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Dérivation des cultures enrichies en oligodendrocytes et Oligodendrocyte / Neuron myélinisantes co-cultures de post-natal tissus murins

Neuroscience
 

Summary

Cet article décrit les méthodes pour estimer la population enrichie des cellules précurseurs des oligodendrocytes murins (OPC) en culture primaire, qui se différencier pour produire des oligodendrocytes matures (MCO). En outre, ce rapport décrit des techniques pour produire murin myélinisantes co-cultures par semis OPC de la souris sur un lit de neurites de souris dorsale neurones ganglion de la racine (DRGNs).

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O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues. J. Vis. Exp. (54), e3324, doi:10.3791/3324 (2011).

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Abstract

Identifier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent le développement OL n'est pas seulement essentielle pour approfondir notre connaissance de la biologie OL, mais a également des implications pour la compréhension de la pathogenèse des maladies démyélinisantes comme la sclérose en plaques (SEP). Développement cellulaire est communément étudié avec primaires modèles de culture cellulaire. Culture de cellules primaires facilite l'évaluation d'un type cellulaire donné en fournissant un environnement contrôlé, sans les variables exogènes qui sont présentes in vivo. Bien que les cultures OL provenant de rats ont fourni une grande quantité de comprendre la biologie de LO, des efforts similaires à établir des cultures OL de souris a été rencontré d'obstacles majeurs. Développer des méthodes de culture murin LO primaire est impératif afin de profiter des lignes disponibles de souris transgéniques.

De multiples méthodes pour l'extraction des OPC à partir de tissus de rongeurs ont été décrites, allant de la dérivation Neurosphère, la purification de l'adhérence différentielle et immunopurification 1-3. Alors que de nombreuses méthodes offrent de succès, la plupart nécessitent des temps de culture extensive et / ou du matériel coûteux / réactifs. Pour contourner cela, purifiant les OPC à partir de tissus murins avec une adaptation de la méthode initialement décrite par McCarthy & de Vellis 2 est préféré. Cette méthode implique physiquement OPC séparant d'une culture mixte gliales provenant cortex des rongeurs nouveau-nés. Le résultat est une population purifiée OPC qui peuvent être différenciées en une culture de l'OL enrichi. Cette approche est attrayante en raison de ses temps de culture relativement courtes et l'exigence inutile pour les facteurs de croissance ou des anticorps immunopanning.

Tout en explorant les mécanismes du développement de LO dans une culture purifiée est informatif, il ne fournit pas l'environnement le plus physiologiquement pertinents pour évaluer la formation gaine de myéline. Co-culture avec des neurones LO donnerait un aperçu des fondements moléculaires régulant l'OL à médiation myélinisation des axones. Pour beaucoup de OL / neurone de co-culture des études, dorsale neurones ganglion de la racine (DRGNs) se sont révélés être le type de neurone de choix. Elles sont idéales pour la co-culture avec LO en raison de leur facilité d'extraction, le montant minimal de cellules contaminantes, et la formation de neurites lits denses. Alors que les études utilisant rat / souris myélinisantes xenocultures ont été publiés 4-6, une méthode pour la dérivation d'une telle OL / DRGN myélinisantes co-cultures de tissus post-natale murin n'a pas été décrite. Nous présentons ici des méthodes détaillées sur la façon de produire efficacement de telles cultures, avec des exemples de résultats escomptés. Ces méthodes sont utiles pour aborder les questions pertinentes pour le développement de LO / fonction myélinisantes, et sont des outils utiles dans le domaine des neurosciences.

Protocol

Déclaration d'éthique

Les souris utilisées dans ce travail ont été soignés selon le Conseil canadien de protection des animaux (CCPA). L'approbation éthique pour les expériences menées ont été obtenus de l'Université d'Ottawa Comité des soins des animaux sous le numéro du protocole OGH-119.

1. Dissection - le cortex de souris néonatales pour les OPC d'extraction

  1. Sacrifice P0-P2 souris selon les directives institutionnelles.
  2. Disséquer le cerveau et le placer dans une boîte de Petri contenant glacée MEM (sans antibiotique).
  3. Transférer le plat à un microscope à dissection.
  4. Avec un scalpel à la face dorsale du cerveau en place, faire une incision peu profonde le long du bord sagittalement plus interne de chaque cortex (figure 1a). Cette incision ne doit passer à travers la couche méningée, afin de faciliter son enlèvement.
  5. Utilisez une pince fines pointes à peler les méninges de façon latérale. S'il est effectué soigneusement, cette couche peut être enlevée en un seul morceau. Durant cette étape, retirer les bulbes olfactifs.
  6. Avec le cerveau ventrale côté-up, faire une incision profonde sagittale où le cortex répond la zone ventrale du diencéphale (Fig 1b).
  7. Avec la dorsale du cerveau secondaires, séparer le cortex du mésencéphale par indiscrets le tissu dans un médiale à la mode latéral (figure 1C, c '). Retirez tout méninges résiduel à cette étape.
  8. Dés chaque cortex en environ 4 morceaux et en douceur le transfert d'un tube de 15 ml conique contenant 350 pi de cerveau de souris par MEM. Maintenir le tube sur la glace jusqu'à ce que toutes les souris ont été traitées.
  9. Répétez les étapes 1.1 à 1.8 pour les souris restantes.

2. La dissociation du cortex néonatal et l'entretien des cultures mixtes de cellules gliales

Remarque: L'introduction de bulles dans la suspension cellulaire doit être évitée pendant toutes les étapes suivantes.

  1. Ajouter le tube 15 ml conique contenant le cerveau fraîchement disséqués à un bain à 37 ° C l'eau pendant 3 min.
  2. Transfert cerveaux pour une hotte de culture de tissus stériles.
  3. Doucement passent cortex dés par un embout de pipette P1000 à générer de plus petits fragments. Arrêtez de pipetage fois il n'ya pas de morceaux du cerveau suffisamment grande pour perturber la fluidité de la suspension à travers la pointe de la pipette.
  4. Ajouter 75 uL d'OPC papaïne solution par le cerveau dans le tube conique. La solution OPC papaïne doit être préchauffé à 37 ° C pendant 20 min avant utilisation.
  5. Incuber dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 20 min. Environ toutes les 2 minutes, retourner doucement le tube pour empêcher l'agrégation des tissus. Pendant ce temps, ajoutez 5 ml de mélange des milieux de culture gliales à chaque poly-L-lysine (PLL) enduit (1 mg / ml) T25 flacon (un flacon par le cerveau de souris), et placer dans un 37 ° C de culture de tissu incubateur à 8,5% de CO 2.
  6. Après 20 min, retournez la suspension de tissu à la hotte stérile et ajouter 2 mL de mélange des milieux de culture gliales du cerveau par le tube. Laissez reposer pendant 10 min à température ambiante pour permettre l'inactivation de la solution de papaïne OPC.
  7. Aliquoter la suspension de tissu en 5 ml tubes en plastique. Le nombre de tubes doit correspondre au nombre de cerveaux disséqués, résultant en environ 2,5 ml par tube.
  8. En utilisant une solution stérile flamme polie pipette Pasteur en verre, délicatement triturer les tissus dans chaque tube. Triturer abord lentement et augmentez graduellement la vitesse comme des pièces dissocier. Triturer environ 10-15 fois, cependant, ce nombre peut varier en fonction de l'efficacité de la digestion.

Note: Sous-trituration va entraîner de mauvaises dissociation des tissus, tandis que plus-trituration aura un impact négatif sur la viabilité cellulaire. Il est important de ne pas introduire de bulles dans la solution, car cela va sérieusement l'impact de la viabilité cellulaire.

  1. Une fois il n'ya pas de touffes de tissu visibles restant dans la suspension, le transfert d'un tube conique de 50 ml contenant 4 ml de mélange des milieux de culture par gliales du cerveau (par exemple, quatre cerveaux = 16 ml mélangés milieux de culture gliales).
  2. Retourner doucement le tube conique de 50 ml et répéter pour les 5 autres tubes ml.
  3. Aliquoter la suspension de cellules regroupées dans 15 ml tubes coniques (environ 6,5 ml par tube de 15 ml). Le nombre de tubes de 15 ml doit correspondre au nombre de cerveaux disséqués.
  4. Centrifuger les tubes à 1200 rpm (~ 300 g) pendant 5 min.
  5. Soigneusement aspirer le surnageant et ajouter 1 ml d'eau tiède mélangée milieux de culture gliales dans chaque tube de 15 ml conique.
  6. Lentement Reprendre le culot avec une pointe de pipette P1000, en faisant attention à ne pas introduire de bulles. Ajouter la suspension de cellules de chaque tube à une pré-équilibrée PLL enduits T25 ballon, rendant le volume total du milieu de culture à 6 ml.
  7. Placer les flacons dans un incubateur de culture tissulaire pendant 3-4 heures pour permettre aux cellules d'attacher au substrat PLL. Effectuer un changement complet des médias par pipetage dans les médias, et en ajoutant 6 mL de milieu de culture frais mélangés gliales dans les flacons. Cette étape supprime une grande partie des débriscausés par la trituration, et favorise la viabilité de la culture. Si l'OL / DRGN co-cultures sont souhaitées, se reporter à la section 3 du présent protocole.
  8. Après 3 jours de culture, effectuer un changement de 2 / 3 des médias en supprimant 4 ml de médias, et les remplacer par 4 ml de milieu de culture frais mélangés gliales. À ce stade, une monocouche d'astrocytes devrait se former sur la base des flacons.
  9. Au jour 6, effectuez un autre support 2 / 3 du changement et de compléter les flacons avec une concentration finale de 5 pg / ml d'insuline. À ce stade, une monocouche d'astrocytes doit être clairement visible, sur le sommet de laquelle les OPC sera prolifèrent.

3. L'isolement DRGN

Remarque: Pour produire OL / DRGNs co-cultures, DRGNs devrait être établi le jour après génération culture mixte gliales. Les deux types de culture sont cultivés de manière indépendante, et combinées après 9-10 jours.

  1. Sacrifice P5-P10 souris selon les directives institutionnelles.
  2. Extrait de la colonne vertébrale, et le transfert à une boîte de Petri propre.
  3. Coupez le muscle et l'os bien de la colonne vertébrale que possible (figure 1D, d '), car cela facilitera la dissection des ganglions de la racine dorsale (DRG).
  4. Transfert de la colonne vertébrale parés à une nouvelle boîte de Petri ventrale côté-up. Avec des ciseaux de dissection et de départ caudalement, couper à travers la médiane de la colonne vertébrale de façon longitudinale.
  5. L'utilisation de deux paires de pinces, soulever doucement ouverte de la colonne vertébrale afin d'exposer la moelle épinière.
  6. DRG peut être trouvé en dessous et latérales de la moelle épinière. En utilisant des pinces fines pointes, retirer délicatement les DRG, tout en évitant d'endommager les ganglions (fig. 1e).
  7. Transférer la DRG enlevée pour solution glacée de Hank saline tamponnée (HBSS, sans antibiotique) dans un nouveau plat de Pétri. Le dissecteur devrait avoir pour objectif d'extraire 40 DRG par souris (figure 1f).
  8. Une fois que le DRG ont été extraits, taillez les racines de toute DRG excessivement longue (Fig. 1g, g ') pour minimiser l'introduction de cellules contaminantes dans la culture (cellules gliales, les fibroblastes).
  9. Transférer la DRG un tube à centrifuger de 1,5 ml contenant 500 ul de HBSS glacée.
  10. Centrifuger à 1200 rpm (~ 300 g) pendant 5 min à 4 ° C pour culotter les DRG.
  11. Transférer les tubes de centrifugeuse pour une hotte de culture de tissus stériles et retirer le HBSS des tubes.
  12. Ajouter 500 ul de pré-chauffé (20 min à 37 ° C) DRG papaïne solution, et incuber les tubes dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 10 min. Inverser les tubes toutes les 2 min pour empêcher l'agrégation des tissus.
  13. Répétez l'étape 3.10.
  14. Retirer la solution la papaïne DRG et ajouter 500 ul de pré-chauffé (20 min à 37 ° C) Une solution collagénase. Incuber dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 10 min, en inversant toutes les 2 min.
  15. Répétez l'étape 3.10.
  16. Enlever le surnageant et ajouter 1 mL de DRGN médias. Inverser le tube plusieurs fois.
  17. Répétez l'étape 3.10.
  18. Répétez l'étape 3.16.
  19. Manteau stérile flamme polie pipette Pasteur en verre avec l'albumine sérique bovine (BSA) par pipetage une solution de BSA à 0,25% dans HBSS plusieurs fois. Le revêtement avec une solution de BSA permettra d'éviter les DRG d'adhérer aux parois de la pipette en verre.
  20. Triturer les DRG avec la pipette BSA enduits d'abord doucement, et avec une intensité croissante fois des bouquets commencent dissocier. Triturer environ 10-15 fois, cependant ce nombre dépend du degré de digestion, et le nombre de DRG par tube.
  21. Une fois que la dissociation est atteint, passer la suspension à travers un filtre de 50 microns dans une boîte de Pétri stérile contenant 7 ml de DRGN médias. Filtration permettra d'éliminer une grande partie des débris de la suspension cellulaire, bien que cette étape n'est pas critique.
  22. Incuber les boîtes de Pétri à 8,5% de CO 2 d'environ 1,25 heures.
  23. Manteau de plusieurs lamelles de 12 mm avec LN2 (10 ug / ml dans le PBS) dans un plat de 24 puits pendant ce temps d'incubation.
  24. Une fois l'incubation est terminée, observez la boîte de Pétri sous champ lumineux. DRGNs sont identifiés comme grand corps, cellules en phase sombre. Swirl la boîte de Pétri doucement pour lever toute DRGNs respectées.

Note: Plusieurs cellules contaminantes aura fortement adhéré à la boîte de Pétri, enrichissant ainsi la suspension de votre cellulaire pour DRGNs.

  1. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml conique. Rincer délicatement le plat avec 4 ml de DRGN médias de recueillir toute DRGNs résiduelle. Transférer le supplément de 4 ml dans le tube conique.
  2. Centrifuger pendant 5 min à 1200 rpm (~ 300 g).
  3. Aspirer le surnageant et resuspendre le culot dans 500 uL de médias DRGN frais.
  4. Calculer le nombre de DRGNs donné en utilisant un hématimètre. Soyez sûr de ne compter que les DRGNs, et d'autres types de cellules non. DRGNs peuvent être identifiés par leurs grands corps cellulaires sphériques.
  5. Graine 30.000-50.000 DRGNs à chaque lamelle LN2 enduits dans 1 ml de DRGN médias, et placer dans un 37 ° C de culture de tissu incubateur à 8,5% de CO 2 pendant la nuit.
  6. Le lendemain matin, effectuer un changement complet des médias en remplaçant le DRGNdes médias avec les médias OL (moins CNTF) avec une concentration finale de 1% Pen / Strep et 10 FUDR uM.
  7. Aux jours 3 et 5, effectuer un changement de 3 / 4 des médias avec les médias comme à l'étape 3.30.
  8. Le Jour 7, effectuez un changement complet des médias avec les médias OL (moins CNTF, Pen / Strep, FUDR).
  9. Le jour de 9, le DRGNs devrait avoir formé un lit neurites étendue, et sont maintenant prêts à être co-cultivées avec des OPC.

4. Purification des OPC de cultures mixtes de cellules gliales pour la création d'OL-cultures enrichies ou OL / DRGN co-cultures

  1. Le jour 9 de la culture mixte gliales, le transfert des flacons d'un agitateur orbital dans un 5% de CO 2 de culture de tissu incubateur. Placer les flacons au-dessus du vide, des flacons T25 pour éviter toute chaleur générée par l'agitateur orbital de porter atteinte aux cultures mixtes gliales. Autoriser les cultures de s'équilibrer à ce nouvel incubateur pendant 1 heure.
  2. Une fois les flacons ont équilibré, secouer les flacons à 50 rpm pendant 45 min. Le but de cette secousse est d'enlever toutes les cellules faiblement adhérentes contaminant de la monocouche.
  3. Déplacer des cellules d'une hotte de culture de tissus et de supprimer tous les médias à partir des flacons. Remplacez-le par 4 ml de milieu de culture frais mélangés gliales complété avec 5 pg / mL d'insuline.
  4. Placer les flacons en arrière sur le vibreur, et permettre à s'équilibrer pendant environ 3 heures.
  5. Une fois les flacons sont équilibrées, les fixer solidement à l'agitateur orbital, et secouer les flacons pour environ 16 heures à 220 rpm (la nuit).
  6. Le lendemain matin, si MCO sont à être cultivées en l'absence de DRGNs (ie, l'OL enrichi la culture), le manteau de plusieurs lamelles stériles 12 mm avec LN2 (10 ug / ml dans PBS) pendant 1 heure. Transférer les lamelles de 24 puits, laver avec du PBS suivi par un lavage OL médias. Ajouter 1 mL de milieu de LO dans chaque puits et équilibrer à 8,5% de CO 2.
  7. Equilibrer boîtes de 10 cm de culture de tissu à 5% de CO 2 pendant 30 min. Un plat sera nécessaire pour tous les 2 flacons. Ils seront utilisés pour le différentiel d'adhérence d'enrichissement de l'OPC en suspension.
  8. Une fois la période de 30 minutes d'équilibration est passée, le transfert des médias à partir des flacons secoué pour la vaisselle. Chaque plat doit recevoir des supports de 2 flacons, égalant environ 8 ml de suspension cellulaire par 10 cm de plat.
  9. Incuber les boîtes à 5% de CO 2 pendant 30 min, tout en offrant un petit coup de pouce à la marque de 15 min. Ce coup de pouce permettra d'éviter les OPC d'adhérer à l'antenne de 10 cm.
  10. Une fois l'incubation est terminée, examinez les plats sous champ lumineux. Les OPC sont identifiés comme des bouquets de cellules petites, généralement de 3-5 cellules, mais parfois la forme de grands agrégats ressemblant neurosphères. De nombreuses cellules lignée non-OL devrait être fermement adhéré à la base de la plaque. Mélanger délicatement les plaques pour détacher les OPC vaguement collé, et le transfert de la suspension cellulaire de chaque plaque dans un tube de 15 ml conique.
  11. Centrifuger à 1200 rpm (~ 300 g) pendant 5 min.
  12. Reprendre le culot dans 1 ml de médias OL avec une pointe P1000 pipette, puis remise en suspension avec une pointe P200 pipette.
  13. Compter les cellules en utilisant un hématimètre.
  14. Pour enrichi-OL cultures, semences 25000 - 50000 OPC à chaque 12 mm revêtu de LN2 lamelle dans un volume final de 1 ml médias LO.
  15. Pour LO / DRGN co-cultures, effectuer un média complète OL (moins CNTF) changement sur le DRGNs de la section [3], et ajouter doucement 50.000 cellules de la suspension cellulaire enrichie OPC. Prenez soin de ne pas perturber le lit neurites DRGN lors de l'ajout d'OPC.
  16. Placez les cultures dans un incubateur à 37 ° C à 8,5% de CO 2, et éviter d'enlever jusqu'à la fixation. OPC murins sont sensibles aux changements de pH, et la suppression de l'incubateur va modifier le pH de la presse de LO. A noter également, l'ajout de dH 2 O pour les puits vides entourant les cultures cellulaires permettra d'éviter l'évaporation des milieux de culture, minimisant ainsi les fluctuations de la concentration de solutés dans les médias LO. Cela fournira un environnement plus cohérent pour l'OPC.

5. Traitement des cultures pour la microscopie d'immunofluorescence

  1. Fixer les cultures avec du méthanol 100% à -20 ° C pendant 10 min, ou le paraformaldéhyde 3% à température ambiante pendant 15 min.
  2. Perméabiliser lamelles avec 0,1% de Triton-X-100 pendant 10 min, laver avec du tampon phosphate de bloc salin (PBS) et pendant 1 heure dans du sérum de chèvre 10%.
  3. Incuber lamelles avec des anticorps primaire dilué dans une solution de blocage nuit à 4 ° C.
  4. Lavez lamelles 3 fois avec PBS, et incuber avec Alexa Fluor-anticorps secondaires conjugués (Invitrogen) dilué dans une solution de blocage pendant 45 min.
  5. Contre avec 4 ',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et laver plusieurs fois avec des lamelles de PBS.
  6. Mont lamelles de DAKO fluorescentes milieu de montage.
  7. Analyser diapositives par microscopie d'immunofluorescence. Dans ce protocole, les diapositives ont été analysés soit avec un Zeiss Axiovert 200M inversé à fluorescencemicroscope ou un laser Zeiss LSM 510 META microscope confocal à balayage.

6. Whole extraction des protéines cellulaires de l'OL cultures enrichies

  1. Retirer de 24 puits des cultures de pépinière et laisser refroidir sur glace pendant 3 min.
  2. Retirez délicatement les médias, et d'ajouter de 10 à 20 uL de tampon de lyse (50 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, SDS 0,1%, désoxycholate de sodium à 0,5%, 1% de Triton-X-100, avec pepstatine 0,1%, l'aprotinine, PMSF, leupeptine, orthovanadate de sodium) dans chaque puits (Un minimum de 8 puits par échantillon est suggéré).
  3. Grattez les puits en utilisant un large trou P1000 pointe de la pipette et transférer le lysat dans un tube à centrifuger de 1,5 ml.
  4. Passer le lysat à travers un 30 ½ calibre seringue environ 15 fois, et laisser refroidir sur glace pendant 30 min.
  5. Centrifuger les tubes à 14000 rpm (~ 20 000 g) pendant 15 min à 4 ° C.
  6. Transférer le surnageant dans des tubes à centrifuger de nouvelles, et conserver à -80 ° C.

7. Analyse SDS-PAGE de protéines enrichi la culture-OL

  1. Résoudre 30 ug de protéine par échantillon dans la réduction de tampon par SDS-PAGE sur la norme de 12% de poly-acrylamide des gels.
  2. Les gels de transfert semi-sec sur des membranes de PVDF.
  3. Membranes bloc pendant 1 heure dans 5% poudre de lait écrémé dans TBST (10 mM Tris-HCl pH 8,0, NaCl 150 mM, 0,1% Tween-20).
  4. Incuber membranes avec des anticorps primaire dilué dans une solution de blocage pendant 1 heure.
  5. Laver 3 fois avec les membranes TBST pendant 10 min.
  6. Incuber les membranes avec HRP-anticorps secondaires conjugués pendant 45 min dans une solution de blocage.
  7. Laver les membranes à plusieurs reprises avec du TBST, et incuber avec Amersham ECL Plus réactif de détection ouest blot (GE Healthcare) pendant 5 min.
  8. Détecter bandes de protéines avec un film standard d'imagerie scientifique.

8. Les résultats représentatifs:

Dans ce protocole, les OPC sont étendus sur une monocouche d'astrocytes dans une culture mixte gliales. Cette culture mixte gliales est dérivé de P0-P2 du cortex de souris néonatales. Au jour 1 in vitro (DIV1), la culture mixte contient des cellules gliales avec des morphologies différentes comme on le voit par microscopie à contraste de phase (figure 2a). Au DIV3, une monocouche d'astrocytes commence à se former sur la base du flacon, et à DIV8, les OPC peuvent être clairement observées à la surface monocouche. Au DIV9, les OPC prolifèrent ont encore atteint une densité suffisante pour être purifiée par la nuit à haute vitesse d'agitation orbitale. Une fois le processus de purification a été achevée, le résultat est une population de cellules OPC-enrichi. Au DIV1 post purification, les OPC ont une morphologie simple, étendant quelques processus (figure 2b). Au DIV3 de purification de poste, les cellules ont étendu un maillage complexe de processus, rappelant LO immatures. Au DIV6 de purification de poste, l'OL purifiée ont aplati et projetés dépliant-comme des structures membranaires. Ce développement morphologique est typique de la maturation in vitro des LO.

Immunofluorescence indique les cellules purifiées sont de OL-lignage (figure 3a). Ensemencée OPC d'abord exprimer la chondroïtine sulfate protéoglycanes (NG2), et se développer en myéline associated glycoprotein (MAG) positif LO immatures dans les trois jours après le semis (figure 3B). Au DIV6, beaucoup LO exprimer la protéine de myéline de base (MBP), et possèdent la morphologie typique de maturité LO. Pour cent OL lignée cellules ont été quantifiées à des moments différents pour déterminer la pureté des cultures OL-enrichi (figure 3C). Au DIV1 de purification de poste, les cultures sont de 50 ± 14% NG2 OPC + ve, sans avons MAG + ou MBP + LO VE. Ceci indique l'OL purifiée lignée cellules sont dans le stade précurseur au moment des semis, avec un nombre négligeable de LO différenciées. Au DIV3, LO nombreuses se sont différenciées en cellules MAG + ve (24 ± 5,9%) alors que certains conservent le phénotype de précurseur, et restent NG2 + (13 ± 8,0%). Au DIV3, une petite proportion de cellules MAG + ve (3,2 1,2%) sont également exprimer MBP. Au DIV6, 20 ± 5,9% de LO sont MAG + ve, tandis que 12 ± 7,3% persistent comme NG2 + OPC ve. En outre, 21 ± 9,3% de cellules dans la culture sont MBP + LO avez à ce point du temps. Analyse SDS-PAGE montre l'expression graduée de 2'3'-cyclique nucléotide 3'-phosphodiestérase (CNP) et le MBP au cours de la période de culture 6 jours, démontrant la capacité des OPC en culture pour se différencier en terminale LO matures (figure 3D ). Collectivement, ces données établit cette méthode comme un moyen de produire un système de culture de l'OL enrichi adapté à l'étude de la maturation de l'OL OPC.

Ce protocole décrit également des méthodes pour établir OL / DRGN co-cultures utilisant des sources de tissu murin seule. Toutefois, afin de produire la co-culture, DRGNs doit d'abord être cultivées seules à produire un réseau neuritique adéquate. Ces cultures post-natal des neurones murins sont cultivés pendant 9 jours en basse milieux sans sérum avec 10 supplémentation FUDR uM pour empêcher la prolifération des fibroblastes contamine et GL cellules ial. Au cours des 9 jours in vitro, DRGNs isolés produisent un lit neurites dense (figure 4a). Ce lit est neurites immunopositives pour les neurofilaments neuronale marqueurs 200 (NF) et Tuj1 (figure 4b). À ce stade, les OPC purifié peut être ajouté à la neurite lits, et cultivées pendant 6 jours supplémentaires pour produire myélinisantes co-cultures.

Au DIV6 de l'OL / DRGN co-culture, de nombreux MBP + LO VE peut être observée chez les neurites NF DRGN + ve (Fig. 5a). Un examen plus approfondi, LO sont mises en évidence pour prendre contact avec de nombreux neurites DRGN, souvent engainantes avec un MBP + ve la membrane (figure 5b, c).

Figure 1
Figure 1. Images de microscopie Dissection des aspects particuliers de la souris néonatales cortex et l'isolement DRG. (A) Vue dorsale d'un cerveau de souris nouveau-né fraîchement extrait. Les lignes pointillées indiquent la zone où les incisions doivent être faites pour faciliter l'enlèvement de la couche méningée. (B) Vue ventrale du cerveau, les lignes pointillées indiquent l'endroit où le cortex répond le diencéphale ventral. Incisions profondes doivent être faites le long des pointillés pour faciliter l'isolement des corticales. (C-c ') représentation visuelle de la manière de fouiller le cortex écart du reste du cerveau. (D) Un fraîchement isolées P5-P10 colonne vertébrale de souris avant découpe loin muscle en excès et en os (d '). (e) Emplacement des DRG dans la colonne vertébrale. (f) Le nombre approximatif de DRG qui devraient être isolés les uns des souris. (g) Un DRG aux longues racines qui nécessitent coupe avant la digestion enzymatique. La ligne pointillée indique la région où les racines doivent être coupées. (G ') DRG après-racine rognage.

Figure 2
Figure 2. Les OPC sont développées au sein d'une culture mixte gliales, purifié, et par la suite comme une culture différenciée OL-enrichi. (A) des images à contraste de phase du mélange des cultures gliales à différents stades de développement. Au DIV1, les cellules apparaissent ronde avec quelques cellules aplaties. La stratification de la culture gliales mélangées commence à DIV3, où les astrocytes forment une monocouche uniforme à la base du flacon, sur laquelle les OPC prolifèrent. Beaucoup OPC sont vus à DIV8 (flèches) ont adhéré à la surface de la monocouche d'astrocytes. (B) Une fois purifiée à partir de la culture mixte gliales, DIV1 OPC ont étendu quelques procédés. Au DIV3, les cellules ont prolongé de nombreux processus, rappelant étape intermédiaire LO. Au DIV6, LO aplati (astérisque) semblent avoir produit des feuilles membraneuses (ligne pointillée). Barres d'échelle, 50 um.

Figure 3
Figure 3. Caractérisation de l'OL enrichi la culture. (A) des images confocale de LO isolés à différents stades de développement. NG2 + OPC avons ont une morphologie simple, alors que les LO MAG + ve possèdent de multiples processus arborous. MBP + LO avons avons étendu membraneuse myéline comme des feuilles. La barre d'échelle, 50 um. (B) purifiée OL lignée cellules proviennent que OPC, et se différencient en MAG + ve LO MBP, + ve plus de 6 DIV. Au DIV1, tous les OPC sont NG2 + ve, alors qu'aucun MAG sont séro + ou MBP + ve. Au DIV3, MAG + LO VE et MBP quelques + ve sont maintenant évidents. La majorité des MCO sont MAG et le MBP + ve au DIV6, avec NG2 reste quelques + OPC ve. La barre d'échelle, 100 um. (C) Les valeurs moyennes ± écart type de l'OL pour cent lignée des cellules à différents stades de développement de plus de 6 DIV. Au DIV1, toutes les cellules LO-lignée sont NG2 + ve, représentant 50 ± 14% du nombre total de cellules dans la culture. Au DIV3 et DIV6, l'OL lignée cellules représentent respectivement 36 ± 6,8% et 32 ± 8,4% du nombre total de cellules, comprenant des proportions variables de NG2 + ve, MAG + ve et le MBP + LO VE. (D) de SDS-PAGE effectué sur les protéines dérivées de cultures enrichies OL-démontrant l'expression gradué de OL-marqueurs CNP et MBP sur la période 6 DIV culture.

Figure 4
Figure 4. Caractérisation de la culture pré-OPC DRGN ensemencement. (A) La phase des images à contraste de DRGNs sur la période 9 DIV culture pré-Commissariat des semis. DRGNs proviennent que de grande taille des cellules avec quelques processus, et de produire un réseau neuritique plus en plus complexes. La barre d'échelle, 100 um. (B) les images confocale des cultures DRGN fixé à DIV9 (pré-semis OPC) et colorées pour des marqueurs spécifiques des neurones Tuj1 et NF200. DRGNs ont produit un réseau neuritique sur laquelle les OPC peuvent être ensemencés pour produire OL / DRGN myélinisantes co-cultures. La barre d'échelle, 50 um.

ent "> Figure 5
Figure 5. LO co-cultivées avec un résultat DRGNs dans OL-médiatisée d'emballage de neurites DRGN avec MBP + membrane ve. (A) Une image 4-champ confocale montage d'une DIV6 OL / DRGN co-culture. Beaucoup MBP + LO avez peut être vu en interaction avec le lit DRGN neurites sous-jacent. La barre d'échelle, 100 um. (B) Une vue agrandie confocale de MBP + LO avez emballage neurites DRGN multiples. La barre d'échelle, 50 um. (C) l'agrandissement numérique de la région notée en (b) où une neurite DRGN est enveloppée d'une membrane de LO. La barre d'échelle, 25 um.

Discussion

Ce rapport décrit une méthode pour isoler les OPC murin de différenciation dans les cultures OL-enrichi ou OL / DRGN co-cultures. Lorsqu'elle est cultivée seule, l'OPC se différencier en MBP + LO VE, produisant de la myéline comme des feuilles membraneuses. Lorsqu'il est ajouté à DRGN lits neurites, LO enveloppent les neurites DRGN avec MBP + membrane ve. Ce modèle profite à l'enquête sur les fondements complexes qui régissent l'OL à médiation ensheathment axonale.

Tout d'une grande valeur, l'établissement de ces cultures est techniquement difficile. En particulier, les aspects exigeants incluent la digestion des tissus efficace / dissociation, l'entretien de la culture médiatique au pH équilibré, et DRGN changements médias. Il est important de considérer que la durée de la digestion, la quantité de tissu étant digérée et le montant de la trituration affecte le résultat d'efficacité et à la fin de la dissociation des tissus. Il n'est pas inhabituel pour les chercheurs expérimentés d'obtenir de faibles rendements cellulaires des tissus du système nerveux dissociés. En outre, les OPC murins ont tendance à être sensibles aux changements dans le pH du milieu de culture, en particulier dans des conditions alcalines. L'entretien des cultures, à 8,5% de CO 2 vise à empêcher cela, puisque les OPC semblent mieux tolérer des conditions légèrement acides au cours de base. En ce qui concerne DRGNs alimentation, les changements de supports doivent être effectués rapidement pour ne pas dessécher les neurones, cependant, doit être doux pour ne pas perturber le lit de neurites en développement. Changements brusques des médias peuvent déloger le lit neurites du substrat, et le résultat probable dans sa dissociation complète de la lamelle.

Le mérite potentiel de ce système modèle éclipse fortement son caractère techniquement exigeante. Un avantage de ce système est l'utilisation de la post-natale des souris pour la dérivation de la culture cellulaire, en contournant la nécessité de sacrifier les femelles reproductrices de récolter des tissus embryonnaires. Un autre avantage est l'absence d'obligation pour les facteurs de croissance (GFS) pour l'expansion de l'OPC. Mixte cultures gliales fournir un environnement qui favorise la propagation des OPC, vraisemblablement en raison de la présence de facteurs trophiques astrocyte dérivées. D'autres méthodes, telles que la dérivation via neurosphères 7,8, reposent sur ​​les propriétés mitogéniques de GFS tels que le facteur de croissance fibroblastique basique (bFGF), facteur de croissance épidermique (EGF) et le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) pour l'expansion du CPVP. De même, en utilisant le développement postnatal (P5-10) pour les souris DRGNs évite l'obligation de compléter les milieux de culture avec un facteur de croissance nerveuse (NGF), un facteur neurotrophique requis pour le taux de survie in vitro des embryons DRGNs 9, 10. Il est intéressant d'éviter d'utiliser le NGF car elle influence négativement la capacité de myélinisation des LO lorsqu'elles sont cultivées avec des DRGNs 4. Éviter l'utilisation du GF-complété des médias a aussi des avantages économiques, comme ces réactifs devenir coûteux s'il est utilisé à grande échelle.

Peut-être l'avantage le plus important de ce modèle est sa culture de dérivation de la souris uniquement les tissus, offrant ainsi la possibilité de tirer à la fois les OPC et les DRGNs de la grande variété de lignées de souris transgéniques. Cela permet pour l'étude de deux DRGN et / ou OPC propriétés spécifiques qui régissent la myélinisation. Cela sera particulièrement important pour l'élucidation des interactions récepteur / ligand régulation OL-médiée myélinisation des axones. En tout, cette technique est d'une grande valeur en ce qui concerne la recherche en neurosciences en raison de ses applications vers la compréhension des signaux moléculaires qui sous-tendent la myélinisation.

Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Ce projet a été financé par une subvention de la Société canadienne de la sclérose d'RKRWO est récipiendaire d'une bourse d'études de la Société canadienne de la sclérose. DTS est un récipiendaire de bourses postdoctorales de la Multiple Sclerosis Society of Canada et les Instituts de recherche en santé.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Multicell 319-005-CL
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Invitrogen 14170-112
Minimum Essential Media (MEM) GIBCO, by Life Technologies 12360-038
Fetal Bovine Serum (FBS) GIBCO, by Life Technologies 10091-148
Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) GIBCO, by Life Technologies 15140-122
GlutaMAX Invitrogen 35050-061
Poly-l-lysine Sigma-Aldrich P2636
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503
Human merosin purified protein (LN2) EMD Millipore CC085
Recombinant rat ciliary neurotrophic factor (CNTF) PeproTech Inc 450-50
L-thyroxine Biochemika 89430
Holo-transferrin Sigma-Aldrich T0665
B27 supplement GIBCO, by Life Technologies 0080085-SA
Bovine insulin Sigma-Aldrich I6634
3,3',5-Triiodo-L-thyronine Sigma-Aldrich I6634
Progesterone Sigma-Aldrich P8783
Putrescine Sigma-Aldrich P7505
Sodium Selenite Sigma-Aldrich S5261
5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FuDR) Sigma-Aldrich F0503
Papain solution Worthington Biochemical LS003126
DNaseI Roche Group 1010159001
L-cysteine Sigma-Aldrich C7352
24-well tissue culture dishes Cellstar 662-160
T25-tissue culture flasks with vent cap Corning 430639
10 cm tissue culture dishes Corning 430167
10 cm petri dish Fisher Scientific 0875713
Collagenase A Roche Group 103578
CellTrics 50 μm filter (optional) PARTEC 04-004-2327
Myelin Basic Protein (MBP) Antibody AbD Serotec MCA409S
NG2 antibody EMD Millipore AB5320
Myelin-Associated Glycoprotein (MAG) antibody EMD Millipore MAB1567
2',3'-Cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNP) antibody Covance SMI-91R-100
Actin pan Ab-5 antibody Fitzgerald 10R-A106AX
Neurofilament-200 (NF) antibody Sigma-Aldrich N4142
Tubulin beta-3 chain (Tuj1) antibody EMD Millipore MAB5544
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11008
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A21422
Alexa Fluor 647 goat anti-rat (IgG) (H+L) secondary antibody Invitrogen A21247
Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody Bio-Rad 170-6516
Goat anti-rat IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-2065
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542

Media Recipes

100X OL-Supplement*

IngredientAmount to add
DMEM100 mL
BSA1.02 g
Progesterone0.6 mg
Putrescine161 mg
Sodium Selenite0.05 mg
3,3',5-Triiodo-L-thyronine4 mg

*Store at -80 °C in 250 μL aliquots

OL media

IngredientAmount to add
DMEM23.75 mL
100X OL-Supplement250 μL
Bovine insulin (from 1 mg/mL stock)125 μL
GlutaMAX250 μL
Holo-transferrin (from 33 mg/mL stock)37.5 μL
B27 Supplement500 μL
FBS125 μL
CNTF (from 50 ng/μL stock)25 μL

Mixed glial culture media (made up in DMEM)

IngredientFinal concentration
FBS10%
Pen/Strep (0.33% from stock)33 units/mL Penicillin and 33 μg/mL Streptomycin
GlutaMAX1%

DRGN media (made up in DMEM)

IngredientFinal concentration
FBS10%
Pen/Strep (1% from stock)100 units/mL Penicillin and 100 μg/mL Streptomycin

Digestion Solution Recipes:

OPC papain solution (made up in MEM)

IngredientFinal concentration
Papain solution1.54 mg/mL
L-cysteine360 μg/mL
DNaseI60 μg/mL

DRG papain solution (made up in HBSS)

IngredientFinal concentration
Papain1.54 mg/mL
L-cysteine360 μg/mL

DRG Collagenase A solution (made up in HBSS)

IngredientFinal concentration
Collagenase A4 mg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Avellana-Adalid, V. Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential. J Neurosci Res. 45, 558-570 (1996).
  2. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
  3. Barres, B. A. Cell death and control of cell survival in the oligodendrocyte lineage. Cell. 70, 31-46 (1992).
  4. Chan, J. R. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43, 183-1891 (2004).
  5. Camara, J. Integrin-mediated axoglial interactions initiate myelination in the central nervous system. J Cell Biol. 185, 699-712 (2009).
  6. Ishibashi, T. Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses. Neuron. 49, 823-832 (2006).
  7. Chen, Y. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat Protoc. 2, 1044-1051 (2007).
  8. Pedraza, C. E. Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors. Glia. 56, 1339-1352 (2008).
  9. Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors. J Neurosci. 12, 1896-1905 (1992).
  10. Greene, L. A. Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons. Dev Biol. 58, 106-113 (1977).

Comments

46 Comments

  1. very nice video and presentation....

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 28, 2011 - 12:44 PM
  2. Nice explanation. I have been carrying out this procedure for some time now and find that it works quite well.

    How many OPCs you generally obtain from a single mouse brain?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 26, 2012 - 4:35 PM
  3. Hi - thanks for your comment, typically I yield about ²00,000 OPCs per mouse brain (on average).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 1:04 AM
  4. Excellent. I am using B6 mice, usually P4-5 (because we also take cerebellar neurons from these same pups). I usually yield between 100-130,000 cells/brain. I see some differences in our protocols (I seed three brains/T75, use trypsin instead of papain, etc.). What steps have you found to dramatically increase your OPC yield post shake-off?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 12:17 PM
  5. The largest factor in OPC yield is the efficiency of your digestion (ie. minimal cell death). In addition, the age of the mice from which you isolate the mixed glial cultures is a factor. I think if you go too far past P², many OPCs will be postmitotic, and therefore limit their proliferation capacity. I usually try to go as young as possible (P0) as this seems to work best. If you absolutely need to use P4-P5, maybe try to culture your monolayers longer than 9 days - try waiting ² weeks prior to shake off. Hope this helps - RO

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 1:06 PM
  6. Thanks for the great info. That is interesting, as many of the protocols for the "DeVellis-method" use different enzymatic preparations (trypsin +/- EDTA, +/- DNAase, papain, etc.). I had basically adapted my rat OPC protocol for mice, but am realizing that they are just not the same. I will trip your papain method and let you know how things pan out. Also, is there a reason you use T²5 flasks instead of combining brains into a T75?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 4:55 PM
  7. No there is no specific reason for using T²5, simply this is what I have always been using. I would imagine combining 3 mice into a T75 flask would roughly be the same thing. Good Luck!

    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 12:00 PM
  8. Hi Ryan, nice video and explanation. Do you do lectin panning to further get rid of microglia or do you find that a 30 min incubation at 37 degrees is enough? Also, how do you know cells are ready to shake? are they always ready at day 9? what do you look for specifically?
    thank you

    Reply
    Posted by: luisa t.
    April 10, 2013 - 12:39 PM
  9. hello...I have gone through this video...very nicely presented...but I have one doubt that if I put the flasks on shaker which only maintains temp and speed but not CO² level, the pH will change...would it not allow the OPCs to survive at all??? and can I use HEPES in medium to solve this problem???
    M willingly waiting for your reply....

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 4, 2012 - 12:35 PM
  10. Thank you for your comment, you are correct in that it will not work without CO² buffering. HEPES buffer will likely not solve this problem either. I'm afraid you will absolutely need to have CO² buffering for this isolation to work.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 11:56 AM
  11. Hi, very INFORMATIVE video, I zalak parikh working on glial cells. In your protocol you are not using any filter after papain digestion but I am facing one problem of Fibroblasts contamination. What could be the possible solution for this problem?
    thank you
    Zalak.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 24, 2012 - 7:59 AM
  12. Hi Zalak, thanks for your comment. What glial cell type are you trying to culture? Oligodendrocytes, astrocytes or microglia? I have never experienced fibroblast contamination.. are you sure they are fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 24, 2012 - 10:47 AM
  13. Hi there. Excellent video, very informative. I was just wondering if you can incubate the flasks in 5% CO² instead of 8% CO²?
    Thanks
    Matt

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 11, 2012 - 12:48 PM
  14. Hi Matt, Actually no, you need to have these at at least 8.5% CO² - otherwise you will have trouble establishing your mixed glial cultures - Good luck

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 11, 2012 - 10:22 PM
  15. Hi Ryan. Very nice video and presentation.
    I have to establish a DRG neuronal culture. Majority of all the papers I've read are using a embryonic source of DRG unlike you using post-natal mouse. What do you think will be the major difference between the cultures of the two??

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 1, 2012 - 12:23 PM
  16. Hi Lipi,
    You're right most papers use embryonic DRGs. The benefit of using post-natal DRGs is that you don't have to sacrifice the mother, and if you use P5-P10 mice, there is no need to use nerve growth factor (in my hands). Embryonic DRG neurons require NGF supplementation to the media for their survival. In terms of the difference between cultures, embryonic dervied ones may have a bit more contaminating cells, since I find they divide pretty quickly. Otherwise I imagine they would be the same as post-natal derived cultures. Good luck!

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    October 1, 2012 - 4:37 PM
  17. Thank you Ryan.

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 3, 2012 - 2:39 AM
  18. Thank you Ryan.

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 3, 2012 - 2:51 AM
  19. Great article Ryan. I had a question for you. Our lab generates mixed glial cell cultures by isolating NPCs from P1 mouse pup brains,expanding the NPCs via neurospheres in the presence of GFs, and then plating the spheres on matrigel for subsequent differentiation without GFs. My main goal in using the neurosphere protocol is to obtain OPCs, but I routinely get only ²0-30% O1+ OPCs following 8 days of differentiation on matrigel. GFAP+ astrocytes seem to dominate the whole culture, with OPCs growing on top of them. I wanted to try to incorporate your protocol into the neurosphere protocol by dissociating the spheres using TrypLE or Accutase, plating them on Poly-D-Lysine, letting the astrocytes grow to confluency while having OPCs proliferate on top, and then use the shaking technique to isolate OPCs. Do you think this is possible? When we perform in vitro studies with the NPCs, we usually plate the neurospheres on matrigel for a day and then trypsinize the cells for seeding into new dishes. Not only do I think the trypsin digest kills many OPCs, but I also remove astrocytes from the matrigel that then contaminate my cultures. Thanks for the help!

    Reply
    Posted by: Brett M.
    November 3, 2012 - 7:37 PM
  20. Hi Brett - To answer your question, yes I think it would be possible to do what you are suggesting. However, it seems to be a pretty roundabout approach. I think the more streamlined approach would be to simply seed your dissociated P1 neural cells onto PLL substrate to generate a monolayer. That way you would avoid having to generate neurospheres (which I imagine takes about 10 days) and then subsequently generating an astrocyte monolayer with the spheres (which would take another 10+ days). In my experience, OPCs don't like trypsin. If you wanted, you could try 0.05% Trypsin instead of 0.²5% and that seems to be more gentle. And if you don't incubate for too long, most astrocytes should remain on the plate. Hope this helps! -Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    November 5, 2012 - 12:14 PM
  21. Ryan, thanks for the help! I tried your protocol and everything appeared to go well. However, one issue I ran into occurred during the overnight shaking step and subsequent differential adhesion assay to isolate a more pure population of OPCs. What I noticed was that after the overnight shaking I had many large oligospheres (maybe 10-²0 cells in size). These spheres did not stick down during the 30 minute plate incubation and I had difficulties trying to dissociate them as you described using the P1000 and P²00 tips. When I took the cells counts and plated the cells onto chamber slides, many smaller clumps remained and stuck down to the matrix. However, the clumps did not flatten out on the gel matrix very well (like neurospheres do) and eventually flaked off after about 5 days of cultures, leaving only sparse population of OPCs. Have you ever encountered this problem? I was thinking of seeding at a higher cells density than what you describe in the protocol.

    Reply
    Posted by: Brett M.
    December 2, 2012 - 10:21 PM
  22. Hi Brett - sounds like you're doing everything right. Normally I see lots of these "oligospheres" as a result of the overnight shaking protocol. However, I find that these are not the majority of OPCs, as there are many single cells and cells in clumps of ²-4. The oligospheres are difficult to dissociate, and due to this, I generally do not go out of my way to try and break them up. In my hands, these spheres spread out very nicely after about ²4hrs on Laminin-² substrate. You can try to seed at higher densities if you like, but the seeding density should be determined based on the experiment you want to conduct. For example, if you want to perform immunocytochemistry, it may not be ideal to have a very dense cell culture. Also, it's possible the clumps aren't super compatible with your matrix substrate - I always use Laminin. I hope this helps :)

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    December 3, 2012 - 11:42 AM
  23. HI Ryan, very informative and nice presentation. I have tried your protocol and everything seem to work fine except at the overnight shaking. There were very few OPCs isolated and it seems there are still many OPCs adhere to the astrocytes. Have you encounter this issue?

    Reply
    Posted by: Esther W.
    December 13, 2012 - 3:25 AM
  24. Hi Esther, Thanks for your comment. How many OPCs are you yielding per mouse? I usually yield on average ²00,000 OPCs per mouse brain, but this is quite variable. At times I have yielded 500,000 or 50,000 per brain, and I'm not sure what accounts for this variability. In any case, you will never dissociate 100% of the OPCs from the monolayer, I've noticed a lot remain stuck. My advice would be to simply give it another shot and see if your yields are a bit higher next time. Hope this helps - RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    December 16, 2012 - 5:35 PM
  25. Thanks Ryan for your advice. My yield is definitely much lower than yours. I will definitely try another round. :)

    Reply
    Posted by: Esther W.
    December 16, 2012 - 8:24 PM
  26. HI Ryan, I face the problem of getting immature OPC instead of mature OPC after 6 days of OL-enriched culture. What is your view?

    Reply
    Posted by: Esther W.
    January 23, 2013 - 2:51 AM
  27. Hi Esther, you should always expect to have some OPCs that don't differentiate during the timecourse. However, the majority of OLs should at least be expressing MAG, if not MBP at DIV6. My guess would be that your media is not exactly correct. Make sure that all the ingredients are at the correct concentration in your 100x OL-supplement stock - especially tri-iodothyronine and L-thyroxine (4mg per 100mL). I hope this helps, let me know if you still have problems.

    Posted by: Ryan O.
    January 23, 2013 - 12:56 PM
  28. Thanks Ryan for replying. I have added tri-iodothyronine only as there is no mentioned of L-thyronine in the 100x OL-supp recipe. Can i still add L-thyronine when the OL-enriched is on DIV5?

    Posted by: Esther W.
    January 23, 2013 - 8:05 PM
  29. Thanks for notifying me of this mistake, I'll notify the editorial team ASAP. Yes you can try to add it on DIV5, but no guarantees this will drive them any farther since they are aleady 5 days in. Give the protocol a second try, and let me know if the lack of differentiation still occurs. -Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    January 24, 2013 - 12:47 AM
  30. Hi Luisa thanks for your comment :) I don't do lectin panning, as I find that incubation on the culture plates is enough to get rid of most of them, but if you're having a problem with microglia that is an additional option. I usually shake on day 9, but I've found you can shake anywhere from 9 to 1² days, but any longer than that you will get less OPCs. Generally if you see a lot of cells on top of the astrocyte monolayer, they are ready to go. However in my experience this dŒsn't really happen before day 9. Hope this helps RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    April 10, 2013 - 2:28 PM
  31. Hi Ryan.Thanks for this protocol. I did exactly what you have described in this protocol, except the shaking step. I did it without CO2, but the caps are tightly sealed, how is it possible that CO2 will effect pH of tightly sealed flask? My yield was very low, besides I had fibroblast contamination as well. I used uncoated flasks as well, because once during the shaking all the layer came off the bottom of the flask, what do you think would be the reason for this?.And in my experience when FBS is used in OPC culture media it made OPC's to differentiate to astrocytes rather then oligodendrocytes.Overall I couldnt replicate this procedure unfortunately and trying to find other methods..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 20, 2014 - 5:33 PM
  32. Hi Aysel - from what you describe in your message, you didn't follow my protocol.

    1) So you didn't shake the flasks? Or you didn't use the same method of shaking?

    2) As far as I know, all standard tissue culture incubators have some level of CO2 buffering (usually 5%). Strictly speaking, if you tighten the cap of your flasks, there will be no gas exchange between the incubator and the flask, if you are using plugged caps. I use vent-capped flasks (0.22um pore), so gas exchange occurs between the flask and the incubator when the caps are tight. To answer your question, CO2 buffering will have little-to-no effect on the pH of the media if you are using tightly-screwed plugged flask caps.

    3) I haven't experienced fibroblast contamination in my cultures, I imagine this would be a dissection issue. The only source of fibroblasts I can imagine would be from the meninges, so be sure to fully remove this prior to dissociation of the cortex. Unless you are confusing fibroblasts for astrocytes. Too many astrocytes is a result of too much agitation at the differential adhesion step.

    4) I have always used coated flasks, in my experience OPCs will not adhere to uncoated surfaces. I am willing to bet you'll get almost no OPCs if you continue to use uncoated flasks. If you want you can try to use other substrates such as PDL, poly-O-ornithine, collagen etc.

    5) I haven't noticed any significant transformation of OPCs into astrocytes in the presence of FBS. I imagine this might occur more frequently in immortalized OPC cell lines. Perhaps that's what you are thinking of.

    I hope this helps, otherwise best of luck in your research.

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 20, 2014 - 8:52 PM
  33. Hi Ryan, thank you ver much for detailed answer. Sorry for my english, i couldnt explain good.
    I did the shaking of course but without putting shaker inside the CO2 incubator, I did shaking at 37 degree incubation only and at 180 rpm. Because the flasks are uncoated(I have used uncoated flasks for rat OPC"s without problem, that is why I tried this way with mouse as well) I hesitated to increase rpm to 240 or so, to prevent astrocyte detachment, and I also think that fibroblast contamination is because of the meninges. Second time I will prevent it.
    It is good to know that I must use coated flasks, I will try again, if you say so.
    Thank you so much, good luck to too..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 21, 2014 - 6:22 AM
  34. Hi Again,
    Alright - I strongly suggest to put the shaker in the incubator for the overnight shake, as I have found this to be a crucial step in maintaining pH balance. The media on your cells should always be a rich red colour (indicative of a balanced pH) all the time. Mouse OPCs are very sensitive to pH, and will die with too much fluctuation. If during your shaking, the media becomes at all purple-ish or yellow-ish, your OPC yield will drastically reduce. I wouldn't be surprised either if this was a contributing factor to the monolayer detachment you experienced previously. There is a significant difference in the in vitro behaviour/viability of mouse OPCs as compared to rat, hence the generation of this protocol. Your best bet is to simply follow this protocol exactly as is.

    Thanks for your comment, and good luck,
    Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 21, 2014 - 12:25 PM
  35. Hi.
    One more question Ryan, about amount of the brains seeded, I was seeding 2 rat brains/ T75 flask , in the mouse case to obtain same amount of cells seeded I was using 6 brains per flask. Would you suggest to use 3-4 instead of six? and if i seed 6 animals should I increase concentration of insulin added to mixed culture media? Overall what would be optimum amount of brains per T75 flask in your opinion? Does it matter to much? Because here you use 1 brainper T25 flask.
    Thanks again..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 26, 2014 - 4:20 PM
  36. Hi Aysel,
    Again, your best bet for success is to follow the protocol exactly as is - T25 flasks are what this method has been optimized for. I suppose T75 flasks have 3 times the surface area, so in theory 3 mice would have to be seeded to a T75 to yield the same cell density. I've never tried this protocol with T75 flasks, and I know that different culture vessels have different impact on growth and survival of OLs.
    Best - RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 27, 2014 - 10:47 AM
  37. Hi Ryan . I want to say that I replicated the procedure exactly as here, and have got very good yield, but I have 1 more question to you, majority of OPCs die in the differentiation media after 6-7 days of incubation. You indicated that it is important not to distrub them until fixation, but how do you do the medium chage, I put 1 ml media first day and did 2/3 media change each 3 days, I seeded all cells to one 24 well format plate, at each time points(3 d, 6 d, 9 d) I transfer the slides to new plate and fix them there and do medium change for rest of the slides. By the way I culture OPCs at 5% CO2, becaue I have only 2 options 5% and 10%, i cant adjust ph of the incubators at this time point. Is it the contributing factor for death of the cells after 4-5 days of incubation?

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    March 19, 2014 - 2:43 PM
  38. Hi Aysel - I'm glad to hear things are looking up -

    1. I don't suggest differentiating the OLs for longer than 6 days. If you're finding they are not differentiating fast enough, you can add 4 mg of L-Thyroxine to the 100X OL-supplement (see the media recipe list above).

    2. It is normal to lose OLs over the time course of differentiation. That being said, you don't want to encourage death by moving the cells or culturing at low pH. You should not be changing the media of the purified OL cultures at any point - they do not require media changes. The protocol also says to culture the OLs at 8.5% CO2. Since you have access to both 5 and 10% CO2 incubators, and 8.5 is closer to 10 than it is to 5, I suggest culturing them at 10%.

    3. Rather than culturing all of your time points in one dish, use 3 dishes (one for 3 days, one for 6 etc). That way, you won't have to disturb your other time points.

    4. Do not remove the coverslips from the wells of your 24 well dish during fixation - simply add concentrated PFA directly into the media and allow to fix for about 15 mins at room temp.

    Sounds like you're almost there, Best of luck - Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    March 19, 2014 - 3:58 PM
  39. Let me write it again to see if I have understood you correct, you say dont do any media change ever, neither at 3 days or 6 days or further? The other things I will try what you suggest, culturing and seeding in different plates at 10% CO2
    I want to thank you a lot for your help and all of the explanations.
    Thanks ..
    Best,
    Aysel

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    March 19, 2014 - 4:22 PM
  40. Thats correct :)
    You're very welcome,

    Ryan

    Posted by: Ryan O.
    March 19, 2014 - 5:49 PM
  41. Hi Ryan,

    Thanks for sharing this protocol, looks really good and will try it out. I have a couple of questions regarding your protocol and was hoping you could shed some light on some problem I am experiencing at the moment.

    With regards to what you have just described, we actually perform a very similar mixed glial culture on P0-P3 rat brains. Our isolation stages are very similar with the exception we use DNAse1 and L-cysteine along with Papain. Upon plating our cell suspensions the flasks are densely populated with microglia on top, then opc's below and then astrocytes. We basically shake off our microglia before doing the overnight shake for the OPC's.

    My question is how do you get rid/ not see any microglia in your mouse cultures? Is it also possible to obtain microglia from your method?

    We are currently experiencing problems with obtaining OPC's from our overnight shake (in rat). The cells look healthy when in culture with the microglia but once the microglia are removed and we perform the steps required to plate the OPC's we have a lot of contaminants in with the cells, almost like long fibrous structures that are stained by trypan blue. We still obtain + 5 million OPC's but the cells do not look healthy and the morphology is not consistent with OPC's. Upon plating these cells they fail to show characteristics of OPCs and a lot die off. I will mention we do not shake in an incubator but in an orbital shaker at 250rpm with the caps sealed tight and parafilm. Have you ever encountered this?

    Many thanks .

    Reply
    Posted by: Graeme I.
    February 9, 2015 - 1:06 PM
  42. Hi Graeme, thanks for your question.
    We do in fact get microglia in our mixed cultures, but we remove them prior to the overnight shake with a slow short shake (as in the rat method). These shaken off microglia are a very pure population, and can be cultured separately if desired.
    With regard to the problems you’re encountering shaking your rat cultures, I can’t say I’ve experienced anything quite like what you’re describing. It almost sounds like your cultures are suffering from contamination (maybe yeast?). We’ve experienced contamination a couple of times, and it resulted in much of the monolayer dissociating from the base of the flask during the overnight shake. If you like, you can send me a pic of the fibrous structures in the hopes that I could recognize what they are (romea077@uottawa.ca).
    We have never had luck shaking flasks in an orbital shaker – we exclusively use tissue culture incubators with vented caps. One risk of using an orbital shaker is they pose a threat for contamination, as they are often used for bacterial cultures.
    I hope this helps and best of luck,
    Ryan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 20, 2015 - 11:12 AM
  43. Hi Ryan,

    Thanks for your reply.

    I tried the protocol and achieved very nice OPC's so everything seems ok there.

    With regards to what I was seeing after my rat OPC shake, I believe it not to be of any contamination but more something coming out of solution in our media. As a test I shook DMEM10% in a T75 flask, 37 degrees, 250rpm overnight. The next day I took an aliquot and looked at it with trypan blue. To my surprise I saw the same fibrous clumps that I was seeing after the OPC shake

    . My DMEM only contains FBS and pen-step so this has to be something in FBS. My most recent shake off I decided to shake off 5 flasks with DMEM 10% and 5 flasks with OPC media (our OPC media contains 2.5ml FBS vs 50ml in DMEM). The next day after following normal protocol I counted the cells from both conditions. The OPC media flasks had almost none of the fibrous clumps whereas the DMEM flasks had alot. I can now partially get round this problem by filtering with 40uM strainer but have you ever heard or seen this kind of thing. We have used several batches if FBS so it cannot be that every batch has precipitated proteins in it but perhaps what were doing is causing precipitation of FBS proteins that are affecting the OPC's?

    Thanks

    Graeme

    Reply
    Posted by: Graeme I.
    March 15, 2015 - 4:16 PM
  44. Hi Ryan,

    Is your FBS from Invitrogen decomplemented ? If so did you buy decomplemented or did you heat it at 56*C and for how long.

    Thanks

    Reply
    Posted by: Ludovic D.
    February 24, 2017 - 10:40 AM
  45. Hi Ludovic,
    I've used FBS that has been heat-inactivated by the manufacturer, and I've also used FBS that I've heat inactivated myself. For the latter, if memory serves, about 30 minutes at roughly 50 degrees C should do the trick (water bath).
    Good luck, Ryan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 26, 2017 - 11:49 AM
  46. Hi Ryan,
    I am wondering if you have any experience with adding Cre Recombinase Adenovirus to the cultures? And if you think a particular day would be best to add it? I was thinking of adding it on D8 (1 day before the full media change) but wasn't sure if adding virus and then shaking the cells would cause too much stress?
    Thanks,
    Megan

    Reply
    Posted by: Megan R.
    April 30, 2018 - 2:39 PM

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