweisen Sie den Kolben auf einem Schüttler in einer 5% CO 2 Gewebekultur-Inkubator. Legen Sie die Flaschen auf der leeren Flaschen T25 keine Wärme aus dem Orbitalschüttler generiert nicht negativ auf die gemischten Gliazellen Kulturen zu verhindern. Lassen Sie den Kulturen auf diese neue Inkubator für 1 Stunde ausgleichen.
  2. Sobald der Kolben ausgeglichen haben, schütteln Sie die Kolben bei 50 rpm für 45 min. Der Zweck dieser Shake ist keine lose anhaftenden verunreinigenden Zellen aus dem Monolayer zu entfernen.
  3. Bewegen Zellen einer Gewebekultur Haube und entfernen Sie alle Medien aus dem Fläschchen. Ersetzen mit 4 ml frisch gemischten Gliazellen Kulturmedien mit 5 pg / ml Insulin ergänzt.
  4. Setzen Sie den Kolben wieder auf die Shaker, und lassen Sie sie für etwa 3 Stunden ruhen.
  5. Sobald der Kolben ausgeglichen sind, sind sie fest mit dem Schüttler, und schütteln Sie die Flaschen für ca. 16 Stunden bei 220 Umdrehungen pro Minute (über Nacht).
  6. Am nächsten Morgen, wenn ole sind in Abwesenheit von DRGNs (dh OL-angereicherten Kultur), Mantel mehrere sterile 12 mm Deckgläser mit LN2 (10 ug / mL in PBS) für 1 Stunde angebaut werden. Übertragen Sie die Deckgläschen in 24-Well-Schalen mit PBS waschen, gefolgt von einer OL Medien zu waschen. 1 ml der OL Medien in jede Vertiefung und Gleichgewicht bei 8,5% CO 2.
  7. Äquilibrieren 10 cm Gewebekulturschalen bei 5% CO 2 für 30 min. Eine Schüssel wird für jeweils 2 Flaschen benötigt werden. Diese werden für die differentielle Haftung Bereicherung des suspendierten OPCs verwendet werden.
  8. Sobald die 30 min Äquilibrierung abgelaufen ist, übertragen Sie die Medien aus dem Schüttelkolben auf die Gerichte. Jedes Gericht sollte Medien von 2 Flaschen erhalten, das entspricht ca. 8 ml Zellsuspension pro 10 cm Schüssel.
  9. Inkubieren Sie die Gerichte bei 5% CO 2 für 30 min und bietet gleichzeitig einen sanften Schubs im 15 min Marke. Dieser Anstoß wird verhindert, OPCs an der Einhaltung der 10 cm Schüssel.
  10. Nach der Inkubation abgeschlossen ist, prüfen die Gerichte unter Hellfeld. OPCs sind als kleine Zellklumpen, in der Regel aus 3-5 Zellen identifiziert, aber manchmal bilden größere Aggregate ähneln Neurosphären. Viele Nicht-OL Linie Zellen sollten fest auf dem Boden der Platte eingehalten werden. Vorsichtig schwenken die Platten lösen keine lose eingehalten OPCs, und übertragen Sie die Zellsuspension von jeder Platte in eine 15 ml konischen Rohr.
  11. Zentrifugation bei 1200 rpm (~ 300 g) für 5 min.
  12. Das Pellet in 1 ml OL Medien mit einer P1000 Pipettenspitze durch Resuspension mit einem P200 Pipettenspitze gefolgt.
  13. Zählen Sie die Zellen mit Hilfe einer Zählkammer.
  14. Für angereichert-OL Kulturen, Saatgut 25.000 - 50.000 OPCs zu je 12 mm LN2-beschichteten Deckglas in einem Gesamtvolumen von 1 mL OL Medien.
  15. Für OL / DRGN Co-Kulturen, führen Sie eine vollständige OL Medien (minus CNTF) zu ändern auf der DRGNs von Abschnitt [3], und sanft add 50.000 Zellen aus dem OPC-angereicherten Zellsuspension. Achten Sie darauf, nicht stören DRGN Neuriten Bett während die Zugabe von OPC.
  16. Legen Kulturen in einem 37 ° C-Inkubator mit 8,5% CO 2, und vermeiden Sie das Entfernen, bis Fixierung. Murine OPCs reagieren empfindlich auf Veränderungen des pH-Wertes und der Entnahme aus dem Inkubator wird verändert den pH des OL-Medien. Auch der Hinweis, wird zusätzlich von dH 2 O, um den leeren Brunnen rund um die Zellkulturen zu verhindern Verdampfung der Kulturmedien und minimiert so Schwankungen in der Konzentration gelöster Stoffe in der OL-Medien. Dies wird ein einheitlicheres Umfeld für den OPC.

5. Die Verarbeitung von Kulturen für Immunfluoreszenz-Mikroskopie

  1. Fix Kulturen mit 100% Methanol bei -20 ° C für 10 min oder 3% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur für 15 min.
  2. Permeabilisieren Deckgläschen mit 0,1% Triton-X-100 für 10 min, mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) und Block waschen für 1 Stunde in 10% Ziegenserum.
  3. Inkubieren Deckgläser mit primären Antikörpern in Blockierungslösung über Nacht bei 4 ° C verdünnt
  4. Wash Deckgläschen 3 mal mit PBS und Inkubation mit Alexa-Fluor-konjugierten sekundären Antikörper (Invitrogen) in Blocking-Lösung für 45 min verdünnt.
  5. Gegenfärbung mit 4 ',6-Diamino-2-phenylindole (DAPI) und waschen Deckgläser mehrmals mit PBS.
  6. Berg Deckgläser in DAKO fluoreszierenden Mounting Medium.
  7. Analysieren Sie gleitet über Immunfluoreszenzmikroskopie. In diesem Protokoll wurden die Objektträger entweder mit einem Zeiss Axiovert 200M inversen Fluoreszenz-AnalyseMikroskop oder einem Zeiss LSM 510 META Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop.

6. Whole Cell Protein-Extraktion aus OL-angereicherten Kulturen

  1. Nehmen Sie 24-Well-Kulturen von Inkubator und kühlen auf Eis für 3 min.
  2. Entfernen Sie vorsichtig Medien, und fügen 10-20 ul Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,5% Natriumdeoxycholat, 1% Triton-X-100, mit 0,1% Pepstatin, Aprotinin, PMSF, Leupeptin Natriumorthovanadat) in jede Vertiefung (mindestens 8 Bohrungen pro Probe wird empfohlen).
  3. Scrape Brunnen mit einem breiten Bohrung P1000 Pipettenspitze und Transfer des Lysats in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen.
  4. Pass das Lysat durch eine 30 ½-Gauge-Spritze ca. 15 mal, und Chill auf Eis für 30 min.
  5. Zentrifugenröhrchen bei 14.000 rpm (~ 20.000 g) für 15 min bei 4 ° C.
  6. Überstand in neue Röhrchen und lagern bei -80 ° C.

7. SDS-PAGE-Analyse auf angereichert-OL Kultur Protein

  1. Resolve 30 ug Protein pro Probe bei der Verringerung der Puffer durch SDS-PAGE auf Standard-12% Poly-Acrylamid-Gelen.
  2. Semi-dry Transfer Gelen auf PVDF-Membranen.
  3. Block Membranen für 1 Stunde in 5% Magermilchpulver in TBST (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20).
  4. Inkubieren Membranen mit primären Antikörpern in Blockierungslösung für 1 Stunde verdünnt.
  5. Wash Membranen 3 mal mit TBST für 10 min.
  6. Inkubieren Sie die Membran mit HRP-konjugierten Sekundärantikörper für 45 min in Blockierungslösung.
  7. Wash Membranen mehrmals mit TBST, und inkubieren mit Amersham ECL Plus Western-Blot Nachweisreagenz (GE Healthcare) für 5 min.
  8. Detect Proteinbanden mit Standard Scientific Imaging Film.

8. Repräsentative Ergebnisse:

In diesem Protokoll werden OPCs auf Astrozyten Monoschicht innerhalb einer gemischten Gliazellen Kultur erweitert. Diese gemischte Gliazellen Kultur ist von P0-P2 neonatalen Maus Cortex abgeleitet. Am Tag 1 in vitro (DIV1), enthält die gemischten Gliazellen Kultur-Zellen mit unterschiedlichen Morphologien wie Phasenkontrast-Mikroskopie (Abb. 2a) zu sehen. Am DIV3, beginnt eine Astrozyten Monoschicht auf der Basis des Kolbens bilden, und bei DIV8, OPCs deutlich auf die Monoschicht Oberfläche beobachtet werden. Am DIV9 haben die wuchernden OPCs ausreichende Dichte erreicht, um über Nacht High-Speed-Orbital Schütteln gereinigt werden. Sobald die Reinigung abgeschlossen ist, ist das Ergebnis eines OPC-angereicherten Zellpopulation. Am DIV1-post Reinigung haben OPCs einfache Morphologie, Erweiterung wenige Prozesse (Abb. 2b). Am DIV3 post Reinigung, haben die Zellen ein komplexes Geflecht von Prozessen, erinnert an unreife OLs verlängert. Am DIV6 post Reinigung wurden die gereinigten OLs abgeflacht und projiziert Flugblatt-like Membranstrukturen. Diese morphologische Entwicklung ist typisch für die in vitro-Reifung von OLS.

Immunfluoreszenzmikroskopie zeigt das gereinigte Zellen sind von OL-Linie (Abb. 3a). Gesetzte OPCs zunächst auszudrücken Chondroitinsulfat Proteoglykan (NG2), und entwickeln sich zu Myelin-assoziierte Glykoprotein (MAG) positive unreifen OLs innerhalb von drei Tagen nach der Aussaat (Abb. 3b). Am DIV6 viele OLs ausdrückliche Myelin basisches Protein (MBP) und besitzen typische reife OL Morphologie. Prozent OL-Linie Zellen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten quantifiziert, um die Reinheit der OL-angereicherten Kulturen (Abb. 3c) zu bestimmen. Am DIV1 post Reinigung werden Kulturen von 50 ± 14% NG2 + ve OPCs, ohne MAG + ve oder MBP + ve OLs. Dies zeigt die gereinigte OL-Linie Zellen sind in der Vorstufe bei der Beimpfung Zeit, mit vernachlässigbaren Zahl von differenzierten OLs. Am DIV3, viele OLs haben in MAG + ve Zellen (24 ± 5,9%) differenziert, während einige halten die Vorstufe Phänotyp und bleiben NG2 + (13 ± 8,0%). Am DIV3 sind ein kleiner Teil der MAG + ve Zellen (3,2 1,2%) auch zum Ausdruck MBP. Am DIV6, 20 ± 5,9% von OLS MAG + ve, während 12 ± 7,3% NG2 + ve OPCs bestehen. Darüber hinaus sind 21 ± 9,3% der Zellen innerhalb der Kultur MBP + ve OLs zu diesem Zeitpunkt. SDS-PAGE-Analyse zeigt die abgestufte Ausdruck 2'3'-zyklischen-Nukleotid-3'-Phosphodiesterase (CNP) und MBP über die 6 Tage Kulturzeit, ein weiterer Beweis für die Fähigkeit von OPCs in Kultur zu terminal zu reifen OLs unterscheiden (Abb. 3d ). Zusammen stellt diese Daten dieser Methode als Mittel zur Herstellung eines OL-angereicherten Kultur-System eignet sich für das Studium der OL Reifung von OPCs.

Dieses Protokoll beschreibt auch Methoden zur OL / DRGN Co-Kulturen mit Maus-only Gewebe Quellen zu etablieren. Doch um die Co-Kultur zu erzeugen, müssen DRGNs zuerst allein kultiviert werden, um eine ausreichende Neuriten Netzwerk herzustellen. Diese postnatale murine Neuron Kulturen sind für 9 Tage in niedrigen Serum-Medien mit 10 uM FUDR Ergänzung geworden, um die Verbreitung von kontaminierenden Fibroblasten und gl verhindern ial Zellen. Im Laufe von 9 Tagen in vitro produzieren isoliert DRGNs ein dichtes Neuriten Bett (Abb. 4a). Diese Neuriten Bett ist immunpositive für die neuronalen Marker Neurofilament 200 (NF) und Tuj1 (Abb. 4b). An dieser Stelle können gereinigte OPCs die Neuriten Betten hinzugefügt werden, und kultiviert für einen zusätzlichen 6 Tage zu produzieren myelinisierenden Co-Kulturen.

Am DIV6 der OL / DRGN Co-Kultur, viele MBP + ve OLs können unter den NF + ve DRGN Neuriten (Abb. 5a) beobachtet werden. Bei genauerer Betrachtung sind OLs belegt, um Kontakt mit zahlreichen DRGN Neuriten zu machen, oft einhüllenden sie mit einem MBP + ve-Membran (Abb. 5b, c).

Abbildung 1
Abbildung 1. Dissektionsmikroskop Bilder bestimmter Aspekte des Neugeborenen Maus Kortex und DRG Isolation. (A) Dorsale Ansicht eines frisch extrahierten neonatalen Gehirn der Maus. Die gestrichelten Linien zeigen den Bereich, wo Einschnitte gemacht, um die Entfernung der Hirnhäute Schicht zu erleichtern muss. (B) Ventrale Ansicht des Gehirns, gestrichelten Linien den Bereich, wo die Rinde trifft der ventralen Zwischenhirn hinweisen. Tiefe Einschnitte müssen entlang der gestrichelten Linien vorgenommen werden, um die Isolation des Kortex zu unterstützen. (C-c ') Visual Darstellung, wie man die Rinde entfernt sie vorsichtig aus dem Rest des Gehirns. (D) Ein frisch isolierten P5-P10 Maus Wirbelsäule vor weg Entfernen überschüssigen Muskeln und Knochen (d '). (e) Lage der DRGs in der Wirbelsäule. (f) Die ungefähre Anzahl der DRGs, die von einer Maus isoliert werden sollten. (g) Ein DRG mit langen Wurzeln, die erforderlich Trimmen vor der enzymatischen Verdauung. Die gestrichelte Linie zeigt den Bereich, wo die Wurzeln beschnitten werden sollte. (G ') DRG post root-Besatz.

Abbildung 2
Abbildung 2. OPCs sind innerhalb einer gemischten Gliazellen Kultur ausgebaut, gereinigt und anschließend als OL-angereicherten Kultur unterschieden. (A) Phase kontrastreiche Bilder von gemischten Gliazellen Kulturen in verschiedenen Stadien der Entwicklung. Am DIV1 erscheinen Zellen Runde mit wenigen abgeflachten Zellen. Schichtung von gemischten Gliazellen Kultur beginnt bei DIV3, wo Astrozyten bilden eine einheitliche Monoschicht an der Basis des Kolbens, auf denen OPCs vermehren. Viele OPCs bei DIV8 (Pfeile) haftete an der Oberfläche der Astrozyten Monoschicht zu sehen sind. (B) Wenn aus den gemischten Gliazellen Kultur gereinigt haben DIV1 OPCs nur wenige Prozesse erweitert. Am DIV3 Zellen haben viele Prozesse, die an der Zwischen-Etappe OLs verlängert. Am DIV6 erscheinen abgeflacht OLs (Sternchen) produziert membranöse Platten haben (gestrichelte Linie). Scale-Bars, 50 pm.

Abbildung 3
Abbildung 3. Charakterisierung von OL-angereicherten Kultur. (A) Konfokale Bilder von isolierten OLs in verschiedenen Stadien der Entwicklung. NG2 + ve OPCs haben einfache Morphologie, während MAG + ve OLs mehrere arborous Prozesse besitzen. MBP + ve ole verfügen über membranöse Myelin-ähnlichen Blätter verlängert. Scale-bar, 50 pm. (B) Gereinigtes OL-Linie Zellen stammen, wie OPCs und differenzieren sich in MAG + ve, MBP + ve OLs über 6 DIV. Am DIV1, sind alle OPCs NG2 + ve, während keiner MAG + ve oder MBP + ve sind. Am DIV3 sind MAG + ve und einige MBP + ve OLs jetzt evident. Die Mehrheit der OLS MAG und MBP + ve an DIV6, mit wenigen verbliebenen NG2 + ve OPCs. Scale-bar, 100 um. (C) Mittelwerte ± SD der prozentualen OL-Linie Zellen in verschiedenen Stadien der Entwicklung über 6 DIV. Am DIV1, sind alle OL-Linie Zellen NG2 + ve Anteil von 50 ± 14% der gesamten Zellen in der Kultur. Am DIV3 und DIV6, OL-Linie Zellen bzw. Konto für 36 ± 6,8% und 32 ± 8,4% der gesamten Zellen, bestehend aus unterschiedlichen Anteilen von NG2 + ve, MAG + ve und MBP + ve OLs. (D) SDS-PAGE durchgeführt auf Protein aus angereichertem OL-Kulturen zeigen die abgestufte Ausdruck OL-Marker CNP und MBP über die 6 DIV Kultur Periode abgeleitet.

Abbildung 4
Abbildung 4. Charakterisierung der DRGN Kultur pre-OPC Aussaat. (A) Phase kontrastreiche Bilder von DRGNs über die 9 DIV Kultur Zeitraum pre-OPC Aussaat. DRGNs stammen so groß kräftige Zellen mit wenigen Prozessen und produzieren eine immer komplexer Neuriten Netzwerk. Scale-bar, 100 um. (B) Konfokale Bilder von DRGN Kulturen DIV9 (pre-OPC Aussaat) fixiert und gefärbt für Neuronen-spezifische Marker Tuj1 und NF200. DRGNs einen Neuriten Netzwerk, auf dem OPCs ausgesät, um OL / DRGN myelinisierenden Co-Kulturen hergestellt werden können, erzeugt. Scale-bar, 50 pm.

ENT "> Abbildung 5
Abbildung 5. OLS mit DRGNs Ergebnis in OL-vermittelte Verpackung von DRGN Neuriten mit MBP + ve Membran co-kultiviert. (A) A 4-Feld-konfokale Bildmontage eines DIV6 OL / DRGN Co-Kultur. Viele MBP + ve OLs sehen die Interaktion mit dem zugrunde liegenden DRGN Neuriten Bett. Scale-bar, 100 um. (B) Eine vergrößerte konfokalen Blick auf MBP + ve OLs Verpackung mehrere DRGN Neuriten. Scale-bar, 50 pm. (C) Digitale Vergrößerung der Region in (b) wenn ein DRGN Neuriten wird mit OL Membran umhüllt bezeichnet. Scale-bar, 25 um.

Discussion

Dieser Bericht beschreibt ein Verfahren zur Isolierung muriner OPCs für die Differenzierung in OL-angereicherten Kulturen oder OL / DRGN Co-Kulturen. Wenn kultivierte allein, differenzieren die OPCs in MBP + ve OLS, produziert Myelin-like membranöse Blatt. Wenn hinzugefügt, um Neuriten Betten DRGN, umhüllen OLs die DRGN Neuriten mit MBP + ve Membran. Dieses Modell profitiert die Erforschung der komplexen Grundlagen über OL-vermittelte axonale ensheathment.

Während von großem Wert, ist die Einrichtung eines solchen Kulturen technisch anspruchsvoll. Dazu gehören insbesondere anspruchsvolle Aspekte effizienter Gewebe Verdauung / Dissoziation, die Aufrechterhaltung der ausgewogenen Kulturmedien pH-Wert und DRGN Medien ändert. Es ist wichtig zu bedenken, dass die Länge der Verdauung, Menge an Gewebe verdaut wird und die Höhe der Verreibung Einfluss auf die Wirksamkeit und Endergebnis der Gewebedissoziation. Es ist nicht für erfahrene Wissenschaftler ungewöhnlich niedrigen zellulären Erträge aus dissoziierten Nervensystem Gewebe zu erhalten. Darüber hinaus neigen murine OPCs zu empfindlich auf Veränderungen des pH-Wertes der Kultur Medien, insbesondere unter alkalischen Bedingungen. Die Pflege der Kulturen bei 8,5% CO 2 zielt darauf ab, dies zu verhindern, da OPCs besser tolerieren leicht sauren Bedingungen über grundlegende erscheinen. Im Hinblick auf die Fütterung DRGNs, Medien ändert sich schnell durchgeführt werden muss, um nicht auszutrocknen den Neuronen, muss jedoch sanft wie nicht stören die Entwicklung von Neuriten Bett. Abrupte Änderungen können Medien verdrängen die Neuriten Bett aus dem Substrat, und wahrscheinlich zu seiner vollständigen Loslösung von dem Deckglas.

Das Potenzial Verdienst dieses Modellsystem stark überschattet seine technisch anspruchsvollen Natur. Ein Vorteil dieses Systems ist die Verwendung von postnatalen Mäusen für die Zellkultur Ableitung unter Umgehung der Notwendigkeit, weibliche Zuchttiere zu opfern, um embryonale Gewebe zu ernten. Ein weiterer Vorteil ist die fehlende Voraussetzung für Wachstumsfaktoren (GF) für den Ausbau der OPCs. Mixed glialen Kulturen bieten ein Umfeld, das die Ausbreitung von OPCs, vermutlich wegen der Anwesenheit von Astrozyten-derived trophischen Faktoren unterstützt. Andere Methoden, wie z. B. Ableitung über Neurosphären 7,8, vertrauen auf die mitogene Eigenschaften von GF wie basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und platelet-derived growth factor (PDGF) für OPC Expansion. Auch mit der Geburt (P5-10) Mäuse für DRGNs vermeidet das Erfordernis der Ergänzung der Kulturmedien mit nerve growth factor (NGF), einen neurotrophen Faktor für die in vitro das Überleben von embryonalen DRGNs 9, 10 erforderlich. Es ist interessant zu vermeiden, mit NGF, wie es wirkt sich negativ auf myelinisierenden Kapazität von OLS, wenn sie mit DRGNs 4 kultiviert. Vermeidung der Verwendung von GF-ergänzt Medien hat auch wirtschaftliche Vorteile, da diese Reagenzien teuer werden, wenn in großem Maßstab eingesetzt.

Vielleicht der wichtigste Vorteil dieser Kultur Modells ist seine Ableitung aus Maus-only Gewebe, wodurch die Chancen abzuleiten beiden OPCs und DRGNs aus der Vielzahl von transgenen Mauslinien. Dies ermöglicht die Untersuchung der beiden DRGN und / oder OPC-spezifische Eigenschaften, die Myelinisierung zu regieren. Dies ist besonders wichtig für die Aufklärung der Rezeptor / Ligand-Interaktionen regulieren OL-vermittelte Myelinisierung der Axone. Alles in allem ist diese Technik von großem Wert in Bezug auf neurowissenschaftliche Forschung aufgrund ihrer Anwendungen zum Verständnis der molekularen Signale zugrunde liegenden Myelinisierung.

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Dieses Projekt wurde durch einen Zuschuss von der Multiple Sclerosis Society von Kanada bis RKRWO finanziert ist ein Empfänger ein Stipendium von der Multiple Sclerosis Society von Kanada. SDR ist ein Empfänger von Post-Doctoral Fellowships aus dem Multiple-Sklerose-Gesellschaft von Kanada und kanadischen Institutes of Health Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Multicell 319-005-CL
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Invitrogen 14170-112
Minimum Essential Media (MEM) GIBCO, by Life Technologies 12360-038
Fetal Bovine Serum (FBS) GIBCO, by Life Technologies 10091-148
Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) GIBCO, by Life Technologies 15140-122
GlutaMAX Invitrogen 35050-061
Poly-l-lysine Sigma-Aldrich P2636
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503
Human merosin purified protein (LN2) EMD Millipore CC085
Recombinant rat ciliary neurotrophic factor (CNTF) PeproTech Inc 450-50
L-thyroxine Biochemika 89430
Holo-transferrin Sigma-Aldrich T0665
B27 supplement GIBCO, by Life Technologies 0080085-SA
Bovine insulin Sigma-Aldrich I6634
3,3',5-Triiodo-L-thyronine Sigma-Aldrich I6634
Progesterone Sigma-Aldrich P8783
Putrescine Sigma-Aldrich P7505
Sodium Selenite Sigma-Aldrich S5261
5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FuDR) Sigma-Aldrich F0503
Papain solution Worthington Biochemical LS003126
DNaseI Roche Group 1010159001
L-cysteine Sigma-Aldrich C7352
24-well tissue culture dishes Cellstar 662-160
T25-tissue culture flasks with vent cap Corning 430639
10 cm tissue culture dishes Corning 430167
10 cm petri dish Fisher Scientific 0875713
Collagenase A Roche Group 103578
CellTrics 50 μm filter (optional) PARTEC 04-004-2327
Myelin Basic Protein (MBP) Antibody AbD Serotec MCA409S
NG2 antibody EMD Millipore AB5320
Myelin-Associated Glycoprotein (MAG) antibody EMD Millipore MAB1567
2',3'-Cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNP) antibody Covance SMI-91R-100
Actin pan Ab-5 antibody Fitzgerald 10R-A106AX
Neurofilament-200 (NF) antibody Sigma-Aldrich N4142
Tubulin beta-3 chain (Tuj1) antibody EMD Millipore MAB5544
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11008
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A21422
Alexa Fluor 647 goat anti-rat (IgG) (H+L) secondary antibody Invitrogen A21247
Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody Bio-Rad 170-6516
Goat anti-rat IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-2065
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542

Media Recipes

100X OL-Supplement*

IngredientAmount to add
DMEM100 mL
BSA1.02 g
Progesterone0.6 mg
Putrescine161 mg
Sodium Selenite0.05 mg
3,3',5-Triiodo-L-thyronine4 mg

*Store at -80 °C in 250 μL aliquots

OL media

IngredientAmount to add
DMEM23.75 mL
100X OL-Supplement250 μL
Bovine insulin (from 1 mg/mL stock)125 μL
GlutaMAX250 μL
Holo-transferrin (from 33 mg/mL stock)37.5 μL
B27 Supplement500 μL
FBS125 μL
CNTF (from 50 ng/μL stock)25 μL

Mixed glial culture media (made up in DMEM)

IngredientFinal concentration
FBS10%
Pen/Strep (0.33% from stock)33 units/mL Penicillin and 33 μg/mL Streptomycin
GlutaMAX1%

DRGN media (made up in DMEM)

IngredientFinal concentration
FBS10%
Pen/Strep (1% from stock)100 units/mL Penicillin and 100 μg/mL Streptomycin

Digestion Solution Recipes:

OPC papain solution (made up in MEM)

IngredientFinal concentration
Papain solution1.54 mg/mL
L-cysteine360 μg/mL
DNaseI60 μg/mL

DRG papain solution (made up in HBSS)

IngredientFinal concentration
Papain1.54 mg/mL
L-cysteine360 μg/mL

DRG Collagenase A solution (made up in HBSS)

IngredientFinal concentration
Collagenase A4 mg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Avellana-Adalid, V. Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential. J Neurosci Res. 45, 558-570 (1996).
  2. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
  3. Barres, B. A. Cell death and control of cell survival in the oligodendrocyte lineage. Cell. 70, 31-46 (1992).
  4. Chan, J. R. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43, 183-1891 (2004).
  5. Camara, J. Integrin-mediated axoglial interactions initiate myelination in the central nervous system. J Cell Biol. 185, 699-712 (2009).
  6. Ishibashi, T. Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses. Neuron. 49, 823-832 (2006).
  7. Chen, Y. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat Protoc. 2, 1044-1051 (2007).
  8. Pedraza, C. E. Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors. Glia. 56, 1339-1352 (2008).
  9. Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors. J Neurosci. 12, 1896-1905 (1992).
  10. Greene, L. A. Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons. Dev Biol. 58, 106-113 (1977).

Comments

46 Comments

  1. very nice video and presentation....

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 28, 2011 - 12:44 PM
  2. Nice explanation. I have been carrying out this procedure for some time now and find that it works quite well.

    How many OPCs you generally obtain from a single mouse brain?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 26, 2012 - 4:35 PM
  3. Hi - thanks for your comment, typically I yield about ²00,000 OPCs per mouse brain (on average).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 1:04 AM
  4. Excellent. I am using B6 mice, usually P4-5 (because we also take cerebellar neurons from these same pups). I usually yield between 100-130,000 cells/brain. I see some differences in our protocols (I seed three brains/T75, use trypsin instead of papain, etc.). What steps have you found to dramatically increase your OPC yield post shake-off?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 12:17 PM
  5. The largest factor in OPC yield is the efficiency of your digestion (ie. minimal cell death). In addition, the age of the mice from which you isolate the mixed glial cultures is a factor. I think if you go too far past P², many OPCs will be postmitotic, and therefore limit their proliferation capacity. I usually try to go as young as possible (P0) as this seems to work best. If you absolutely need to use P4-P5, maybe try to culture your monolayers longer than 9 days - try waiting ² weeks prior to shake off. Hope this helps - RO

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 1:06 PM
  6. Thanks for the great info. That is interesting, as many of the protocols for the "DeVellis-method" use different enzymatic preparations (trypsin +/- EDTA, +/- DNAase, papain, etc.). I had basically adapted my rat OPC protocol for mice, but am realizing that they are just not the same. I will trip your papain method and let you know how things pan out. Also, is there a reason you use T²5 flasks instead of combining brains into a T75?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 4:55 PM
  7. No there is no specific reason for using T²5, simply this is what I have always been using. I would imagine combining 3 mice into a T75 flask would roughly be the same thing. Good Luck!

    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 12:00 PM
  8. Hi Ryan, nice video and explanation. Do you do lectin panning to further get rid of microglia or do you find that a 30 min incubation at 37 degrees is enough? Also, how do you know cells are ready to shake? are they always ready at day 9? what do you look for specifically?
    thank you

    Reply
    Posted by: luisa t.
    April 10, 2013 - 12:39 PM
  9. hello...I have gone through this video...very nicely presented...but I have one doubt that if I put the flasks on shaker which only maintains temp and speed but not CO² level, the pH will change...would it not allow the OPCs to survive at all??? and can I use HEPES in medium to solve this problem???
    M willingly waiting for your reply....

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 4, 2012 - 12:35 PM
  10. Thank you for your comment, you are correct in that it will not work without CO² buffering. HEPES buffer will likely not solve this problem either. I'm afraid you will absolutely need to have CO² buffering for this isolation to work.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 11:56 AM
  11. Hi, very INFORMATIVE video, I zalak parikh working on glial cells. In your protocol you are not using any filter after papain digestion but I am facing one problem of Fibroblasts contamination. What could be the possible solution for this problem?
    thank you
    Zalak.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 24, 2012 - 7:59 AM
  12. Hi Zalak, thanks for your comment. What glial cell type are you trying to culture? Oligodendrocytes, astrocytes or microglia? I have never experienced fibroblast contamination.. are you sure they are fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 24, 2012 - 10:47 AM
  13. Hi there. Excellent video, very informative. I was just wondering if you can incubate the flasks in 5% CO² instead of 8% CO²?
    Thanks
    Matt

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 11, 2012 - 12:48 PM
  14. Hi Matt, Actually no, you need to have these at at least 8.5% CO² - otherwise you will have trouble establishing your mixed glial cultures - Good luck

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 11, 2012 - 10:22 PM
  15. Hi Ryan. Very nice video and presentation.
    I have to establish a DRG neuronal culture. Majority of all the papers I've read are using a embryonic source of DRG unlike you using post-natal mouse. What do you think will be the major difference between the cultures of the two??

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 1, 2012 - 12:23 PM
  16. Hi Lipi,
    You're right most papers use embryonic DRGs. The benefit of using post-natal DRGs is that you don't have to sacrifice the mother, and if you use P5-P10 mice, there is no need to use nerve growth factor (in my hands). Embryonic DRG neurons require NGF supplementation to the media for their survival. In terms of the difference between cultures, embryonic dervied ones may have a bit more contaminating cells, since I find they divide pretty quickly. Otherwise I imagine they would be the same as post-natal derived cultures. Good luck!

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    October 1, 2012 - 4:37 PM
  17. Thank you Ryan.

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 3, 2012 - 2:39 AM
  18. Thank you Ryan.

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 3, 2012 - 2:51 AM
  19. Great article Ryan. I had a question for you. Our lab generates mixed glial cell cultures by isolating NPCs from P1 mouse pup brains,expanding the NPCs via neurospheres in the presence of GFs, and then plating the spheres on matrigel for subsequent differentiation without GFs. My main goal in using the neurosphere protocol is to obtain OPCs, but I routinely get only ²0-30% O1+ OPCs following 8 days of differentiation on matrigel. GFAP+ astrocytes seem to dominate the whole culture, with OPCs growing on top of them. I wanted to try to incorporate your protocol into the neurosphere protocol by dissociating the spheres using TrypLE or Accutase, plating them on Poly-D-Lysine, letting the astrocytes grow to confluency while having OPCs proliferate on top, and then use the shaking technique to isolate OPCs. Do you think this is possible? When we perform in vitro studies with the NPCs, we usually plate the neurospheres on matrigel for a day and then trypsinize the cells for seeding into new dishes. Not only do I think the trypsin digest kills many OPCs, but I also remove astrocytes from the matrigel that then contaminate my cultures. Thanks for the help!

    Reply
    Posted by: Brett M.
    November 3, 2012 - 7:37 PM
  20. Hi Brett - To answer your question, yes I think it would be possible to do what you are suggesting. However, it seems to be a pretty roundabout approach. I think the more streamlined approach would be to simply seed your dissociated P1 neural cells onto PLL substrate to generate a monolayer. That way you would avoid having to generate neurospheres (which I imagine takes about 10 days) and then subsequently generating an astrocyte monolayer with the spheres (which would take another 10+ days). In my experience, OPCs don't like trypsin. If you wanted, you could try 0.05% Trypsin instead of 0.²5% and that seems to be more gentle. And if you don't incubate for too long, most astrocytes should remain on the plate. Hope this helps! -Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    November 5, 2012 - 12:14 PM
  21. Ryan, thanks for the help! I tried your protocol and everything appeared to go well. However, one issue I ran into occurred during the overnight shaking step and subsequent differential adhesion assay to isolate a more pure population of OPCs. What I noticed was that after the overnight shaking I had many large oligospheres (maybe 10-²0 cells in size). These spheres did not stick down during the 30 minute plate incubation and I had difficulties trying to dissociate them as you described using the P1000 and P²00 tips. When I took the cells counts and plated the cells onto chamber slides, many smaller clumps remained and stuck down to the matrix. However, the clumps did not flatten out on the gel matrix very well (like neurospheres do) and eventually flaked off after about 5 days of cultures, leaving only sparse population of OPCs. Have you ever encountered this problem? I was thinking of seeding at a higher cells density than what you describe in the protocol.

    Reply
    Posted by: Brett M.
    December 2, 2012 - 10:21 PM
  22. Hi Brett - sounds like you're doing everything right. Normally I see lots of these "oligospheres" as a result of the overnight shaking protocol. However, I find that these are not the majority of OPCs, as there are many single cells and cells in clumps of ²-4. The oligospheres are difficult to dissociate, and due to this, I generally do not go out of my way to try and break them up. In my hands, these spheres spread out very nicely after about ²4hrs on Laminin-² substrate. You can try to seed at higher densities if you like, but the seeding density should be determined based on the experiment you want to conduct. For example, if you want to perform immunocytochemistry, it may not be ideal to have a very dense cell culture. Also, it's possible the clumps aren't super compatible with your matrix substrate - I always use Laminin. I hope this helps :)

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    December 3, 2012 - 11:42 AM
  23. HI Ryan, very informative and nice presentation. I have tried your protocol and everything seem to work fine except at the overnight shaking. There were very few OPCs isolated and it seems there are still many OPCs adhere to the astrocytes. Have you encounter this issue?

    Reply
    Posted by: Esther W.
    December 13, 2012 - 3:25 AM
  24. Hi Esther, Thanks for your comment. How many OPCs are you yielding per mouse? I usually yield on average ²00,000 OPCs per mouse brain, but this is quite variable. At times I have yielded 500,000 or 50,000 per brain, and I'm not sure what accounts for this variability. In any case, you will never dissociate 100% of the OPCs from the monolayer, I've noticed a lot remain stuck. My advice would be to simply give it another shot and see if your yields are a bit higher next time. Hope this helps - RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    December 16, 2012 - 5:35 PM
  25. Thanks Ryan for your advice. My yield is definitely much lower than yours. I will definitely try another round. :)

    Reply
    Posted by: Esther W.
    December 16, 2012 - 8:24 PM
  26. HI Ryan, I face the problem of getting immature OPC instead of mature OPC after 6 days of OL-enriched culture. What is your view?

    Reply
    Posted by: Esther W.
    January 23, 2013 - 2:51 AM
  27. Hi Esther, you should always expect to have some OPCs that don't differentiate during the timecourse. However, the majority of OLs should at least be expressing MAG, if not MBP at DIV6. My guess would be that your media is not exactly correct. Make sure that all the ingredients are at the correct concentration in your 100x OL-supplement stock - especially tri-iodothyronine and L-thyroxine (4mg per 100mL). I hope this helps, let me know if you still have problems.

    Posted by: Ryan O.
    January 23, 2013 - 12:56 PM
  28. Thanks Ryan for replying. I have added tri-iodothyronine only as there is no mentioned of L-thyronine in the 100x OL-supp recipe. Can i still add L-thyronine when the OL-enriched is on DIV5?

    Posted by: Esther W.
    January 23, 2013 - 8:05 PM
  29. Thanks for notifying me of this mistake, I'll notify the editorial team ASAP. Yes you can try to add it on DIV5, but no guarantees this will drive them any farther since they are aleady 5 days in. Give the protocol a second try, and let me know if the lack of differentiation still occurs. -Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    January 24, 2013 - 12:47 AM
  30. Hi Luisa thanks for your comment :) I don't do lectin panning, as I find that incubation on the culture plates is enough to get rid of most of them, but if you're having a problem with microglia that is an additional option. I usually shake on day 9, but I've found you can shake anywhere from 9 to 1² days, but any longer than that you will get less OPCs. Generally if you see a lot of cells on top of the astrocyte monolayer, they are ready to go. However in my experience this dŒsn't really happen before day 9. Hope this helps RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    April 10, 2013 - 2:28 PM
  31. Hi Ryan.Thanks for this protocol. I did exactly what you have described in this protocol, except the shaking step. I did it without CO2, but the caps are tightly sealed, how is it possible that CO2 will effect pH of tightly sealed flask? My yield was very low, besides I had fibroblast contamination as well. I used uncoated flasks as well, because once during the shaking all the layer came off the bottom of the flask, what do you think would be the reason for this?.And in my experience when FBS is used in OPC culture media it made OPC's to differentiate to astrocytes rather then oligodendrocytes.Overall I couldnt replicate this procedure unfortunately and trying to find other methods..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 20, 2014 - 5:33 PM
  32. Hi Aysel - from what you describe in your message, you didn't follow my protocol.

    1) So you didn't shake the flasks? Or you didn't use the same method of shaking?

    2) As far as I know, all standard tissue culture incubators have some level of CO2 buffering (usually 5%). Strictly speaking, if you tighten the cap of your flasks, there will be no gas exchange between the incubator and the flask, if you are using plugged caps. I use vent-capped flasks (0.22um pore), so gas exchange occurs between the flask and the incubator when the caps are tight. To answer your question, CO2 buffering will have little-to-no effect on the pH of the media if you are using tightly-screwed plugged flask caps.

    3) I haven't experienced fibroblast contamination in my cultures, I imagine this would be a dissection issue. The only source of fibroblasts I can imagine would be from the meninges, so be sure to fully remove this prior to dissociation of the cortex. Unless you are confusing fibroblasts for astrocytes. Too many astrocytes is a result of too much agitation at the differential adhesion step.

    4) I have always used coated flasks, in my experience OPCs will not adhere to uncoated surfaces. I am willing to bet you'll get almost no OPCs if you continue to use uncoated flasks. If you want you can try to use other substrates such as PDL, poly-O-ornithine, collagen etc.

    5) I haven't noticed any significant transformation of OPCs into astrocytes in the presence of FBS. I imagine this might occur more frequently in immortalized OPC cell lines. Perhaps that's what you are thinking of.

    I hope this helps, otherwise best of luck in your research.

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 20, 2014 - 8:52 PM
  33. Hi Ryan, thank you ver much for detailed answer. Sorry for my english, i couldnt explain good.
    I did the shaking of course but without putting shaker inside the CO2 incubator, I did shaking at 37 degree incubation only and at 180 rpm. Because the flasks are uncoated(I have used uncoated flasks for rat OPC"s without problem, that is why I tried this way with mouse as well) I hesitated to increase rpm to 240 or so, to prevent astrocyte detachment, and I also think that fibroblast contamination is because of the meninges. Second time I will prevent it.
    It is good to know that I must use coated flasks, I will try again, if you say so.
    Thank you so much, good luck to too..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 21, 2014 - 6:22 AM
  34. Hi Again,
    Alright - I strongly suggest to put the shaker in the incubator for the overnight shake, as I have found this to be a crucial step in maintaining pH balance. The media on your cells should always be a rich red colour (indicative of a balanced pH) all the time. Mouse OPCs are very sensitive to pH, and will die with too much fluctuation. If during your shaking, the media becomes at all purple-ish or yellow-ish, your OPC yield will drastically reduce. I wouldn't be surprised either if this was a contributing factor to the monolayer detachment you experienced previously. There is a significant difference in the in vitro behaviour/viability of mouse OPCs as compared to rat, hence the generation of this protocol. Your best bet is to simply follow this protocol exactly as is.

    Thanks for your comment, and good luck,
    Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 21, 2014 - 12:25 PM
  35. Hi.
    One more question Ryan, about amount of the brains seeded, I was seeding 2 rat brains/ T75 flask , in the mouse case to obtain same amount of cells seeded I was using 6 brains per flask. Would you suggest to use 3-4 instead of six? and if i seed 6 animals should I increase concentration of insulin added to mixed culture media? Overall what would be optimum amount of brains per T75 flask in your opinion? Does it matter to much? Because here you use 1 brainper T25 flask.
    Thanks again..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 26, 2014 - 4:20 PM
  36. Hi Aysel,
    Again, your best bet for success is to follow the protocol exactly as is - T25 flasks are what this method has been optimized for. I suppose T75 flasks have 3 times the surface area, so in theory 3 mice would have to be seeded to a T75 to yield the same cell density. I've never tried this protocol with T75 flasks, and I know that different culture vessels have different impact on growth and survival of OLs.
    Best - RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 27, 2014 - 10:47 AM
  37. Hi Ryan . I want to say that I replicated the procedure exactly as here, and have got very good yield, but I have 1 more question to you, majority of OPCs die in the differentiation media after 6-7 days of incubation. You indicated that it is important not to distrub them until fixation, but how do you do the medium chage, I put 1 ml media first day and did 2/3 media change each 3 days, I seeded all cells to one 24 well format plate, at each time points(3 d, 6 d, 9 d) I transfer the slides to new plate and fix them there and do medium change for rest of the slides. By the way I culture OPCs at 5% CO2, becaue I have only 2 options 5% and 10%, i cant adjust ph of the incubators at this time point. Is it the contributing factor for death of the cells after 4-5 days of incubation?

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    March 19, 2014 - 2:43 PM
  38. Hi Aysel - I'm glad to hear things are looking up -

    1. I don't suggest differentiating the OLs for longer than 6 days. If you're finding they are not differentiating fast enough, you can add 4 mg of L-Thyroxine to the 100X OL-supplement (see the media recipe list above).

    2. It is normal to lose OLs over the time course of differentiation. That being said, you don't want to encourage death by moving the cells or culturing at low pH. You should not be changing the media of the purified OL cultures at any point - they do not require media changes. The protocol also says to culture the OLs at 8.5% CO2. Since you have access to both 5 and 10% CO2 incubators, and 8.5 is closer to 10 than it is to 5, I suggest culturing them at 10%.

    3. Rather than culturing all of your time points in one dish, use 3 dishes (one for 3 days, one for 6 etc). That way, you won't have to disturb your other time points.

    4. Do not remove the coverslips from the wells of your 24 well dish during fixation - simply add concentrated PFA directly into the media and allow to fix for about 15 mins at room temp.

    Sounds like you're almost there, Best of luck - Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    March 19, 2014 - 3:58 PM
  39. Let me write it again to see if I have understood you correct, you say dont do any media change ever, neither at 3 days or 6 days or further? The other things I will try what you suggest, culturing and seeding in different plates at 10% CO2
    I want to thank you a lot for your help and all of the explanations.
    Thanks ..
    Best,
    Aysel

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    March 19, 2014 - 4:22 PM
  40. Thats correct :)
    You're very welcome,

    Ryan

    Posted by: Ryan O.
    March 19, 2014 - 5:49 PM
  41. Hi Ryan,

    Thanks for sharing this protocol, looks really good and will try it out. I have a couple of questions regarding your protocol and was hoping you could shed some light on some problem I am experiencing at the moment.

    With regards to what you have just described, we actually perform a very similar mixed glial culture on P0-P3 rat brains. Our isolation stages are very similar with the exception we use DNAse1 and L-cysteine along with Papain. Upon plating our cell suspensions the flasks are densely populated with microglia on top, then opc's below and then astrocytes. We basically shake off our microglia before doing the overnight shake for the OPC's.

    My question is how do you get rid/ not see any microglia in your mouse cultures? Is it also possible to obtain microglia from your method?

    We are currently experiencing problems with obtaining OPC's from our overnight shake (in rat). The cells look healthy when in culture with the microglia but once the microglia are removed and we perform the steps required to plate the OPC's we have a lot of contaminants in with the cells, almost like long fibrous structures that are stained by trypan blue. We still obtain + 5 million OPC's but the cells do not look healthy and the morphology is not consistent with OPC's. Upon plating these cells they fail to show characteristics of OPCs and a lot die off. I will mention we do not shake in an incubator but in an orbital shaker at 250rpm with the caps sealed tight and parafilm. Have you ever encountered this?

    Many thanks .

    Reply
    Posted by: Graeme I.
    February 9, 2015 - 1:06 PM
  42. Hi Graeme, thanks for your question.
    We do in fact get microglia in our mixed cultures, but we remove them prior to the overnight shake with a slow short shake (as in the rat method). These shaken off microglia are a very pure population, and can be cultured separately if desired.
    With regard to the problems you’re encountering shaking your rat cultures, I can’t say I’ve experienced anything quite like what you’re describing. It almost sounds like your cultures are suffering from contamination (maybe yeast?). We’ve experienced contamination a couple of times, and it resulted in much of the monolayer dissociating from the base of the flask during the overnight shake. If you like, you can send me a pic of the fibrous structures in the hopes that I could recognize what they are (romea077@uottawa.ca).
    We have never had luck shaking flasks in an orbital shaker – we exclusively use tissue culture incubators with vented caps. One risk of using an orbital shaker is they pose a threat for contamination, as they are often used for bacterial cultures.
    I hope this helps and best of luck,
    Ryan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 20, 2015 - 11:12 AM
  43. Hi Ryan,

    Thanks for your reply.

    I tried the protocol and achieved very nice OPC's so everything seems ok there.

    With regards to what I was seeing after my rat OPC shake, I believe it not to be of any contamination but more something coming out of solution in our media. As a test I shook DMEM10% in a T75 flask, 37 degrees, 250rpm overnight. The next day I took an aliquot and looked at it with trypan blue. To my surprise I saw the same fibrous clumps that I was seeing after the OPC shake

    . My DMEM only contains FBS and pen-step so this has to be something in FBS. My most recent shake off I decided to shake off 5 flasks with DMEM 10% and 5 flasks with OPC media (our OPC media contains 2.5ml FBS vs 50ml in DMEM). The next day after following normal protocol I counted the cells from both conditions. The OPC media flasks had almost none of the fibrous clumps whereas the DMEM flasks had alot. I can now partially get round this problem by filtering with 40uM strainer but have you ever heard or seen this kind of thing. We have used several batches if FBS so it cannot be that every batch has precipitated proteins in it but perhaps what were doing is causing precipitation of FBS proteins that are affecting the OPC's?

    Thanks

    Graeme

    Reply
    Posted by: Graeme I.
    March 15, 2015 - 4:16 PM
  44. Hi Ryan,

    Is your FBS from Invitrogen decomplemented ? If so did you buy decomplemented or did you heat it at 56*C and for how long.

    Thanks

    Reply
    Posted by: Ludovic D.
    February 24, 2017 - 10:40 AM
  45. Hi Ludovic,
    I've used FBS that has been heat-inactivated by the manufacturer, and I've also used FBS that I've heat inactivated myself. For the latter, if memory serves, about 30 minutes at roughly 50 degrees C should do the trick (water bath).
    Good luck, Ryan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 26, 2017 - 11:49 AM
  46. Hi Ryan,
    I am wondering if you have any experience with adding Cre Recombinase Adenovirus to the cultures? And if you think a particular day would be best to add it? I was thinking of adding it on D8 (1 day before the full media change) but wasn't sure if adding virus and then shaking the cells would cause too much stress?
    Thanks,
    Megan

    Reply
    Posted by: Megan R.
    April 30, 2018 - 2:39 PM

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