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Derivação de Enriquecido Culturas oligodendroglial e Neuron / oligodendroglial Myelinating Co-culturas de tecidos pós-natais murino

Neuroscience
 

Summary

Este artigo descreve métodos para derivar populações enriquecidas de células precursoras de oligodendrócitos murino (OPCs) em cultura primária, que se diferenciam para produzir oligodendrócitos maduros (MQO). Além disso, este relatório descreve as técnicas para produzir murino myelinating co-culturas semeando OPCs do mouse sobre uma cama de neurite do mouse neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRGNs).

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O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues. J. Vis. Exp. (54), e3324, doi:10.3791/3324 (2011).

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Abstract

Identificar os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento OL não é apenas fundamental para ampliar nosso conhecimento da biologia OL, mas também tem implicações para a compreensão da patogênese de doenças desmielinizantes, como esclerose múltipla (MS). Desenvolvimento celular é comumente estudada com modelos de cultura primária da célula. Cultura de células primárias facilita a avaliação de um tipo de célula dada por fornecer um ambiente controlado, livre das variáveis ​​externas que estão presentes in vivo. Enquanto culturas OL derivados de ratos têm proporcionado uma grande quantidade de insights sobre a biologia OL, esforços semelhantes ao estabelecimento de culturas OL de camundongos, foi recebido com grandes obstáculos. Desenvolvimento de métodos para a cultura murino OLS primário é imperativa, a fim de aproveitar as linhas disponíveis camundongo transgênico.

Vários métodos para a extração de OPCs a partir de tecido de roedores têm sido descritos, variando de derivação neurosphere, purificação de adesão diferencial e immunopurification 1-3. Embora muitos métodos oferecer maior sucesso, requerem tempos de cultivo extensivo e / ou equipamentos de alto custo / reagentes. Para contornar isso, purificando OPCs do tecido murino com uma adaptação do método originalmente descrito por McCarthy & de Vellis 2 é o preferido. Este método envolve fisicamente OPCs separação de uma cultura mista glial derivado de córtices roedores neonatal. O resultado é uma população purificada OPC que podem ser diferenciados em uma cultura OL-enriquecido. Esta abordagem é atraente devido ao seu tempo relativamente curto a cultura ea exigência desnecessária para fatores de crescimento ou anticorpos immunopanning.

Enquanto explora os mecanismos de desenvolvimento OL em uma cultura purificada é informativo, não proporcionar o ambiente mais fisiologicamente relevantes para a avaliação de mielina formação da bainha. Co-cultura de MQO com os neurônios emprestaria visão sobre as bases moleculares que regulam OL-mediada mielinização dos axônios. Para muitos OL / neurônio co-cultura estudos, os neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRGNs) provaram ser o tipo de neurônio de escolha. Eles são ideais para co-cultura com MQO, devido à sua facilidade de extração, quantidade mínima de células contaminantes, e formação de camas neurite denso. Enquanto estudos usando ratos / mouse myelinating xenocultures foram publicados 4-6, um método para a derivação de tais OL / DRGN myelinating co-culturas de pós-natal do tecido murino não tem sido descrita. Aqui apresentamos métodos detalhados sobre a forma de produzir tais culturas, juntamente com exemplos de resultados esperados. Estes métodos são úteis para tratar de questões relevantes para o desenvolvimento OL / função myelinating, e são ferramentas úteis no campo da neurociência.

Protocol

Declaração de ética

Os ratos utilizados neste trabalho foram tratados de acordo com o Conselho Canadense on Animal Care (CCAC) orientações. Aprovação ética para experimentos realizados foi obtida a partir da Universidade de Ottawa Animal Care Comissão sob o protocolo número OGH-119.

1. Dissecção - córtex do rato neonatal para OPC extração

  1. Sacrifício P0-P2 rato acordo com as diretrizes institucionais.
  2. Dissecar o cérebro e coloque em um prato de Petri contendo gelada MEM (sem antibiótico).
  3. Transferir o prato a um microscópio de dissecação.
  4. Usando um bisturi com o lado dorsal do cérebro para cima, fazer uma incisão sagital rasas ao longo da borda mais medial de cada córtex (Fig. 1a). Esta incisão só deve passar através da camada meníngea, a fim de facilitar a sua remoção.
  5. Use uma pinça bem cotado para descolar as meninges de forma lateral. Se feito com cuidado, esta camada pode ser removido em uma única peça. Durante esta etapa, retire os bulbos olfativos.
  6. Com o cérebro ventral voltada para cima, faça uma incisão profunda sagital, onde o córtex atende a região ventral do diencéfalo (Fig 1b).
  7. Com o cérebro dorsal lateral-up, separe os córtices do mesencéfalo erguendo o tecido em um medial à moda lateral (Fig. 1c, c '). Remova qualquer meninges residual nesta etapa.
  8. Dice cada córtex em aproximadamente 4 pedaços e delicadamente transferência para um tubo cônico de 15 mL contendo 350 mL de MEM cérebro do rato por. Manter o tubo em gelo até que todos os ratos foram processadas.
  9. Repita os passos de 1,1-1,8 por ratos restantes.

2. Dissociação dos córtices neonatal e manutenção de culturas mistas glial

Nota: A introdução de bolhas na suspensão de células devem ser evitados durante todas as etapas seguintes.

  1. Adicione o tubo cônico contendo 15 mL dos cérebros recém-dissecado para um banho de água 37 ° C por 3 min.
  2. Transferência de cérebros para um capuz estéreis de cultura de tecidos.
  3. Suavemente passar córtices picado por uma ponteira P1000 para gerar fragmentos menores. Parar pipetagem uma vez que não há peças cérebro grande o suficiente para atrapalhar um bom fluxo de suspensão através da ponta da pipeta.
  4. Adicionar 75 mL de solução de papaína por OPC cérebro para dentro do tubo cônico. O OPC solução papaína deve ser pré-aquecido a 37 ° C por 20 min antes do uso.
  5. Incubar em banho-maria a 37 ° C por 20 min. Aproximadamente a cada 2 minutos, inverter o tubo para evitar a agregação do tecido. Durante este tempo, adicionar 5 mL de meio de cultura mista glial a cada poli-L-lisina (PLL) revestido (1 mg / mL) T25 frasco (um frasco por cérebro de rato), e coloque em um 37 ° C de cultura de tecidos na incubadora 8,5% CO 2.
  6. Após 20 min, o retorno a suspensão de tecido para a capa estéril e adicionar 2 mL de meio de cultura mista glial por cérebro para o tubo. Deixe descansar por 10 min em temperatura ambiente para permitir que a inativação da solução de papaína OPC.
  7. Suspensão da alíquota do tecido em 5 mL de tubos de plástico. O número de tubos devem corresponder ao número de cérebros dissecados, resultando em aproximadamente 2,5 mL por tubo.
  8. Usando um estéril chama-polida de vidro Pasteur pipeta, gentilmente triturar o tecido em cada tubo. Triturar lentamente no início, e gradualmente aumentar a velocidade como peças de dissociar. Triturar cerca de 10-15 vezes, no entanto este número pode variar de acordo com a eficácia da digestão.

Nota: De acordo com trituração, resultará em má dissociação do tecido, enquanto que mais de trituração, terá um impacto negativo na viabilidade celular. É importante não introduzir bolhas na solução, pois isso irá afetar seriamente a viabilidade celular.

  1. Uma vez que não existem pedaços de tecidos remanescentes visíveis na suspensão, a transferência para um tubo cônico de 50 mL contendo 4 mL de meio de cultura mista glial por cérebro (ou seja, 4 = 16 mL cérebros mista glial meios de cultura).
  2. Inverta delicadamente o tubo cônico de 50 mL e repetir para os restantes 5 tubos mL.
  3. Alíquota da suspensão de células agrupadas em 15 mL tubos cônicos (aproximadamente 6,5 mL por tubo de 15 mL). O número de tubos de 15 mL deve corresponder ao número de cérebros dissecados.
  4. Centrifugar os tubos a 1200 rpm (~ 300 g) por 5 min.
  5. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e adicionar 1 mL de meio de cultura morna misturado glial a cada tubo 15 mL cônico.
  6. Lentamente, ressuspender o sedimento com uma pipeta P1000, tomando cuidado para não introduzir bolhas. Adicione a suspensão celular de cada tubo para uma pré-equilibradas PLL revestido T25 frasco, tornando o volume total dos meios de cultura a 6 mL.
  7. Colocar o balão em uma incubadora de cultura de tecidos por 3-4 horas para permitir que as células para anexar ao substrato PLL. Realizar uma mudança completa de mídia por pipetagem a mídia, ea adição de 6 mL de meio de cultura fresco misturado glial para os frascos. Essa etapa remove muitos dos fragmentoscausada pela trituração, e promove a viabilidade da cultura. Se OL / DRGN co-culturas são desejadas, consulte a Seção 3 do presente protocolo.
  8. Após 3 dias de cultura, realizar uma alteração de 2 / 3 de mídia através da remoção de 4 mL de mídia, e substituindo com 4 mL de meio de cultura fresco misturado glial. Neste ponto, uma monocamada astrócitos devem estar se formando sobre a base dos frascos.
  9. No dia 6, realizar outra mídia 03/02 mudança e complementar os frascos com uma concentração final de 5 de insulina mcg / mL. Neste ponto, uma monocamada astrócitos devem ser claramente visível, no topo do qual OPCs será proliferando.

3. Isolamento DRGN

Nota: Para produzir OL / DRGNs co-culturas, DRGNs deve ser estabelecido o dia após geração cultura mista glial. Ambos os tipos de cultura são cultivadas de forma independente, e combinado após 90-10 dias.

  1. Sacrifício P5-P10 rato acordo com as diretrizes institucionais.
  2. Extrato da coluna vertebral, e transferir para um prato de Petri limpa.
  3. Apare tanto músculo e osso da espinha possível (Fig. 1d, d '), pois isso irá facilitar a dissecção dos gânglios da raiz dorsal (DRGs).
  4. Transferência da espinha cortado para uma placa de Petri nova ventral lateral-up. Com uma tesoura de dissecção e começando caudalmente, corte medial através da coluna vertebral de forma longitudinal.
  5. Usando dois pares de fórceps, gentilmente forçar a abertura da coluna vertebral para expor a medula espinhal.
  6. DRGs pode ser encontrada abaixo e lateral para a medula espinhal. Usando uma pinça fina com ponta, remova cuidadosamente a DRGs, evitando danos para os gânglios (Fig. 1e).
  7. Transferir os DRGs removido para solução gelada de Hank sal tamponado (HBSS, sem antibiótico) em uma placa de Petri novo. O dissector devem procurar extrair 40 DRGs por mouse (Fig. 1f).
  8. Uma vez que o DRGs foram extraídos, aparar as DRGs de qualquer raízes excessivamente longo (Fig. 1g, g ') para minimizar a introdução de células contaminantes na cultura (células gliais, fibroblastos).
  9. Transferir os DRGs a um tubo de centrífuga de 1,5 mL contendo 500 mL de HBSS gelado.
  10. Centrifugar a 1200 rpm (~ 300 g) por 5 min a 4 ° C para agregar as DRGs.
  11. Transferir os tubos de centrífuga de um capuz estéreis de cultura de tecidos e remover o HBSS dos tubos.
  12. Adicionar 500 mL de pré-aquecido (20 min a 37 ° C) DRG solução papaína, e incubar os tubos em banho-maria a 37 ° C por 10 min. Inverter os tubos cada 2 min para evitar a agregação do tecido.
  13. Repita o passo 3.10.
  14. Remover a solução papaína DRG e adicionar 500 mL de pré-aquecido (20 min a 37 ° C) Uma solução de colagenase. Incubar em banho-maria a 37 ° C por 10 min, invertendo a cada min 2.
  15. Repita o passo 3.10.
  16. Remover o sobrenadante e adicionar 1 mL de DRGN mídia. Inverter várias vezes tubo.
  17. Repita o passo 3.10.
  18. Repita o passo 3.16.
  19. Um casaco estéril chama-polido vidro Pasteur pipeta com albumina de soro bovino (BSA), pipetando uma solução de BSA 0,25% em HBSS várias vezes. O revestimento com solução BSA impedirá a DRGs de aderir às paredes da pipeta de vidro.
  20. Triturar os DRGs com a pipeta BSA revestido suavemente no início, e com intensidade crescente, uma vez clumps começar a dissociar. Triturar cerca de 10-15 vezes, no entanto este número é dependente do grau de digestão, eo número de DRGs por tubo.
  21. Uma vez que a dissociação é alcançado, passar a suspensão através de um filtro de 50 mm em uma placa de Petri estéreis, contendo 7 mL de DRGN mídia. Filtração vai eliminar grande parte dos detritos da suspensão de células, embora este passo não é crítica.
  22. Incubar a placa de Petri de 8,5% de CO 2 para cerca de 1,25 horas.
  23. Brasão várias lamelas 12 mm com LN2 (10 mcg / mL em PBS) em um prato de 24 bem durante este tempo de incubação.
  24. Uma vez que a incubação terminar, observe a placa de Petri em campo brilhante. DRGNs são identificados como grandes bodied, fase de celas escuras. Agitar o prato Petri delicadamente para levantar qualquer DRGNs aderido.

Nota: Muitas células contaminando terá fortemente aderidas à placa de Petri, enriquecendo a sua suspensão de células para DRGNs.

  1. Transferir a suspensão de célula para um tubo cônico de 15 mL. Lave o prato com 4 mL de DRGN mídia para recolher qualquer DRGNs residual. Transferir a 4 mL adicional para o tubo cônico.
  2. Centrifugar por 5 min a 1200 rpm (~ 300 g).
  3. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 mL de mídia DRGN fresco.
  4. Calcule o número de DRGNs rendeu utilizando um hemocitômetro. Certifique-se de apenas contar o DRGNs, e outros tipos de células não. DRGNs podem ser identificadas por seus grandes corpos celulares esférica.
  5. Semente 30.000-50.000 DRGNs a cada lamela LN2 revestido em 1 mL de DRGN mídia, e colocar em um 37 ° C de cultura de tecidos incubadora a 8,5% de CO 2 durante a noite.
  6. Na manhã seguinte, faça uma mudança completa de mídia, substituindo o dragãomeios de comunicação com a mídia OL (menos CNTF) com uma concentração final de 1% Pen / Strep e 10 FuDR mM.
  7. Nos dias 3 e 5, executar um 04/03 mudança de mídia com a mesma mídia como na Etapa 3,30.
  8. No dia 7, executar uma mudança completa de mídia com a mídia OL (menos CNTF, Pen / Strep, FuDR).
  9. No dia 9, o DRGNs deveria ter formado uma cama neurite extensa, e está agora pronto para ser co-cultivados com OPCs.

4. Purificação de OPCs de culturas mistas glial para o estabelecimento de OL enriquecido culturas ou OL / DRGN co-culturas

  1. No dia 9 de cultura mista glial, a transferência dos frascos a um agitador orbital em um 5% CO 2 de cultura de tecidos incubadora. Colocar o balão em cima do vazio T25 frascos para evitar que o calor gerado a partir do agitador orbital prejudiquem as culturas mista glial. Permitir que as culturas para equilibrar a esta nova incubadora por 1 hora.
  2. Uma vez que os frascos têm equilibrada, agite o frasco a 50 rpm por 45 min. O objetivo deste agitar é remover todas as células frouxamente aderente contaminação da monocamada.
  3. Mover células para uma capa de cultura de tecidos e remover todos os meios de comunicação dos frascos. Substituir com 4 mL de meio de cultura fresco misturado glial suplementado com 5 mg / mL de insulina.
  4. Colocar o balão de volta para o shaker, e deixar estabilizar durante cerca de três horas.
  5. Uma vez que os frascos são equilibradas, fixá-las de forma segura para o agitador orbital, e agitar os frascos por cerca de 16 horas a 220 rpm (overnight).
  6. Na manhã seguinte, se MQO devem ser cultivadas na ausência de DRGNs (ie, OL enriquecido cultura), casaco várias estéril lamínulas 12 mm com LN2 (10 mcg / mL em PBS) por 1 hora. Transferir as lamelas de 24 poços pratos, lavar com PBS seguido por uma lavagem de mídia OL. Adicionar 1 mL de mídia OL a cada poço e se equilibram em 8,5% CO 2.
  7. Equilibrar 10 centímetros placas de cultura de tecidos em 5% CO 2 por 30 min. Um prato será necessário para cada 2 frascos. Estes serão usados ​​para o enriquecimento de adesão diferencial do OPCs suspenso.
  8. Uma vez que o período de 30 min de equilíbrio passou, transferir a mídia dos frascos agitados para os pratos. Cada prato deve receber media de 2 frascos, equivalente a aproximadamente 8 mL de suspensão celular por 10 prato cm.
  9. Incubar os pratos em 5% CO 2 por 30 min, ao fornecer um pequeno empurrão na marca de 15 min. Este nudge irá ajudar a evitar OPCs de aderir ao prato de 10 cm.
  10. Uma vez que a incubação é completa, examine os pratos em campo brilhante. OPCs são identificadas como aglomerados de células pequenas, tipicamente de 3-5 células, mas às vezes formam grandes agregados lembrando neurospheres. Muitas células não-OL linhagem deve ser firmemente aderido à base do prato. Agite suavemente as placas para separar qualquer OPCs frouxamente aderidas, e transferir a suspensão de células de cada placa em um tubo cônico de 15 mL.
  11. Centrifugar a 1200 rpm (~ 300 g) por 5 min.
  12. Ressuspender o sedimento em 1 mL de mídia OL com uma ponteira P1000, seguido por ressuspensão com uma ponteira P200.
  13. Contar as células usando um hemocitômetro.
  14. Para enriquecer-OL culturas, sementes 25.000 - 50.000 OPCs a cada 12 milímetros lamela LN2 revestido em um volume final de 1 mL de mídia OL.
  15. Para OL / DRGN co-culturas, realizar uma mídia completa OL (menos CNTF) mudança no DRGNs da seção [3], e delicadamente adicione 50.000 células da suspensão de células OPC-enriquecido. Tome cuidado para não perturbar a cama neurite DRGN durante a adição de OPCs.
  16. Coloque as culturas em uma incubadora de 37 ° C em 8,5% de CO 2, e evitar a remoção até a fixação. OPCs murinos são sensíveis às mudanças no pH, e remoção da incubadora irá alterar o pH dos meios de comunicação OL. Também digno de nota, a adição de dH 2 O aos poços vazios em torno da cultura de células irá evitar a evaporação do meio de cultura, minimizando assim as flutuações no solutos concentrações na mídia OL. Isto proporcionará um ambiente mais consistente para o OPCs.

5. Processamento de culturas para a microscopia de imunofluorescência

  1. Fix culturas com metanol 100% a -20 ° C por 10 min, ou paraformaldeído a 3% em temperatura ambiente por 15 min.
  2. Permeabilizar lamínulas com 0,1% Triton-X-100 por 10 min, lave com bloco de tampão fosfato (PBS) e por uma hora no soro de cabra 10%.
  3. Lamínulas incube com anticorpos primários diluídos em solução de bloqueio durante a noite a 4 ° C.
  4. Lavar lamínulas 3 vezes com PBS e incubar com anticorpos conjugados Alexa-fluor secundário (Invitrogen) diluída em solução de bloqueio por 45 min.
  5. Contracoloração com 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e lave várias vezes com lamínulas PBS.
  6. Monte lamínulas em DAKO fluorescentes meio de montagem.
  7. Analisar slides através de microscopia de imunofluorescência. Neste protocolo, as lâminas foram analisadas com qualquer um Axiovert Zeiss de fluorescência 200M invertidamicroscópio ou um Zeiss LSM 510 META laser de varredura do microscópio confocal.

6. Extração de proteínas de células íntegras de OL enriquecido culturas

  1. Remover 24 bem culturas de incubadora e fresco no gelo por 3 min.
  2. Remova cuidadosamente mídia, e adicione 10-20 mL de tampão de lise (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, desoxicolato de sódio 0,5%, 1% Triton-X-100, com pepstatin 0,1%, a aprotinina, PMSF, leupeptin, ortovanadato de sódio) para cada poço (Um mínimo de oito poços por amostra é sugerido).
  3. Raspe poços usando um grande furo ponteira P1000, e transferir o lisado a um tubo de centrífuga de 1,5 mL.
  4. Passe o lisado através de uma seringa de 30 ½ calibre cerca de 15 vezes, e frio no gelo por 30 min.
  5. Centrifugar a 14.000 rpm tubos (~ 20.000 g) por 15 min a 4 ° C.
  6. Transfira o sobrenadante para novos tubos de centrífuga, e armazenar a -80 ° C.

7. SDS-PAGE análise sobre enriqueceu-OL proteína cultura

  1. Resolve 30 mg de proteína por amostra na redução de buffer por SDS-PAGE no padrão de 12% de acrilamida-poly géis.
  2. Semi-seco géis transferência para membranas PVDF.
  3. Membranas de bloco para uma hora em 5% leite em pó desnatado em TBST (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20).
  4. Incubar membranas com anticorpos primários diluídos em solução de bloqueio por 1 hora.
  5. Lavar 3 vezes com membranas TBST por 10 min.
  6. Incubar a membrana com HRP-conjugado anticorpos secundários por 45 min em solução de bloqueio.
  7. Lavar várias vezes com membranas TBST, e incubar com Amersham ECL Plus reagente de detecção western blotting (GE Healthcare) por 5 min.
  8. Detectar bandas de proteínas com filme de imagem padrão científico.

8. Resultados representativos:

Neste protocolo, OPCs são expandidas em uma monocamada astrócitos dentro de uma cultura mista glial. Esta cultura mista glial é derivado de P0-P2 córtex do rato neonatal. No dia 1 in vitro (div1), a cultura mista glial contém células com morfologias diferentes como pode ser visto por microscopia de contraste de fase (Fig. 2a). No Div3, uma monocamada astrócitos começa a se formar na base do frasco, e ao DIV8, OPCs podem ser claramente observados na superfície monocamada. No DIV9, o OPCs proliferando atingiram densidade suficiente para ser purificada pela agitação em alta velocidade durante a noite orbital. Uma vez que o processo de purificação foi concluída, o resultado é uma população de células OPC-enriquecido. No div1 pós-purificação, OPCs têm morfologia simples, estendendo-se alguns processos (Fig. 2b). No Div3 purificação post, as células têm estendido uma malha complexa de processos, uma reminiscência de OLS imaturo. No DIV6 purificação post, o OLS purificada têm achatada e projetada folheto-como estruturas de membrana. Este desenvolvimento morfológico é típico da maturação in vitro de OLS.

Microscopia de imunofluorescência indica as células purificadas são de OL-linhagem (Fig. 3). Semeado OPCs inicialmente expressam sulfato de condroitina proteoglicanos (NG2), e se desenvolvem em mielina associados glicoproteína (MAG) positivo OLS imaturos dentro de três dias após a semeadura (Fig. 3b). No DIV6, muitos OLS expressam a proteína básica de mielina (MBP), e possuem a morfologia típica madura OL. Por cento OL-linhagem de células foram quantificadas em momentos diferentes para determinar a pureza das culturas OL-enriquecido (Fig. 3c). No div1 purificação post, as culturas são 50 ± 14% NG2 OPCs ve +, sem ve + MAG ou MBP + OLS ve. Isso indica que o OL-purificada linhagem de células estão em fase de precursor na época de semeadura, com números insignificantes de OLS diferenciadas. No Div3, OLS muitos diferenciados em células MAG + ve (24 ± 5,9%), enquanto alguns mantêm o fenótipo precursor, e permanecem NG2 + (13 ± 8,0%). No Div3, uma pequena proporção de células MAG + ve (3,2% 1.2) são também expressando MBP. No DIV6, 20 ± 5,9% do OLS são MAG + ve enquanto 12 ± 7,3% persistem como NG2 + OPCs ve. Além disso, 21 ± 9,3% de células dentro da cultura são MBP + OLS ve neste momento do tempo. SDS-PAGE análise mostra a expressão classificados de 2'3'-cíclica de nucleotídeo 3'-fosfodiesterase (CNP) e PAM durante o período de seis dias de cultura, demonstrando a capacidade de OPCs em cultura para se diferenciar em terminais OLS maduros (Fig. 3d ). Coletivamente, estes dados estabelece este método como um meio de produzir um sistema de cultura OL enriquecido adequado para o estudo da maturação de OPCs OL.

Este protocolo também descreve métodos para estabelecer OL / DRGN co-culturas que utilizam fontes de murino apenas o tecido. No entanto, a fim de produzir a co-cultura, DRGNs primeiro deve ser cultivado sozinho para produzir uma rede de neurite adequada. Estes pós-natal culturas de neurônios de camundongos são cultivadas por 9 dias em baixa media de soro com 10 mM FuDR suplementação para evitar a proliferação de fibroblastos e contaminando gl células ial. Ao longo de nove dias in vitro, DRGNs isolados produzem uma cama de neurite densa (Fig. 4). Esta cama é neurite imunopositivas para o neurofilamento marcadores neuronais 200 (NF) e Tuj1 (Fig. 4b). Neste ponto, OPCs purificada pode ser adicionado à cama neurite, e cultivadas por um período adicional de seis dias para produzir myelinating co-culturas.

No DIV6 de OL / DRGN co-cultura, MBP muitos + ve OLS pode ser observado entre as neurites NF + ve DRGN (Fig. 5). Após um exame mais detalhado, OLS são evidenciados para fazer contato com neurites DRGN numerosos, muitas vezes ensheathing-los com um MBP + ve membrana (Fig. 5b, c).

Figura 1
Figura 1. Dissecção imagens de microscópio de aspectos específicos do córtex do rato neonatal e isolamento DRG. (A) Vista dorsal de um cérebro de camundongo recém-extraídos neonatal. As linhas pontilhadas indicam a área onde as incisões devem ser feitas para facilitar a remoção da camada meníngea. (B) vista ventral do cérebro, linhas pontilhadas indicam a área onde o córtex encontra o diencéfalo ventral. Incisões profundas devem ser feitas ao longo das linhas pontilhadas para ajudar no isolamento do córtex. (C-c ') representação visual de como erguer o córtex longe do restante do cérebro. (D) Um recém-isoladas P5-P10 espinha do rato antes de aparar afastado muscular em excesso e osso (d '). (e) Localização de DRGs dentro da coluna vertebral. (f) O número aproximado de DRGs que deve ser isolado de um mouse. (g) A DRG com raízes longas que exigem corte antes da digestão enzimática. A linha pontilhada indica a região onde as raízes devem ser aparadas. (G ') DRG pós-raiz de corte.

Figura 2
Figura 2. OPCs são expandidas dentro de uma cultura mista glial, purificada e, posteriormente, como uma cultura diferenciada OL-enriquecido. (A) Fase imagens de contraste de culturas mista glial em diferentes estágios de desenvolvimento. No div1, as células aparecem rodada com poucas células achatadas. Estratificação da cultura mista glial começa em Div3, onde astrócitos formam uma monocamada uniforme na base do frasco, sobre a qual OPCs proliferar. OPCs muitos são vistos em DIV8 (setas) aderidos à superfície da monocamada de astrócitos. (B) Uma vez purificada a partir da cultura mista glial, div1 OPCs ter estendido apenas alguns processos. No Div3, as células têm estendido muitos processos, uma reminiscência de estágio intermediário OLS. No DIV6, OLS achatada (asterisco) parecem ter produzido folhas membranosas (linha pontilhada). Barras de escala, 50 mm.

Figura 3
Figura 3. Caracterização de OL enriquecido cultura. (A) imagens Confocal de OLS isoladas em diferentes estágios de desenvolvimento. NG2 + OPCs ve ter morfologia simples, enquanto OLS + ve MAG possuem vários processos arborizada. MBP + OLS ve ter estendido membranosa mielina como folhas. Barra de escala, 50 mm. (B) OL-purificada linhagem de células originam como OPCs e diferenciar em MAG + ve, MBP OLS + ve mais de 6 DIV. No div1, todos são OPCs NG2 + ve, enquanto nenhum é MAG ve + ou MBP + ve. No Div3, MAG + ve e MBP poucos OLS + ve são agora evidentes. A maioria dos MQO são MAG e MBP ve + na DIV6, com poucos remanescentes NG2 + OPCs ve. Barra de escala, 100 mm. (C) Os valores médios ± DP do percentual OL-linhagem de células em diferentes estágios de desenvolvimento mais de 6 DIV. No div1, todas as células OL-linhagem são NG2 + ve de contabilidade, por 50 ± 14% do total de células na cultura. No Div3 e DIV6, OL-linhagem de células, respectivamente responsáveis ​​por 36 ± 6,8% e 32 ± 8,4% do total de células, que consiste em proporções variáveis ​​de NG2 + ve, MAG + ve e MBP + OLS ve. (D) SDS-PAGE realizadas em proteínas derivadas de enriquecimento OL-culturas demonstrando a expressão classificados de OL-marcadores CNP e MBP durante o período de 6 a cultura DIV.

Figura 4
Figura 4. Caracterização da semeadura da cultura DRGN pré-OPC. (A) Fase imagens de contraste de DRGNs durante o período de 9 a cultura DIV pré-OPC semeadura. DRGNs originam como de grande porte células com poucos processos, e produzir uma rede de neurite cada vez mais complexas. Barra de escala, 100 mm. (B) imagens Confocal de culturas DRGN fixado em DIV9 (pré-semeadura OPC) e coradas para neurônio-específica e marcadores Tuj1 NF200. DRGNs produziram uma rede de neuritos em que OPCs podem ser semeados para produzir OL / DRGN myelinating co-culturas. Barra de escala, 50 mm.

ent "> Figura 5
Figura 5. OLS co-cultivados com DRGNs resultar em OL-mediada ao acondicionamento de neurites DRGN com MBP + membrana ve. (A) Uma imagem de campo de 4-confocal montagem de um DIV6 OL / DRGN co-cultura. MBP muitos + ve MQO podem ser vistos interagindo com a cama subjacente neurite DRGN. Barra de escala, 100 mm. (B) Uma visão ampliada confocal de MBP + OLS ve embrulho DRGN neurites múltiplas. Barra de escala, 50 mm. (C) ampliação Digital da região denotada em (b) onde uma neurite DRGN está sendo enrolado com membrana OL. Barra de escala, 25 mm.

Discussion

Este relatório descreve um método para isolar OPCs murino para a diferenciação em culturas OL-enriquecido ou OL / DRGN co-culturas. Quando cultivadas por si só, o OPCs diferenciar em MBP + ve OLS, produzindo mielina como folhas membranosas. Quando adicionado ao DRGN camas neurite, OLS envolver o neurites DRGN com MBP + membrana ve. Este modelo beneficia a investigação dos fundamentos complexos que regem OL-mediada ensheathment axonal.

Embora de grande valor, o estabelecimento de tais culturas é um desafio técnico. Em particular, os aspectos exigentes incluem a digestão do tecido eficiente / dissociação, manutenção de pH equilibrado meios de cultura, e as mudanças DRGN mídia. É importante considerar que o comprimento da digestão, a quantidade de tecido a ser digerida e da quantidade de trituração afeta o resultado final da eficácia e da dissociação do tecido. Não é incomum para investigadores experientes para obter baixos rendimentos a partir de celulares dissociados tecidos do sistema nervoso. Além disso, OPCs murino tendem a ser sensíveis às mudanças no pH do meio de cultura, especialmente sob condições alcalinas. A manutenção de culturas em 8,5% CO 2 visa evitar isso, desde OPCs parecem tolerar melhor as condições mais básicas ligeiramente ácido. Com relação ao DRGNs alimentação, alterações de mídia deve ser realizada rapidamente para não desidratar os neurônios, no entanto, deve ser suave para não perturbar a cama neurite em desenvolvimento. Mudanças bruscas de mídia pode desalojar a cama neurite do substrato, e que resultam em sua dissociação completa da lamela.

O mérito potencial deste sistema modelo muito ofusca sua natureza tecnicamente exigente. Uma vantagem deste sistema é a utilização de ratos pós-natal para derivação de cultura de células, evitando a necessidade de sacrifício fêmeas reprodutoras para a colheita de tecido embrionário. Outra vantagem é a falta de exigência de fatores de crescimento (GFs) para a expansão da OPCs. Mistas culturas gliais proporcionar um ambiente que suporta a propagação de OPCs, provavelmente devido à presença de fatores de astrócitos derivados trófica. Outros métodos, como a derivação via neurospheres 7,8, invocar as propriedades mitogênica da FG, como fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF), fator de crescimento epidérmico (EGF) e das plaquetas fator de crescimento derivado (PDGF) para expansão da OPC. Da mesma forma, usando pós-natal (P5-10) para ratos DRGNs evita a necessidade de complementar os meios de cultura com fator de crescimento neural (NGF), um fator neurotrófico necessários para a sobrevivência in vitro de embriões DRGNs 9, 10. É de interesse para evitar o uso de NGF, uma vez que influencia negativamente a capacidade myelinating de OLS quando cultivadas com DRGNs 4. Evitando o uso de GF-suplementado mídia também tem benefícios econômicos, uma vez que estes reagentes tornar-se caro quando usado em larga escala.

Talvez o benefício mais importante deste modelo de cultura é sua derivação do rato-somente tecidos, proporcionando assim as oportunidades para derivar tanto OPCs e DRGNs da grande variedade de linhas de ratinhos transgénicos. Isto permite o estudo de ambos e DRGN / ou OPC propriedades específicas que regem a mielinização. Isto será especialmente importante para a elucidação das interações receptor / ligante regulação OL-mediada mielinização dos axônios. Ao todo, esta técnica é de grande valor com relação à pesquisa em neurociência, devido à suas aplicações para a compreensão dos sinais moleculares subjacentes mielinização.

Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Este projeto foi financiado por uma doação da Sociedade de Esclerose Múltipla do Canadá para RKRWO é um receptor de um Studentship da Sociedade de Esclerose Múltipla do Canadá. SDR é um receptor de Bolsas de Pós-Doutorado da Sociedade de Esclerose Múltipla do Canadá e Canadian Institutes of Health Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Multicell 319-005-CL
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Invitrogen 14170-112
Minimum Essential Media (MEM) GIBCO, by Life Technologies 12360-038
Fetal Bovine Serum (FBS) GIBCO, by Life Technologies 10091-148
Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) GIBCO, by Life Technologies 15140-122
GlutaMAX Invitrogen 35050-061
Poly-l-lysine Sigma-Aldrich P2636
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503
Human merosin purified protein (LN2) EMD Millipore CC085
Recombinant rat ciliary neurotrophic factor (CNTF) PeproTech Inc 450-50
L-thyroxine Biochemika 89430
Holo-transferrin Sigma-Aldrich T0665
B27 supplement GIBCO, by Life Technologies 0080085-SA
Bovine insulin Sigma-Aldrich I6634
3,3',5-Triiodo-L-thyronine Sigma-Aldrich I6634
Progesterone Sigma-Aldrich P8783
Putrescine Sigma-Aldrich P7505
Sodium Selenite Sigma-Aldrich S5261
5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FuDR) Sigma-Aldrich F0503
Papain solution Worthington Biochemical LS003126
DNaseI Roche Group 1010159001
L-cysteine Sigma-Aldrich C7352
24-well tissue culture dishes Cellstar 662-160
T25-tissue culture flasks with vent cap Corning 430639
10 cm tissue culture dishes Corning 430167
10 cm petri dish Fisher Scientific 0875713
Collagenase A Roche Group 103578
CellTrics 50 μm filter (optional) PARTEC 04-004-2327
Myelin Basic Protein (MBP) Antibody AbD Serotec MCA409S
NG2 antibody EMD Millipore AB5320
Myelin-Associated Glycoprotein (MAG) antibody EMD Millipore MAB1567
2',3'-Cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNP) antibody Covance SMI-91R-100
Actin pan Ab-5 antibody Fitzgerald 10R-A106AX
Neurofilament-200 (NF) antibody Sigma-Aldrich N4142
Tubulin beta-3 chain (Tuj1) antibody EMD Millipore MAB5544
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11008
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A21422
Alexa Fluor 647 goat anti-rat (IgG) (H+L) secondary antibody Invitrogen A21247
Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody Bio-Rad 170-6516
Goat anti-rat IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-2065
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542

Media Recipes

100X OL-Supplement*

IngredientAmount to add
DMEM100 mL
BSA1.02 g
Progesterone0.6 mg
Putrescine161 mg
Sodium Selenite0.05 mg
3,3',5-Triiodo-L-thyronine4 mg

*Store at -80 °C in 250 μL aliquots

OL media

IngredientAmount to add
DMEM23.75 mL
100X OL-Supplement250 μL
Bovine insulin (from 1 mg/mL stock)125 μL
GlutaMAX250 μL
Holo-transferrin (from 33 mg/mL stock)37.5 μL
B27 Supplement500 μL
FBS125 μL
CNTF (from 50 ng/μL stock)25 μL

Mixed glial culture media (made up in DMEM)

IngredientFinal concentration
FBS10%
Pen/Strep (0.33% from stock)33 units/mL Penicillin and 33 μg/mL Streptomycin
GlutaMAX1%

DRGN media (made up in DMEM)

IngredientFinal concentration
FBS10%
Pen/Strep (1% from stock)100 units/mL Penicillin and 100 μg/mL Streptomycin

Digestion Solution Recipes:

OPC papain solution (made up in MEM)

IngredientFinal concentration
Papain solution1.54 mg/mL
L-cysteine360 μg/mL
DNaseI60 μg/mL

DRG papain solution (made up in HBSS)

IngredientFinal concentration
Papain1.54 mg/mL
L-cysteine360 μg/mL

DRG Collagenase A solution (made up in HBSS)

IngredientFinal concentration
Collagenase A4 mg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Avellana-Adalid, V. Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential. J Neurosci Res. 45, 558-570 (1996).
  2. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
  3. Barres, B. A. Cell death and control of cell survival in the oligodendrocyte lineage. Cell. 70, 31-46 (1992).
  4. Chan, J. R. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43, 183-1891 (2004).
  5. Camara, J. Integrin-mediated axoglial interactions initiate myelination in the central nervous system. J Cell Biol. 185, 699-712 (2009).
  6. Ishibashi, T. Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses. Neuron. 49, 823-832 (2006).
  7. Chen, Y. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat Protoc. 2, 1044-1051 (2007).
  8. Pedraza, C. E. Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors. Glia. 56, 1339-1352 (2008).
  9. Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors. J Neurosci. 12, 1896-1905 (1992).
  10. Greene, L. A. Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons. Dev Biol. 58, 106-113 (1977).

Comments

46 Comments

  1. very nice video and presentation....

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 28, 2011 - 12:44 PM
  2. Nice explanation. I have been carrying out this procedure for some time now and find that it works quite well.

    How many OPCs you generally obtain from a single mouse brain?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 26, 2012 - 4:35 PM
  3. Hi - thanks for your comment, typically I yield about ²00,000 OPCs per mouse brain (on average).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 1:04 AM
  4. Excellent. I am using B6 mice, usually P4-5 (because we also take cerebellar neurons from these same pups). I usually yield between 100-130,000 cells/brain. I see some differences in our protocols (I seed three brains/T75, use trypsin instead of papain, etc.). What steps have you found to dramatically increase your OPC yield post shake-off?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 12:17 PM
  5. The largest factor in OPC yield is the efficiency of your digestion (ie. minimal cell death). In addition, the age of the mice from which you isolate the mixed glial cultures is a factor. I think if you go too far past P², many OPCs will be postmitotic, and therefore limit their proliferation capacity. I usually try to go as young as possible (P0) as this seems to work best. If you absolutely need to use P4-P5, maybe try to culture your monolayers longer than 9 days - try waiting ² weeks prior to shake off. Hope this helps - RO

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 1:06 PM
  6. Thanks for the great info. That is interesting, as many of the protocols for the "DeVellis-method" use different enzymatic preparations (trypsin +/- EDTA, +/- DNAase, papain, etc.). I had basically adapted my rat OPC protocol for mice, but am realizing that they are just not the same. I will trip your papain method and let you know how things pan out. Also, is there a reason you use T²5 flasks instead of combining brains into a T75?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 4:55 PM
  7. No there is no specific reason for using T²5, simply this is what I have always been using. I would imagine combining 3 mice into a T75 flask would roughly be the same thing. Good Luck!

    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 12:00 PM
  8. Hi Ryan, nice video and explanation. Do you do lectin panning to further get rid of microglia or do you find that a 30 min incubation at 37 degrees is enough? Also, how do you know cells are ready to shake? are they always ready at day 9? what do you look for specifically?
    thank you

    Reply
    Posted by: luisa t.
    April 10, 2013 - 12:39 PM
  9. hello...I have gone through this video...very nicely presented...but I have one doubt that if I put the flasks on shaker which only maintains temp and speed but not CO² level, the pH will change...would it not allow the OPCs to survive at all??? and can I use HEPES in medium to solve this problem???
    M willingly waiting for your reply....

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 4, 2012 - 12:35 PM
  10. Thank you for your comment, you are correct in that it will not work without CO² buffering. HEPES buffer will likely not solve this problem either. I'm afraid you will absolutely need to have CO² buffering for this isolation to work.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 11:56 AM
  11. Hi, very INFORMATIVE video, I zalak parikh working on glial cells. In your protocol you are not using any filter after papain digestion but I am facing one problem of Fibroblasts contamination. What could be the possible solution for this problem?
    thank you
    Zalak.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 24, 2012 - 7:59 AM
  12. Hi Zalak, thanks for your comment. What glial cell type are you trying to culture? Oligodendrocytes, astrocytes or microglia? I have never experienced fibroblast contamination.. are you sure they are fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 24, 2012 - 10:47 AM
  13. Hi there. Excellent video, very informative. I was just wondering if you can incubate the flasks in 5% CO² instead of 8% CO²?
    Thanks
    Matt

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 11, 2012 - 12:48 PM
  14. Hi Matt, Actually no, you need to have these at at least 8.5% CO² - otherwise you will have trouble establishing your mixed glial cultures - Good luck

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 11, 2012 - 10:22 PM
  15. Hi Ryan. Very nice video and presentation.
    I have to establish a DRG neuronal culture. Majority of all the papers I've read are using a embryonic source of DRG unlike you using post-natal mouse. What do you think will be the major difference between the cultures of the two??

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 1, 2012 - 12:23 PM
  16. Hi Lipi,
    You're right most papers use embryonic DRGs. The benefit of using post-natal DRGs is that you don't have to sacrifice the mother, and if you use P5-P10 mice, there is no need to use nerve growth factor (in my hands). Embryonic DRG neurons require NGF supplementation to the media for their survival. In terms of the difference between cultures, embryonic dervied ones may have a bit more contaminating cells, since I find they divide pretty quickly. Otherwise I imagine they would be the same as post-natal derived cultures. Good luck!

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    October 1, 2012 - 4:37 PM
  17. Thank you Ryan.

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 3, 2012 - 2:39 AM
  18. Thank you Ryan.

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 3, 2012 - 2:51 AM
  19. Great article Ryan. I had a question for you. Our lab generates mixed glial cell cultures by isolating NPCs from P1 mouse pup brains,expanding the NPCs via neurospheres in the presence of GFs, and then plating the spheres on matrigel for subsequent differentiation without GFs. My main goal in using the neurosphere protocol is to obtain OPCs, but I routinely get only ²0-30% O1+ OPCs following 8 days of differentiation on matrigel. GFAP+ astrocytes seem to dominate the whole culture, with OPCs growing on top of them. I wanted to try to incorporate your protocol into the neurosphere protocol by dissociating the spheres using TrypLE or Accutase, plating them on Poly-D-Lysine, letting the astrocytes grow to confluency while having OPCs proliferate on top, and then use the shaking technique to isolate OPCs. Do you think this is possible? When we perform in vitro studies with the NPCs, we usually plate the neurospheres on matrigel for a day and then trypsinize the cells for seeding into new dishes. Not only do I think the trypsin digest kills many OPCs, but I also remove astrocytes from the matrigel that then contaminate my cultures. Thanks for the help!

    Reply
    Posted by: Brett M.
    November 3, 2012 - 7:37 PM
  20. Hi Brett - To answer your question, yes I think it would be possible to do what you are suggesting. However, it seems to be a pretty roundabout approach. I think the more streamlined approach would be to simply seed your dissociated P1 neural cells onto PLL substrate to generate a monolayer. That way you would avoid having to generate neurospheres (which I imagine takes about 10 days) and then subsequently generating an astrocyte monolayer with the spheres (which would take another 10+ days). In my experience, OPCs don't like trypsin. If you wanted, you could try 0.05% Trypsin instead of 0.²5% and that seems to be more gentle. And if you don't incubate for too long, most astrocytes should remain on the plate. Hope this helps! -Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    November 5, 2012 - 12:14 PM
  21. Ryan, thanks for the help! I tried your protocol and everything appeared to go well. However, one issue I ran into occurred during the overnight shaking step and subsequent differential adhesion assay to isolate a more pure population of OPCs. What I noticed was that after the overnight shaking I had many large oligospheres (maybe 10-²0 cells in size). These spheres did not stick down during the 30 minute plate incubation and I had difficulties trying to dissociate them as you described using the P1000 and P²00 tips. When I took the cells counts and plated the cells onto chamber slides, many smaller clumps remained and stuck down to the matrix. However, the clumps did not flatten out on the gel matrix very well (like neurospheres do) and eventually flaked off after about 5 days of cultures, leaving only sparse population of OPCs. Have you ever encountered this problem? I was thinking of seeding at a higher cells density than what you describe in the protocol.

    Reply
    Posted by: Brett M.
    December 2, 2012 - 10:21 PM
  22. Hi Brett - sounds like you're doing everything right. Normally I see lots of these "oligospheres" as a result of the overnight shaking protocol. However, I find that these are not the majority of OPCs, as there are many single cells and cells in clumps of ²-4. The oligospheres are difficult to dissociate, and due to this, I generally do not go out of my way to try and break them up. In my hands, these spheres spread out very nicely after about ²4hrs on Laminin-² substrate. You can try to seed at higher densities if you like, but the seeding density should be determined based on the experiment you want to conduct. For example, if you want to perform immunocytochemistry, it may not be ideal to have a very dense cell culture. Also, it's possible the clumps aren't super compatible with your matrix substrate - I always use Laminin. I hope this helps :)

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    December 3, 2012 - 11:42 AM
  23. HI Ryan, very informative and nice presentation. I have tried your protocol and everything seem to work fine except at the overnight shaking. There were very few OPCs isolated and it seems there are still many OPCs adhere to the astrocytes. Have you encounter this issue?

    Reply
    Posted by: Esther W.
    December 13, 2012 - 3:25 AM
  24. Hi Esther, Thanks for your comment. How many OPCs are you yielding per mouse? I usually yield on average ²00,000 OPCs per mouse brain, but this is quite variable. At times I have yielded 500,000 or 50,000 per brain, and I'm not sure what accounts for this variability. In any case, you will never dissociate 100% of the OPCs from the monolayer, I've noticed a lot remain stuck. My advice would be to simply give it another shot and see if your yields are a bit higher next time. Hope this helps - RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    December 16, 2012 - 5:35 PM
  25. Thanks Ryan for your advice. My yield is definitely much lower than yours. I will definitely try another round. :)

    Reply
    Posted by: Esther W.
    December 16, 2012 - 8:24 PM
  26. HI Ryan, I face the problem of getting immature OPC instead of mature OPC after 6 days of OL-enriched culture. What is your view?

    Reply
    Posted by: Esther W.
    January 23, 2013 - 2:51 AM
  27. Hi Esther, you should always expect to have some OPCs that don't differentiate during the timecourse. However, the majority of OLs should at least be expressing MAG, if not MBP at DIV6. My guess would be that your media is not exactly correct. Make sure that all the ingredients are at the correct concentration in your 100x OL-supplement stock - especially tri-iodothyronine and L-thyroxine (4mg per 100mL). I hope this helps, let me know if you still have problems.

    Posted by: Ryan O.
    January 23, 2013 - 12:56 PM
  28. Thanks Ryan for replying. I have added tri-iodothyronine only as there is no mentioned of L-thyronine in the 100x OL-supp recipe. Can i still add L-thyronine when the OL-enriched is on DIV5?

    Posted by: Esther W.
    January 23, 2013 - 8:05 PM
  29. Thanks for notifying me of this mistake, I'll notify the editorial team ASAP. Yes you can try to add it on DIV5, but no guarantees this will drive them any farther since they are aleady 5 days in. Give the protocol a second try, and let me know if the lack of differentiation still occurs. -Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    January 24, 2013 - 12:47 AM
  30. Hi Luisa thanks for your comment :) I don't do lectin panning, as I find that incubation on the culture plates is enough to get rid of most of them, but if you're having a problem with microglia that is an additional option. I usually shake on day 9, but I've found you can shake anywhere from 9 to 1² days, but any longer than that you will get less OPCs. Generally if you see a lot of cells on top of the astrocyte monolayer, they are ready to go. However in my experience this dŒsn't really happen before day 9. Hope this helps RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    April 10, 2013 - 2:28 PM
  31. Hi Ryan.Thanks for this protocol. I did exactly what you have described in this protocol, except the shaking step. I did it without CO2, but the caps are tightly sealed, how is it possible that CO2 will effect pH of tightly sealed flask? My yield was very low, besides I had fibroblast contamination as well. I used uncoated flasks as well, because once during the shaking all the layer came off the bottom of the flask, what do you think would be the reason for this?.And in my experience when FBS is used in OPC culture media it made OPC's to differentiate to astrocytes rather then oligodendrocytes.Overall I couldnt replicate this procedure unfortunately and trying to find other methods..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 20, 2014 - 5:33 PM
  32. Hi Aysel - from what you describe in your message, you didn't follow my protocol.

    1) So you didn't shake the flasks? Or you didn't use the same method of shaking?

    2) As far as I know, all standard tissue culture incubators have some level of CO2 buffering (usually 5%). Strictly speaking, if you tighten the cap of your flasks, there will be no gas exchange between the incubator and the flask, if you are using plugged caps. I use vent-capped flasks (0.22um pore), so gas exchange occurs between the flask and the incubator when the caps are tight. To answer your question, CO2 buffering will have little-to-no effect on the pH of the media if you are using tightly-screwed plugged flask caps.

    3) I haven't experienced fibroblast contamination in my cultures, I imagine this would be a dissection issue. The only source of fibroblasts I can imagine would be from the meninges, so be sure to fully remove this prior to dissociation of the cortex. Unless you are confusing fibroblasts for astrocytes. Too many astrocytes is a result of too much agitation at the differential adhesion step.

    4) I have always used coated flasks, in my experience OPCs will not adhere to uncoated surfaces. I am willing to bet you'll get almost no OPCs if you continue to use uncoated flasks. If you want you can try to use other substrates such as PDL, poly-O-ornithine, collagen etc.

    5) I haven't noticed any significant transformation of OPCs into astrocytes in the presence of FBS. I imagine this might occur more frequently in immortalized OPC cell lines. Perhaps that's what you are thinking of.

    I hope this helps, otherwise best of luck in your research.

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 20, 2014 - 8:52 PM
  33. Hi Ryan, thank you ver much for detailed answer. Sorry for my english, i couldnt explain good.
    I did the shaking of course but without putting shaker inside the CO2 incubator, I did shaking at 37 degree incubation only and at 180 rpm. Because the flasks are uncoated(I have used uncoated flasks for rat OPC"s without problem, that is why I tried this way with mouse as well) I hesitated to increase rpm to 240 or so, to prevent astrocyte detachment, and I also think that fibroblast contamination is because of the meninges. Second time I will prevent it.
    It is good to know that I must use coated flasks, I will try again, if you say so.
    Thank you so much, good luck to too..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 21, 2014 - 6:22 AM
  34. Hi Again,
    Alright - I strongly suggest to put the shaker in the incubator for the overnight shake, as I have found this to be a crucial step in maintaining pH balance. The media on your cells should always be a rich red colour (indicative of a balanced pH) all the time. Mouse OPCs are very sensitive to pH, and will die with too much fluctuation. If during your shaking, the media becomes at all purple-ish or yellow-ish, your OPC yield will drastically reduce. I wouldn't be surprised either if this was a contributing factor to the monolayer detachment you experienced previously. There is a significant difference in the in vitro behaviour/viability of mouse OPCs as compared to rat, hence the generation of this protocol. Your best bet is to simply follow this protocol exactly as is.

    Thanks for your comment, and good luck,
    Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 21, 2014 - 12:25 PM
  35. Hi.
    One more question Ryan, about amount of the brains seeded, I was seeding 2 rat brains/ T75 flask , in the mouse case to obtain same amount of cells seeded I was using 6 brains per flask. Would you suggest to use 3-4 instead of six? and if i seed 6 animals should I increase concentration of insulin added to mixed culture media? Overall what would be optimum amount of brains per T75 flask in your opinion? Does it matter to much? Because here you use 1 brainper T25 flask.
    Thanks again..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 26, 2014 - 4:20 PM
  36. Hi Aysel,
    Again, your best bet for success is to follow the protocol exactly as is - T25 flasks are what this method has been optimized for. I suppose T75 flasks have 3 times the surface area, so in theory 3 mice would have to be seeded to a T75 to yield the same cell density. I've never tried this protocol with T75 flasks, and I know that different culture vessels have different impact on growth and survival of OLs.
    Best - RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 27, 2014 - 10:47 AM
  37. Hi Ryan . I want to say that I replicated the procedure exactly as here, and have got very good yield, but I have 1 more question to you, majority of OPCs die in the differentiation media after 6-7 days of incubation. You indicated that it is important not to distrub them until fixation, but how do you do the medium chage, I put 1 ml media first day and did 2/3 media change each 3 days, I seeded all cells to one 24 well format plate, at each time points(3 d, 6 d, 9 d) I transfer the slides to new plate and fix them there and do medium change for rest of the slides. By the way I culture OPCs at 5% CO2, becaue I have only 2 options 5% and 10%, i cant adjust ph of the incubators at this time point. Is it the contributing factor for death of the cells after 4-5 days of incubation?

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    March 19, 2014 - 2:43 PM
  38. Hi Aysel - I'm glad to hear things are looking up -

    1. I don't suggest differentiating the OLs for longer than 6 days. If you're finding they are not differentiating fast enough, you can add 4 mg of L-Thyroxine to the 100X OL-supplement (see the media recipe list above).

    2. It is normal to lose OLs over the time course of differentiation. That being said, you don't want to encourage death by moving the cells or culturing at low pH. You should not be changing the media of the purified OL cultures at any point - they do not require media changes. The protocol also says to culture the OLs at 8.5% CO2. Since you have access to both 5 and 10% CO2 incubators, and 8.5 is closer to 10 than it is to 5, I suggest culturing them at 10%.

    3. Rather than culturing all of your time points in one dish, use 3 dishes (one for 3 days, one for 6 etc). That way, you won't have to disturb your other time points.

    4. Do not remove the coverslips from the wells of your 24 well dish during fixation - simply add concentrated PFA directly into the media and allow to fix for about 15 mins at room temp.

    Sounds like you're almost there, Best of luck - Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    March 19, 2014 - 3:58 PM
  39. Let me write it again to see if I have understood you correct, you say dont do any media change ever, neither at 3 days or 6 days or further? The other things I will try what you suggest, culturing and seeding in different plates at 10% CO2
    I want to thank you a lot for your help and all of the explanations.
    Thanks ..
    Best,
    Aysel

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    March 19, 2014 - 4:22 PM
  40. Thats correct :)
    You're very welcome,

    Ryan

    Posted by: Ryan O.
    March 19, 2014 - 5:49 PM
  41. Hi Ryan,

    Thanks for sharing this protocol, looks really good and will try it out. I have a couple of questions regarding your protocol and was hoping you could shed some light on some problem I am experiencing at the moment.

    With regards to what you have just described, we actually perform a very similar mixed glial culture on P0-P3 rat brains. Our isolation stages are very similar with the exception we use DNAse1 and L-cysteine along with Papain. Upon plating our cell suspensions the flasks are densely populated with microglia on top, then opc's below and then astrocytes. We basically shake off our microglia before doing the overnight shake for the OPC's.

    My question is how do you get rid/ not see any microglia in your mouse cultures? Is it also possible to obtain microglia from your method?

    We are currently experiencing problems with obtaining OPC's from our overnight shake (in rat). The cells look healthy when in culture with the microglia but once the microglia are removed and we perform the steps required to plate the OPC's we have a lot of contaminants in with the cells, almost like long fibrous structures that are stained by trypan blue. We still obtain + 5 million OPC's but the cells do not look healthy and the morphology is not consistent with OPC's. Upon plating these cells they fail to show characteristics of OPCs and a lot die off. I will mention we do not shake in an incubator but in an orbital shaker at 250rpm with the caps sealed tight and parafilm. Have you ever encountered this?

    Many thanks .

    Reply
    Posted by: Graeme I.
    February 9, 2015 - 1:06 PM
  42. Hi Graeme, thanks for your question.
    We do in fact get microglia in our mixed cultures, but we remove them prior to the overnight shake with a slow short shake (as in the rat method). These shaken off microglia are a very pure population, and can be cultured separately if desired.
    With regard to the problems you’re encountering shaking your rat cultures, I can’t say I’ve experienced anything quite like what you’re describing. It almost sounds like your cultures are suffering from contamination (maybe yeast?). We’ve experienced contamination a couple of times, and it resulted in much of the monolayer dissociating from the base of the flask during the overnight shake. If you like, you can send me a pic of the fibrous structures in the hopes that I could recognize what they are (romea077@uottawa.ca).
    We have never had luck shaking flasks in an orbital shaker – we exclusively use tissue culture incubators with vented caps. One risk of using an orbital shaker is they pose a threat for contamination, as they are often used for bacterial cultures.
    I hope this helps and best of luck,
    Ryan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 20, 2015 - 11:12 AM
  43. Hi Ryan,

    Thanks for your reply.

    I tried the protocol and achieved very nice OPC's so everything seems ok there.

    With regards to what I was seeing after my rat OPC shake, I believe it not to be of any contamination but more something coming out of solution in our media. As a test I shook DMEM10% in a T75 flask, 37 degrees, 250rpm overnight. The next day I took an aliquot and looked at it with trypan blue. To my surprise I saw the same fibrous clumps that I was seeing after the OPC shake

    . My DMEM only contains FBS and pen-step so this has to be something in FBS. My most recent shake off I decided to shake off 5 flasks with DMEM 10% and 5 flasks with OPC media (our OPC media contains 2.5ml FBS vs 50ml in DMEM). The next day after following normal protocol I counted the cells from both conditions. The OPC media flasks had almost none of the fibrous clumps whereas the DMEM flasks had alot. I can now partially get round this problem by filtering with 40uM strainer but have you ever heard or seen this kind of thing. We have used several batches if FBS so it cannot be that every batch has precipitated proteins in it but perhaps what were doing is causing precipitation of FBS proteins that are affecting the OPC's?

    Thanks

    Graeme

    Reply
    Posted by: Graeme I.
    March 15, 2015 - 4:16 PM
  44. Hi Ryan,

    Is your FBS from Invitrogen decomplemented ? If so did you buy decomplemented or did you heat it at 56*C and for how long.

    Thanks

    Reply
    Posted by: Ludovic D.
    February 24, 2017 - 10:40 AM
  45. Hi Ludovic,
    I've used FBS that has been heat-inactivated by the manufacturer, and I've also used FBS that I've heat inactivated myself. For the latter, if memory serves, about 30 minutes at roughly 50 degrees C should do the trick (water bath).
    Good luck, Ryan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 26, 2017 - 11:49 AM
  46. Hi Ryan,
    I am wondering if you have any experience with adding Cre Recombinase Adenovirus to the cultures? And if you think a particular day would be best to add it? I was thinking of adding it on D8 (1 day before the full media change) but wasn't sure if adding virus and then shaking the cells would cause too much stress?
    Thanks,
    Megan

    Reply
    Posted by: Megan R.
    April 30, 2018 - 2:39 PM

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