Author Produced

Härledning av anrikat Oligodendrocyte kulturer och Oligodendrocyte / Neuron Myelinating Co-kulturer från Postnatal Murine vävnader

Neuroscience
 

Summary

Den här artikeln beskriver metoder för att beräkna berikad populationer av murina oligodendrocyte föregångare celler (OPC) i primär kultur, som skiljer för att producera mogna oligodendrocyter (OLS). Dessutom beskrivs i rapporten tekniker för att producera murina myelinating co-kulturer med sådd musen OPCs på en neurite bädd av musen dorsal nervceller rot ganglion (DRGNs).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues. J. Vis. Exp. (54), e3324, doi:10.3791/3324 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Identifiera de molekylära mekanismerna bakom OL utveckling är inte bara avgörande för att främja vår kunskap om OL biologi, men har även betydelse för att förstå patogenesen vid demyeliniserande sjukdomar som multipel skleros (MS). Mobil utveckling är ofta studeras med primär modeller cellkultur. Primära cellkulturer underlättar utvärderingen av en viss celltyp genom att erbjuda en kontrollerad miljö, fri från främmande variabler som finns in vivo. Medan OL kulturer från råttor har gett en stor mängd insikter i OL biologi, har liknande försök till upprättandet OL kulturer från möss mötts med stora hinder. Utveckla metoder för att kulturen murina primära Ols är absolut nödvändigt för att kunna dra nytta av den tillgängliga transgen mus linjer.

Flera metoder för utvinning av OPCs från gnagare vävnad har beskrivits, från neurosphere härledning, differential vidhäftning rening och immunopurification 1-3. Medan många metoder ger framgång, de flesta kräver omfattande kultur gånger och / eller dyr utrustning / reagenser. För att kringgå detta är rena OPCs från murina vävnad med en anpassning av den metod som ursprungligen beskrevs av McCarthy & de Vellis 2 att föredra. Metoden innebär att fysiskt separera OPCs från en blandad gliaceller kultur härstammar från neonatal gnagare cortex. Resultatet är en renad OPC befolkning som kan delas in i en OL-berikad kultur. Detta tillvägagångssätt är tilltalande på grund av dess relativt korta kultur tid och onödiga krav på tillväxtfaktorer eller immunopanning antikroppar.

Och samtidigt undersöka mekanismerna för OL utveckling i ett renat kultur är informativ, ger den inte den mest fysiologiskt relevanta miljö för att bedöma myelinskidan bildas. Co-odling OLS med nervceller skulle låna insikt i de molekylära grunderna som reglerar OL-medierad myelination av axoner. För många OL / neuron co-kultur studier har dorsala ganglion neuron (DRGNs) visat sig vara den neuron typ av val. De är idealiska för co-kultur med OLS på grund av deras enkla utvinning, minimalt förorenande celler, och bildandet av tät neurite bäddar. Även studier med råtta / mus myelinating xenocultures har publicerats 4-6, OL / DRGN en metod för härledning av dessa myelinating co-kulturer från postnatal murin vävnad inte har beskrivits. Här presenterar vi detaljerade metoder för att effektivt kunna producera sådana kulturer, tillsammans med exempel på förväntade resultat. Dessa metoder är användbara för att hantera frågor som rör OL utveckling / myelinating funktion och som är användbara verktyg inom området neurovetenskap.

Protocol

Etik Statement

De möss som används i detta arbete vårdades enligt kanadensiska rådet om Djurvård (CCAC) riktlinjer. Etiskt godkännande för utfört experiment erhölls från University of Ottawa Djurvård kommittén enligt protokoll nummer OGH-119.

1. Dissection - neonatal musen cortex för OPC utvinning

  1. Offra P0-P2 mus enligt institutionens riktlinjer.
  2. Dissekera hjärnan och placera i en petriskål med iskall MEM (antibiotika-fri).
  3. Överför skålen en dissektion mikroskop.
  4. Med hjälp av en skalpell med hjärnan ryggsidan upp, göra ett grunt snitt sagittally längs den mediala kanten av varje cortex (Fig 1a). Detta snitt bör endast passera meningeal lagret för att underlätta dess avlägsnande.
  5. Använd fin tippade pincett för att dra av hjärnhinnorna i en lateral sätt. Om det görs noggrant, kan detta lager tas bort i ett stycke. Under detta steg, ta bort lukt glödlampor.
  6. Med hjärnan ventrala sidan upp, göra en djup sagittal snitt där hjärnbarken möter ventrala delen av diencephalon (Fig 1b).
  7. Med hjärnan ryggsidan upp, separera cortex från mellanhjärnan genom att bända vävnaden i ett medialt till lateralt mode (Fig 1c, c '). Ta bort eventuella rester av hjärnhinnorna i detta steg.
  8. Dice varje cortex i ca 4 bitar och försiktigt över till ett 15 ml koniskt rör som innehåller 350 mikroliter av MEM per mus hjärnan. Håll röret på is tills alla möss har bearbetats.
  9. Upprepa steg 1,1-1,8 för kvarvarande möss.

2. Dissociation av neonatal cortex och underhåll av blandade gliaceller kulturer

Anm: Införandet av bubblor i cellsuspension bör undvikas under alla följande steg.

  1. Tillsätt 15 ml koniska röret med färska dissekeras hjärnor till 37 ° C vattenbad i 3 min.
  2. Överför hjärnor till en steril vävnadskultur huva.
  3. Försiktigt passerar tärnade cortex genom en P1000 pipettspets för att generera mindre fragment. Sluta pipettering gång finns det inga hjärnan bitar stora nog för att störa ett smidigt flöde av fjädring genom pipettspetsen.
  4. Tillsätt 75 mikroliter av OPC papain lösning per hjärnan i den koniska röret. OPC papain lösningen måste förvärmas vid 37 ° C i 20 minuter före användning.
  5. Inkubera i 37 ° C vattenbad i 20 min. Ungefär var 2 minuter, vänd försiktigt röret för att förhindra att vävnad aggregering. Under denna tid, tillsätt 5 ml av blandad gliaceller odlingssubstrat till varje poly-L-lysin (PLL) bestruket (1 mg / ml) T25 kolven (en kolv per mus hjärnan), och lägg i en 37 ° C vävnadskultur inkubator vid 8,5% CO 2.
  6. Efter 20 min, tillbaka vävnaden suspensionen till den sterila huven och tillsätt 2 mL av blandad gliaceller odlingssubstrat per hjärnan till röret. Låt sitta i 10 min i rumstemperatur för att inaktivering av OPC papain lösningen.
  7. Alikvotera vävnaden suspensionen i 5 rör mL plast. Antalet rör ska matcha antalet dissekerade hjärnor vilket resulterade i cirka 2,5 mL per rör.
  8. Använd en steril eld-polerat glas pasteurpipett försiktigt mal sönder vävnaden i varje rör. Mal sönder först långsamt och gradvis öka hastigheten som bitar dissociera. Mal sönder ungefär 10-15 gånger, men detta antal kan variera beroende på effekten av matsmältningen.

Obs: Under-trituration ger dålig dissociation av vävnaden, medan över-trituration kommer att negativt påverka cellernas livskraft. Det är viktigt att inte införa bubblor i lösningen, eftersom detta kommer att få allvarliga konsekvenser cellernas livskraft.

  1. När det inte finns några synliga vävnad klumpar kvar i suspension, överföring till en 50 ml koniska rör med 4 mL av blandad gliaceller odlingsmedia per hjärnan (dvs 4 hjärnor = 16 ml blandas gliaceller kultur media).
  2. Vänd försiktigt 50 ml koniska rör och upprepa för de resterande 5 ml rör.
  3. Alikvotera den poolade cellsuspension i 15 ml koniska rör (ca 6,5 ​​ml per 15 ml rör). Antalet 15 mL rör ska matcha antalet dissekeras hjärnor.
  4. Centrifugera rören vid 1200 rpm (~ 300 g) för 5 min.
  5. Försiktigt aspirera supernatanten och tillsätt 1 ml varmt blandade gliaceller närsubstrat till varje 15 ml koniska rör.
  6. Sakta suspendera pelleten med en P1000 pipettspets, försiktigt så att inte införa bubblor. Lägg cellsuspensionen från varje rör till en pre-jämvikt PLL-belagda T25 kolv, vilket gör den totala volymen av den kultur media till 6 ml.
  7. Placera kolvarna i en vävnad kultur inkubator i 3-4 timmar så att cellerna att fästa till PLL underlaget. Utför en komplett mediaspelare förändring genom att pipettera ut i media och lägga till 6 ml rent blandade gliaceller kultur media till kolvarna. Detta steg tar bort mycket av skräporsakas av trituration och främjar kultur livskraft. Om OL / DRGN co-kulturer önskas, se avsnitt 3 i detta protokoll.
  8. Efter tre dagar av kultur, utför med 2 / 3 media förändring genom att ta bort 4 mL av media, och ersätta med 4 ml rent blandade stödjeceller kultur media. På denna punkt bör en astrocyternas cellslager att bildas på basen av kolvarna.
  9. Dag 6, utför en annan 2 / 3 media ändra och komplettera kolvar med en slutlig koncentration på 5 mikrogram / ml insulin. På denna punkt bör en astrocyternas cellslager synas tydligt, ovanpå vilken OPCs kommer att frodas.

3. DRGN isolering

Notera: Att producera OL / DRGNs co-kulturer, bör DRGNs upprättas dagen efter blandad glial kultur generation. Både kultur typerna odlas oberoende av varandra, och kombinerade efter 9-10 dagar.

  1. Offra P5-P10 mus enligt institutionens riktlinjer.
  2. Utdrag ryggraden, och överför till en ren petriskål.
  3. Klipp bort så mycket muskler och ben från ryggraden som möjligt (Fig 1d, d '), eftersom detta kommer att underlätta dissekering av dorsalrotsganglier (DRG).
  4. Överför trimmade ryggraden till en ny petriskål ventralsidan upp. Använda dissektion sax och börjar caudally, skär medialt genom ryggraden i ett längsgående sätt.
  5. Med hjälp av två par pincett, försiktigt bända upp ryggraden att exponera ryggmärgen.
  6. DRG kan hittas under och i sidled till ryggmärgen. Använda fint tippade pincett och ta försiktigt bort DRG samtidigt undvika skador på ganglierna (Fig. 1e).
  7. Överför bort DRG att iskallt Hanks buffrad saltlösning (HBSS, antibiotika-free) i en ny petriskål. Det DISSEKTOR bör syfta till att utvinna 40 DRG per mus (Fig 1f).
  8. När DRG har utvunnits, trimma DRG av alltför långa rötter (Fig. 1 g, g) för att minimera införandet av förorena celler i kultur (gliaceller, fibroblaster).
  9. Överför DRG till ett 1,5 ml centrifugrör innehåller 500 mikroliter av iskall HBSS.
  10. Centrifugera vid 1200 rpm (~ 300 g) för 5 min vid 4 ° C till pellets i DRG.
  11. Överför centrifugrör till en steril vävnadsodling huva och ta bort HBSS från rören.
  12. Tillsätt 500 mikroliter av förvärmda (20 min vid 37 ° C) DRG papain lösning och inkubera rören i ett 37 ° C vattenbad i 10 min. Vänd rören var 2 min för att förhindra att vävnad aggregering.
  13. Upprepa steg 3,10.
  14. Ta bort DRG papain lösning och tillsätt 500 mikroliter av förvärmda (20 min vid 37 ° C) kollagenas en lösning. Inkubera i 37 ° C vattenbad i 10 min, vända varje 2 min.
  15. Upprepa steg 3,10.
  16. Avlägsna supernatanten och tillsätt 1 ml DRGN medier. Invertera röret flera gånger.
  17. Upprepa steg 3,10.
  18. Upprepa steg 3,16.
  19. Coat en steril eld-polerat glas pasteurpipett med bovint serumalbumin (BSA) genom att pipettera en lösning av 0,25% BSA i HBSS flera gånger. Beläggningen med BSA-lösning kommer att hindra DRG från att fastna i väggarna i glaspipett.
  20. Mal sönder DRG med BSA-belagda pipett försiktigt i början, och med ökande intensitet gång klumpar börjar isär. Mal sönder ungefär 10-15 gånger, men detta antal är beroende på graden av matsmältning, och antalet DRG per rör.
  21. När dissociation uppnås, passera suspensionen genom ett 50 ìm filter till en steril petriskål innehåller 7 ml DRGN medier. Filtrering kommer att eliminera mycket av skräp från cellsuspension, även om detta steg är inte kritisk.
  22. Inkubera petriskål på 8,5% CO 2 för cirka 1,25 timmar.
  23. Coat flera 12 mm täckglas med LN2 (10 mikrogram / ml i PBS) i en 24-bra maträtt under denna inkubationstid.
  24. När inkubationen är klar, observera petriskål under starkt fält. DRGNs identifieras som stora arbetsföra, fas mörka celler. Snurra petriskål försiktigt lyfta någon följas DRGNs.

Obs! Många förorenar celler har starkt anslutit sig till petriskål, vilket berikar din cell, suspension DRGNs.

  1. Överför cellsuspension till ett 15 ml koniskt rör. Försiktigt skölj skålen med 4 mL DRGN medier för att samla in eventuella kvarstående DRGNs. Överför ytterligare 4 ml till det koniska röret.
  2. Centrifugera i 5 min vid 1200 rpm (~ 300 g).
  3. Aspirera supernatanten och suspendera pelleten i 500 mikroliter av färska DRGN medier.
  4. Beräkna antalet gav DRGNs med en hemocytometer. Var noga med att bara räkna DRGNs, och inte andra celltyper. DRGNs kan identifieras genom deras stora sfäriska cell organ.
  5. Seed 30,000-50,000 DRGNs varje LN2-belagda täckglas i 1 ml DRGN medier, och lägg i en 37 ° C vävnadsodling inkubator vid 8,5% CO 2 över en natt.
  6. Nästa morgon, en fullständig media förändring genom att ersätta DRGNmedia med OL media (minus CNTF) med en slutlig koncentration av 1% Pen / STREP och 10 mikrometer FuDR.
  7. Dag 3 och 5, utför en 3 / 4 medier förändras med samma media som i steg 3,30.
  8. Dag 7, utföra en fullständig media förändring med OL media (minus CNTF, Pen / Strep, FuDR).
  9. Dag 9 borde DRGNs har bildat en omfattande neurite säng, och är nu redo att co-odlade med OPC.

4. Rening av OPCs från blandade gliaceller kulturer för etablering av OL-berikade kulturer eller OL / DRGN co-kulturer

  1. Dag 9 i blandade gliaceller kulturen, överföring kolvarna till en skakapparat i en 5% CO 2 vävnadskultur inkubator. Placera kolvarna på toppen av tomma T25 flaskor för att förhindra att värmen från skakapparat påverkas negativt av blandade glial kulturer. Låt kulturerna till jämvikt till denna nya inkubator i 1 timme.
  2. När kolvarna har jämvikt, skaka kolvar vid 50 rpm i 45 min. Syftet med denna skaka är att ta bort löst vidhäftande förorenar celler från monolager.
  3. Flytta celler till en vävnadskultur huva och ta bort alla media från kolvarna. Ersätt med 4 ml rent blandade gliaceller närsubstrat kompletteras med 5 mikrogram / ml insulin.
  4. Placera kolvarna tillbaka på shaker och låt jämvikta i ca 3 timmar.
  5. När kolvarna bringas till jämvikt, fast dem ordentligt i skakapparat och skaka kolvarna i cirka 16 timmar vid 220 rpm (över natten).
  6. Nästa morgon, om OLS skall odlas i avsaknad av DRGNs (dvs OL-berikade kultur), jacka flera sterila 12 mm täckglas med LN2 (10 mikrogram / ​​ml i PBS) i 1 timme. Överför täckglas till 24-bra mat, tvätta med PBS följt av en OL media tvätt. Tillsätt 1 mL OL media till varje brunn och utjämna till 8,5% CO 2.
  7. Jämvikta 10 cm rätter vävnadsodling med 5% CO 2 i 30 min. En maträtt kommer att krävas för varje 2 kolvar. Dessa kommer att användas för differential vidhäftning-vinst för suspenderade OPCs.
  8. När 30 min jämviktstiden period har passerat, överföra material från skakas flaskor till disken. Varje rätt bör få media från 2 kolvar, motsvarande cirka 8 ml cellsuspension per 10 cm maträtt.
  9. Inkubera rätter på 5% CO 2 för 30 min, samtidigt som den ger en mild knuff i 15 min märket. Detta knuffa förhindrar OPCs från att fastna i 10 cm skålen.
  10. När inkubationen är klar undersöka disken under ljusa fältet. OPCs identifieras som småcellig klumpar, vanligtvis av 3-5 celler, men ibland bildar stora aggregat som liknar neurospheres. Många icke-OL härstamning celler bör vara fast anslutit sig till botten av plattan. Snurra försiktigt plattorna för att lossa några löst följs OPCs, och överför cellsuspensionen från varje platta i en 15 ml konisk tub.
  11. Centrifugera vid 1200 rpm (~ 300 g) för 5 min.
  12. Återsuspendera pelleten i 1 ml OL media med en P1000 pipettspets, följt av resuspension med en P200 pipettspetsen.
  13. Räkna celler med en hemocytometer.
  14. För berikat-OL kulturer, frö 25.000 - 50.000 OPCs till varje 12 mm LN2-belagda täckglas i en slutlig volym på 1 ml OL medier.
  15. För OL / DRGN co-kulturer, en fullständig OL media (minus CNTF) förändring på DRGNs från avsnitt [3], och försiktigt lägga 50 tusen celler från OPC-berikade cellsuspension. Var noga med att inte störa sängen DRGN neurite under tillsättningen av OPC.
  16. Placera kulturer i en 37 ° C inkubator vid 8,5% CO 2, och undvika att ta bort tills fixering. Murina OPCs är känsliga för förändringar i pH, och borttagande från inkubatorn kommer att ändra pH-värdet i OL media. Lägg också märke till, kommer tillägget av dH 2 O på den tomma brunnar som omger cellkulturer förhindra avdunstning av kulturen medierna, vilket minimerar fluktuationer i koncentrationer lösta ämnen inom OL media. Detta kommer att ge en mer enhetlig miljö för OPC.

5. Behandling av kulturer immunofluorescensmikroskopi

  1. Fix kulturer med 100% metanol vid -20 ° C i 10 min, eller 3% paraformaldehyd i rumstemperatur i 15 min.
  2. Permeabilize täckglas med 0,1% Triton-X-100 i 10 min, skölj med fosfatbuffrad-saltlösning (PBS) och block i 1 timme i 10% get serum.
  3. Inkubera täckglas med primära antikroppar spätts i blockerande lösningen över natten vid 4 ° C.
  4. Tvätta täckglas 3 gånger med PBS och inkubera med Alexa-fluor konjugerade sekundära antikroppar (Invitrogen) spätts i blockerande lösningen för 45 min.
  5. Motfärga med 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) och tvätta täckglas flera gånger med PBS.
  6. Mount täckglas i DAKO fluorescerande monteringsmedel.
  7. Analysera bilderna via immunofluorescens mikroskopi. I detta protokoll har bilderna analyserats med antingen ett Zeiss Axiovert 200M inverterad fluorescensmikroskop eller en Zeiss LSM 510 META laserskanning konfokalmikroskop.

6. Hela cellprotein utvinning från OL-berikade kulturer

  1. Ta bort 24-såväl kulturer från inkubatorn och svalt på is i 3 min.
  2. Ta försiktigt bort media och lägga 10-20 mikroliter av lyseringsbuffert (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,5% natriumdeoxikolat, 1% Triton-X-100, med 0,1% pepstatin, aprotinin, PMSF, leupeptin, natrium orthovanadate) till varje brunn (Minst 8 brunnar per prov föreslås).
  3. Skrapa brunnarna med ett brett bar P1000 pipettspetsen och överföra lysat till ett 1,5 ml centrifugrör.
  4. Passera lysat genom en 30 ½-gauge spruta ca 15 gånger och kyla på is i 30 min.
  5. Centrifugera rören vid 14.000 rpm (~ 20 tusen g) i 15 minuter vid 4 ° C.
  6. Överför supernatanten till nya centrifugrör och förvara vid -80 ° C.

7. SDS-PAGE analys berikat-OL kultur protein

  1. Lös 30 mikrogram protein per prov för att minska buffert genom SDS-PAGE på standard 12% poly-akrylamid geler.
  2. Halvtorr överföra geler på PVDF membran.
  3. Block membran för 1 timme i 5% skummjölkspulver i TBST (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20).
  4. Inkubera membran med primära antikroppar spätts i blockerande lösningen i 1 timme.
  5. Tvätta membran 3 gånger med TBST i 10 min.
  6. Inkubera membran med HRP-konjugerade sekundära antikroppar i 45 minuter i blockerande lösningen.
  7. Tvätta membran flera gånger med TBST och inkubera med Amersham ECL Plus Western blotting upptäckt reagens (GE Healthcare) i 5 minuter.
  8. Identifiera protein band med standard vetenskaplig avbildning film.

8. Representativa resultat:

I detta protokoll är OPCs utvidgas på ett astrocyternas cellslager inom en blandad glial kultur. Detta blandade gliaceller kulturen härstammar från P0-P2 neonatal mus cortex. Dag 1 in vitro (DIV1), innehåller den blandade gliaceller kulturen celler med varierande morfologier sedda av faskontrast mikroskopi (Fig 2a). På DIV3 börjar en astrocyternas cellslager bildas på basen av kolven, och på DIV8 kan OPCs tydligt observeras på monolager ytan. På DIV9 har frodas OPCs nått tillräcklig densitet är renat genom natten med hög hastighet orbital skakning. När reningsprocessen är klar, är resultatet en OPC-berikad cellpopulation. Vid DIV1-post rening, OPCs har enkla morfologi, som sträcker sig några processer (Fig. 2b). På DIV3 efter rening, har celler förlängd en komplex meshwork av processer, som påminner om omogna Ols. På DIV6 efter rening, har renat Ols tillplattade och förväntade broschyr-liknande membran strukturer. Denna morfologiska utveckling är typiskt för in vitro-mognad Ols.

Immunofluorescensmikroskopi visar det renade celler är av OL-härstamning (Fig. 3a). Seedade OPCs inledningsvis uttrycka kondroitinsulfat proteoglycan (NG2), och utvecklas till myelin-associerad glykoprotein (MAG) positiva omogna OLS inom tre dagar efter sådd (figur 3b). På DIV6 många Ols uttrycka myelin grundläggande protein (MBP), och har typiska mogna OL morfologi. Procent OL-härstamning celler kvantifieras vid olika tidpunkter för att fastställa renheten i OL-berikade kulturer (Fig. 3c). På DIV1 efter rening, kulturer är 50 ± 14% NG2 + ve OPCs, utan MAG + ve eller MBP + ve Ols. Detta indikerar den renade OL-härstamning celler är i förstadiet till seedning tid med försumbar antal differentierade Ols. På DIV3 har många Ols differentieras till MAG + ve celler (24 ± 5,9%) medan några behåller föregångaren fenotypen, och förblir NG2 + (13 ± 8,0%). På DIV3, är en liten del av MAG + ve celler (3,2 1,2%) som uttrycker också MBP. På DIV6, 20 ± 5,9% av OLS är MAG + ve medan 12 ± 7,3% kvarstår som NG2 + ve OPCs. Dessutom, 21 ± 9,3% av celler i kultur MBP + ve Ols vid denna tidpunkt. SDS-PAGE analys visar den sorterade uttryck för 2'3'-cyklisk-nukleotid 3'-fosfodiesteras (CNP) och MBP över 6 dagar kulturen period, vilket också visar förmåga OPCs i kultur för att dödligt differentiera till mogna OLS (Fig. 3d ). Tillsammans etablerar dessa data denna metod som ett sätt att producera en OL-berikad kultur som är lämpligt för studier av OL mognad från OPC.

Detta protokoll beskriver också metoder för att upprätta OL / DRGN co-kulturer med hjälp av mus-only vävnad källor. Men för att producera det samarbete kulturen måste DRGNs först odlas enbart för att producera en adekvat neurite nätverk. Dessa postnatala murin neuron kulturer som odlas för 9 dagar i låga serum media med 10 mikroM FuDR tillskott för att förhindra spridning av förorenande fibroblaster och GL IAL celler. Under nio dagar in vitro, isolerad DRGNs producera en tät neurite säng (Fig. 4a). Detta neurite säng är immunopositive för neuronala markörer neurofilament 200 (NF) och Tuj1 (Fig. 4b). Vid denna punkt kan renas OPCs läggas till neurite sängar, och odlade i ytterligare sex dagar att få fram myelinating co-kulturer.

Vid DIV6 av OL / DRGN co-kultur, + många MBP har OLS kan konstateras vara bland de NF + ve DRGN neurites (Fig 5a). Vid närmare granskning, är OLS framgår att få kontakt med många DRGN neurites, ofta ensheathing dem med en MBP + ve membran (Fig 5b, c).

Figur 1
Figur 1. Dissektion mikroskop bilder av särskilda aspekter av neonatal mus cortex och DRG isolering. (A) ryggfenan bild av en nyligen utvunna neonatal musen hjärnan. De streckade linjerna anger det område där snitt skall göras för att underlätta avlägsnandet av meningeal lager. (B) ventralsidan av hjärnan, streckade linjerna anger det område där hjärnbarken möter ventrala diencephalon. Djupa snitt skall göras längs de streckade linjerna till stöd för isolering av cortex. (C-c) Visuell skildring av hur man ska bända hjärnbarken bort från resten av hjärnan. (D) En nyligen isolerade P5-P10 mus ryggraden före trimning bort överflödigt muskler och ben (d '). (e) Placering av DRG i ryggraden. (f) ungefärligt antal DRG som bör isoleras från en mus. (g) Ett DRG med långa rötter som kräver putsning innan enzymatisk spjälkning. Den streckade linjen visar den region där rötterna ska putsas. (G ') DRG efter root-trimning.

Figur 2
Figur 2. OPCs utvidgas inom en blandad gliaceller kultur, renas och därefter differentieras som en OL-berikad kultur. (A) fas kontrastrika bilder av blandad gliaceller kulturer i olika stadier av utveckling. På DIV1, celler visas runt med några tillplattade celler. Stratifiering av blandade gliaceller kulturen börjar på DIV3 där astrocyter bildar en enhetlig monolager vid basen av kolven, på vilken OPCs föröka sig. Många OPCs ses vid DIV8 (pilar) anslutit sig till ytan av astrocyternas monolager. (B) När renas från de blandade gliaceller kulturen har DIV1 OPCs förlängs endast ett fåtal processer. På DIV3 har celler utökade många processer, som påminner om mellanliggande steg Ols. På DIV6, tillplattad OLS (asterisk) verkar ha producerat membranös ark (streckad linje). Skala barer, 50 ìm.

Figur 3
Figur 3. Karakterisering av OL-berikad kultur. (A) Confocal bilder av isolerade OLS i olika stadier av utveckling. NG2 + ve OPCs har enkla morfologi, medan MAG + ve OLS har flera arborous processer. MBP + ve OLS har förlängt membranös myelin-liknande blad. Skala Bar, 50 ìm. (B) Renat OL-härstamning celler ursprung som OPC, och differentierar till MAG + ve, MBP + ve OLS över 6 DIV. På DIV1, alla OPCs är NG2 + ve, medan ingen är MAG + ve eller MBP + ve. På DIV3, MAG + ve och få MBP + ve Ols är nu uppenbar. Majoriteten av OLS är MAG och MBP + ve på DIV6, med få kvarvarande NG2 + ve OPCs. Skala bar, 100 ìm. (C) Medelvärden ± SD i procent OL-härstamning celler i olika skeden av utvecklingen över 6 DIV. På DIV1, alla OL-härstamning cellerna NG2 + ve och står för 50 ± 14% av det totala celler i kulturen. Vid DIV3 och DIV6, OL-härstamning celler respektive står för 36 ± 6,8% och 32 ± 8,4% av det totala celler, som består av olika proportioner av NG2 + ve, MAG + ve och MBP + ve Ols. (D) SDS-PAGE utförda på protein från berikad OL-kulturer visar den sorterade uttryck för OL-markörer CNP och MBP över 6 DIV kulturen period.

Figur 4
Figur 4. Karakterisering av DRGN kulturen före OPC sådd. (A) fas kontrast bilder av DRGNs över 9 DIV kultur perioden före OPC sådd. DRGNs ursprung som stora arbetsföra celler med få processer och producera en alltmer komplex neurite nätverk. Skala bar, 100 ìm. (B) Confocal bilder av DRGN kulturer fastställts till DIV9 (före OPC seeding) och färgas för neuron-specifika markörer Tuj1 och NF200. DRGNs har tagit fram en neurite nätverk på vilken OPCs kan seedas att producera OL / DRGN myelinating co-kulturer. Skala Bar, 50 ìm.

ENT "> Figur 5
Figur 5. OLS co-odlade med DRGNs resultera i OL-medierad inslagning av DRGN neurites med MBP + ve membran. (A) En 4-fält konfokala bild montage av en DIV6 OL / DRGN co-kultur. Många MBP + kan ve OLS ses interagera med det underliggande DRGN neurite säng. Skala bar, 100 ìm. (B) En förstorad konfokala syn på MBP + ve OLS inslagning flera DRGN neurites. Skala Bar, 50 ìm. (C) digital förstoring av regionen betecknas i (b) Om en DRGN neurite är lindade med OL membran. Skala Bar, 25 ìm.

Discussion

Denna rapport beskriver en metod för att isolera murina OPCs för differentiering i OL-berikade kulturer eller OL / DRGN co-kulturer. När odlade Enbart OPCs differentiera till MBP + ve Ols, som producerar myelin-liknande membranös ark. När läggs till DRGN neurite sängar, OLS HÖLJA IN den DRGN neurites med MBP + ve membran. Denna modell fördelar undersökningen av de komplexa underbyggnaden för OL-medierad axonal ensheathment.

Medan av stort värde, är inrättandet av sådana kulturer tekniskt utmanande. Särskilt krävande aspekter inkluderar effektiva vävnad matsmältning / dissociation, underhåll av balanserade odlingsmedia pH och DRGN medier förändringar. Det är viktigt att tänka på att längden på matsmältningen, är mycket vävnad smält och mängden trituration påverkar effekten och slutresultatet av vävnadsdissociering. Det är inte ovanligt för erfarna forskare att få låga cellulära avkastningen från dissocierade nervsystemet vävnader. Dessutom murina OPCs tenderar att vara känsliga för förändringar i pH-värdet i kultur medierna, särskilt under alkaliska förhållanden. Underhållet av kulturer på 8,5% CO 2 syftar till att förebygga detta, eftersom OPCs verkar bättre tolerera något sura förhållanden över grundläggande. När det gäller utfodring DRGNs, måste medierna förändringar ske snabbt för att inte uttorka nervceller måste dock vara försiktig så att inte störa den utvecklingen neurite sängen. Plötsliga medier förändringar kan lösgöra neurite sängen från underlaget, och sannolikt leda till dess fullständiga avståndstagande från täckglas.

Den potentiella förtjänsten av detta modellsystem överskuggar kraftigt den tekniskt krävande natur. En fördel med detta system är att använda postnatala möss i cellodling härledning kringgå behovet av att offra avelshonor att skörda embryonal vävnad. En annan fördel är avsaknaden av krav på tillväxtfaktorer (GFS) för utbyggnaden av OPC. Blandade gliaceller kulturer tillhandahålla en miljö som stödjer spridning av OPCs, förmodligen beroende på att förekomsten av astrocyternas-derived trofiska faktorer. Andra metoder, såsom härledning via neurospheres 7,8, lita på mitogena egenskaper GF t.ex. grundläggande fibroblast tillväxtfaktor (bFGF), epidermal tillväxtfaktor (EGF) och platelet-derived growth factor (PDGF) för OPC expansion. Likaså att använda efter födsel (P5-10) möss DRGNs undviker kravet att komplettera den kultur media med nervtillväxtfaktor (NGF), en neurotropa faktor som krävs för in vitro-överlevnad embryonala DRGNs 9, 10. Det är av intresse att undvika att använda NGF som negativt påverkar myelinating kapacitet OLS vid odling med DRGNs 4. Undvika användning av GF-kompletterats media har också ekonomiska fördelar, eftersom dessa reagenser blir dyra när de används på stor skala.

Den kanske viktigaste fördelen med denna kultur-modellen är dess härledning från mus med enbart vävnader, vilket ger möjligheter att härleda både OPCs och DRGNs från det breda utbudet av transgen mus linjer. Detta möjliggör studier av både DRGN och / eller OPC-specifika egenskaper som styr myelination. Detta kommer att vara särskilt viktigt för att belysa den receptor / ligand interaktioner som reglerar OL-medierad myelination av axoner. Sammantaget är denna teknik av stort värde med hänsyn till neurovetenskaplig forskning på grund av dess tillämpningar att förstå de molekylära signaler underliggande myelination.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Projektet finansierades av ett bidrag från Multiple Sclerosis Society of Canada till RKRWO är mottagare av ett utbildningsbidrag från Multiple Sclerosis Society of Canada. SDR är en mottagare postdoktorala stipendier från Multiple Sclerosis Society of Canada och den kanadensiska Institutes of Health Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Multicell 319-005-CL
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Invitrogen 14170-112
Minimum Essential Media (MEM) GIBCO, by Life Technologies 12360-038
Fetal Bovine Serum (FBS) GIBCO, by Life Technologies 10091-148
Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) GIBCO, by Life Technologies 15140-122
GlutaMAX Invitrogen 35050-061
Poly-l-lysine Sigma-Aldrich P2636
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503
Human merosin purified protein (LN2) EMD Millipore CC085
Recombinant rat ciliary neurotrophic factor (CNTF) PeproTech Inc 450-50
L-thyroxine Biochemika 89430
Holo-transferrin Sigma-Aldrich T0665
B27 supplement GIBCO, by Life Technologies 0080085-SA
Bovine insulin Sigma-Aldrich I6634
3,3',5-Triiodo-L-thyronine Sigma-Aldrich I6634
Progesterone Sigma-Aldrich P8783
Putrescine Sigma-Aldrich P7505
Sodium Selenite Sigma-Aldrich S5261
5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FuDR) Sigma-Aldrich F0503
Papain solution Worthington Biochemical LS003126
DNaseI Roche Group 1010159001
L-cysteine Sigma-Aldrich C7352
24-well tissue culture dishes Cellstar 662-160
T25-tissue culture flasks with vent cap Corning 430639
10 cm tissue culture dishes Corning 430167
10 cm petri dish Fisher Scientific 0875713
Collagenase A Roche Group 103578
CellTrics 50 μm filter (optional) PARTEC 04-004-2327
Myelin Basic Protein (MBP) Antibody AbD Serotec MCA409S
NG2 antibody EMD Millipore AB5320
Myelin-Associated Glycoprotein (MAG) antibody EMD Millipore MAB1567
2',3'-Cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNP) antibody Covance SMI-91R-100
Actin pan Ab-5 antibody Fitzgerald 10R-A106AX
Neurofilament-200 (NF) antibody Sigma-Aldrich N4142
Tubulin beta-3 chain (Tuj1) antibody EMD Millipore MAB5544
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11008
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A21422
Alexa Fluor 647 goat anti-rat (IgG) (H+L) secondary antibody Invitrogen A21247
Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody Bio-Rad 170-6516
Goat anti-rat IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-2065
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542

Media Recipes

100X OL-Supplement*

IngredientAmount to add
DMEM100 mL
BSA1.02 g
Progesterone0.6 mg
Putrescine161 mg
Sodium Selenite0.05 mg
3,3',5-Triiodo-L-thyronine4 mg

*Store at -80 °C in 250 μL aliquots

OL media

IngredientAmount to add
DMEM23.75 mL
100X OL-Supplement250 μL
Bovine insulin (from 1 mg/mL stock)125 μL
GlutaMAX250 μL
Holo-transferrin (from 33 mg/mL stock)37.5 μL
B27 Supplement500 μL
FBS125 μL
CNTF (from 50 ng/μL stock)25 μL

Mixed glial culture media (made up in DMEM)

IngredientFinal concentration
FBS10%
Pen/Strep (0.33% from stock)33 units/mL Penicillin and 33 μg/mL Streptomycin
GlutaMAX1%

DRGN media (made up in DMEM)

IngredientFinal concentration
FBS10%
Pen/Strep (1% from stock)100 units/mL Penicillin and 100 μg/mL Streptomycin

Digestion Solution Recipes:

OPC papain solution (made up in MEM)

IngredientFinal concentration
Papain solution1.54 mg/mL
L-cysteine360 μg/mL
DNaseI60 μg/mL

DRG papain solution (made up in HBSS)

IngredientFinal concentration
Papain1.54 mg/mL
L-cysteine360 μg/mL

DRG Collagenase A solution (made up in HBSS)

IngredientFinal concentration
Collagenase A4 mg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Avellana-Adalid, V. Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential. J Neurosci Res. 45, 558-570 (1996).
  2. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
  3. Barres, B. A. Cell death and control of cell survival in the oligodendrocyte lineage. Cell. 70, 31-46 (1992).
  4. Chan, J. R. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43, 183-1891 (2004).
  5. Camara, J. Integrin-mediated axoglial interactions initiate myelination in the central nervous system. J Cell Biol. 185, 699-712 (2009).
  6. Ishibashi, T. Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses. Neuron. 49, 823-832 (2006).
  7. Chen, Y. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat Protoc. 2, 1044-1051 (2007).
  8. Pedraza, C. E. Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors. Glia. 56, 1339-1352 (2008).
  9. Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors. J Neurosci. 12, 1896-1905 (1992).
  10. Greene, L. A. Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons. Dev Biol. 58, 106-113 (1977).

Comments

46 Comments

  1. very nice video and presentation....

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 28, 2011 - 12:44 PM
  2. Nice explanation. I have been carrying out this procedure for some time now and find that it works quite well.

    How many OPCs you generally obtain from a single mouse brain?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 26, 2012 - 4:35 PM
  3. Hi - thanks for your comment, typically I yield about ²00,000 OPCs per mouse brain (on average).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 1:04 AM
  4. Excellent. I am using B6 mice, usually P4-5 (because we also take cerebellar neurons from these same pups). I usually yield between 100-130,000 cells/brain. I see some differences in our protocols (I seed three brains/T75, use trypsin instead of papain, etc.). What steps have you found to dramatically increase your OPC yield post shake-off?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 12:17 PM
  5. The largest factor in OPC yield is the efficiency of your digestion (ie. minimal cell death). In addition, the age of the mice from which you isolate the mixed glial cultures is a factor. I think if you go too far past P², many OPCs will be postmitotic, and therefore limit their proliferation capacity. I usually try to go as young as possible (P0) as this seems to work best. If you absolutely need to use P4-P5, maybe try to culture your monolayers longer than 9 days - try waiting ² weeks prior to shake off. Hope this helps - RO

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 1:06 PM
  6. Thanks for the great info. That is interesting, as many of the protocols for the "DeVellis-method" use different enzymatic preparations (trypsin +/- EDTA, +/- DNAase, papain, etc.). I had basically adapted my rat OPC protocol for mice, but am realizing that they are just not the same. I will trip your papain method and let you know how things pan out. Also, is there a reason you use T²5 flasks instead of combining brains into a T75?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 4:55 PM
  7. No there is no specific reason for using T²5, simply this is what I have always been using. I would imagine combining 3 mice into a T75 flask would roughly be the same thing. Good Luck!

    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 12:00 PM
  8. Hi Ryan, nice video and explanation. Do you do lectin panning to further get rid of microglia or do you find that a 30 min incubation at 37 degrees is enough? Also, how do you know cells are ready to shake? are they always ready at day 9? what do you look for specifically?
    thank you

    Reply
    Posted by: luisa t.
    April 10, 2013 - 12:39 PM
  9. hello...I have gone through this video...very nicely presented...but I have one doubt that if I put the flasks on shaker which only maintains temp and speed but not CO² level, the pH will change...would it not allow the OPCs to survive at all??? and can I use HEPES in medium to solve this problem???
    M willingly waiting for your reply....

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 4, 2012 - 12:35 PM
  10. Thank you for your comment, you are correct in that it will not work without CO² buffering. HEPES buffer will likely not solve this problem either. I'm afraid you will absolutely need to have CO² buffering for this isolation to work.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 11:56 AM
  11. Hi, very INFORMATIVE video, I zalak parikh working on glial cells. In your protocol you are not using any filter after papain digestion but I am facing one problem of Fibroblasts contamination. What could be the possible solution for this problem?
    thank you
    Zalak.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 24, 2012 - 7:59 AM
  12. Hi Zalak, thanks for your comment. What glial cell type are you trying to culture? Oligodendrocytes, astrocytes or microglia? I have never experienced fibroblast contamination.. are you sure they are fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 24, 2012 - 10:47 AM
  13. Hi there. Excellent video, very informative. I was just wondering if you can incubate the flasks in 5% CO² instead of 8% CO²?
    Thanks
    Matt

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 11, 2012 - 12:48 PM
  14. Hi Matt, Actually no, you need to have these at at least 8.5% CO² - otherwise you will have trouble establishing your mixed glial cultures - Good luck

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 11, 2012 - 10:22 PM
  15. Hi Ryan. Very nice video and presentation.
    I have to establish a DRG neuronal culture. Majority of all the papers I've read are using a embryonic source of DRG unlike you using post-natal mouse. What do you think will be the major difference between the cultures of the two??

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 1, 2012 - 12:23 PM
  16. Hi Lipi,
    You're right most papers use embryonic DRGs. The benefit of using post-natal DRGs is that you don't have to sacrifice the mother, and if you use P5-P10 mice, there is no need to use nerve growth factor (in my hands). Embryonic DRG neurons require NGF supplementation to the media for their survival. In terms of the difference between cultures, embryonic dervied ones may have a bit more contaminating cells, since I find they divide pretty quickly. Otherwise I imagine they would be the same as post-natal derived cultures. Good luck!

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    October 1, 2012 - 4:37 PM
  17. Thank you Ryan.

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 3, 2012 - 2:39 AM
  18. Thank you Ryan.

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 3, 2012 - 2:51 AM
  19. Great article Ryan. I had a question for you. Our lab generates mixed glial cell cultures by isolating NPCs from P1 mouse pup brains,expanding the NPCs via neurospheres in the presence of GFs, and then plating the spheres on matrigel for subsequent differentiation without GFs. My main goal in using the neurosphere protocol is to obtain OPCs, but I routinely get only ²0-30% O1+ OPCs following 8 days of differentiation on matrigel. GFAP+ astrocytes seem to dominate the whole culture, with OPCs growing on top of them. I wanted to try to incorporate your protocol into the neurosphere protocol by dissociating the spheres using TrypLE or Accutase, plating them on Poly-D-Lysine, letting the astrocytes grow to confluency while having OPCs proliferate on top, and then use the shaking technique to isolate OPCs. Do you think this is possible? When we perform in vitro studies with the NPCs, we usually plate the neurospheres on matrigel for a day and then trypsinize the cells for seeding into new dishes. Not only do I think the trypsin digest kills many OPCs, but I also remove astrocytes from the matrigel that then contaminate my cultures. Thanks for the help!

    Reply
    Posted by: Brett M.
    November 3, 2012 - 7:37 PM
  20. Hi Brett - To answer your question, yes I think it would be possible to do what you are suggesting. However, it seems to be a pretty roundabout approach. I think the more streamlined approach would be to simply seed your dissociated P1 neural cells onto PLL substrate to generate a monolayer. That way you would avoid having to generate neurospheres (which I imagine takes about 10 days) and then subsequently generating an astrocyte monolayer with the spheres (which would take another 10+ days). In my experience, OPCs don't like trypsin. If you wanted, you could try 0.05% Trypsin instead of 0.²5% and that seems to be more gentle. And if you don't incubate for too long, most astrocytes should remain on the plate. Hope this helps! -Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    November 5, 2012 - 12:14 PM
  21. Ryan, thanks for the help! I tried your protocol and everything appeared to go well. However, one issue I ran into occurred during the overnight shaking step and subsequent differential adhesion assay to isolate a more pure population of OPCs. What I noticed was that after the overnight shaking I had many large oligospheres (maybe 10-²0 cells in size). These spheres did not stick down during the 30 minute plate incubation and I had difficulties trying to dissociate them as you described using the P1000 and P²00 tips. When I took the cells counts and plated the cells onto chamber slides, many smaller clumps remained and stuck down to the matrix. However, the clumps did not flatten out on the gel matrix very well (like neurospheres do) and eventually flaked off after about 5 days of cultures, leaving only sparse population of OPCs. Have you ever encountered this problem? I was thinking of seeding at a higher cells density than what you describe in the protocol.

    Reply
    Posted by: Brett M.
    December 2, 2012 - 10:21 PM
  22. Hi Brett - sounds like you're doing everything right. Normally I see lots of these "oligospheres" as a result of the overnight shaking protocol. However, I find that these are not the majority of OPCs, as there are many single cells and cells in clumps of ²-4. The oligospheres are difficult to dissociate, and due to this, I generally do not go out of my way to try and break them up. In my hands, these spheres spread out very nicely after about ²4hrs on Laminin-² substrate. You can try to seed at higher densities if you like, but the seeding density should be determined based on the experiment you want to conduct. For example, if you want to perform immunocytochemistry, it may not be ideal to have a very dense cell culture. Also, it's possible the clumps aren't super compatible with your matrix substrate - I always use Laminin. I hope this helps :)

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    December 3, 2012 - 11:42 AM
  23. HI Ryan, very informative and nice presentation. I have tried your protocol and everything seem to work fine except at the overnight shaking. There were very few OPCs isolated and it seems there are still many OPCs adhere to the astrocytes. Have you encounter this issue?

    Reply
    Posted by: Esther W.
    December 13, 2012 - 3:25 AM
  24. Hi Esther, Thanks for your comment. How many OPCs are you yielding per mouse? I usually yield on average ²00,000 OPCs per mouse brain, but this is quite variable. At times I have yielded 500,000 or 50,000 per brain, and I'm not sure what accounts for this variability. In any case, you will never dissociate 100% of the OPCs from the monolayer, I've noticed a lot remain stuck. My advice would be to simply give it another shot and see if your yields are a bit higher next time. Hope this helps - RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    December 16, 2012 - 5:35 PM
  25. Thanks Ryan for your advice. My yield is definitely much lower than yours. I will definitely try another round. :)

    Reply
    Posted by: Esther W.
    December 16, 2012 - 8:24 PM
  26. HI Ryan, I face the problem of getting immature OPC instead of mature OPC after 6 days of OL-enriched culture. What is your view?

    Reply
    Posted by: Esther W.
    January 23, 2013 - 2:51 AM
  27. Hi Esther, you should always expect to have some OPCs that don't differentiate during the timecourse. However, the majority of OLs should at least be expressing MAG, if not MBP at DIV6. My guess would be that your media is not exactly correct. Make sure that all the ingredients are at the correct concentration in your 100x OL-supplement stock - especially tri-iodothyronine and L-thyroxine (4mg per 100mL). I hope this helps, let me know if you still have problems.

    Posted by: Ryan O.
    January 23, 2013 - 12:56 PM
  28. Thanks Ryan for replying. I have added tri-iodothyronine only as there is no mentioned of L-thyronine in the 100x OL-supp recipe. Can i still add L-thyronine when the OL-enriched is on DIV5?

    Posted by: Esther W.
    January 23, 2013 - 8:05 PM
  29. Thanks for notifying me of this mistake, I'll notify the editorial team ASAP. Yes you can try to add it on DIV5, but no guarantees this will drive them any farther since they are aleady 5 days in. Give the protocol a second try, and let me know if the lack of differentiation still occurs. -Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    January 24, 2013 - 12:47 AM
  30. Hi Luisa thanks for your comment :) I don't do lectin panning, as I find that incubation on the culture plates is enough to get rid of most of them, but if you're having a problem with microglia that is an additional option. I usually shake on day 9, but I've found you can shake anywhere from 9 to 1² days, but any longer than that you will get less OPCs. Generally if you see a lot of cells on top of the astrocyte monolayer, they are ready to go. However in my experience this dŒsn't really happen before day 9. Hope this helps RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    April 10, 2013 - 2:28 PM
  31. Hi Ryan.Thanks for this protocol. I did exactly what you have described in this protocol, except the shaking step. I did it without CO2, but the caps are tightly sealed, how is it possible that CO2 will effect pH of tightly sealed flask? My yield was very low, besides I had fibroblast contamination as well. I used uncoated flasks as well, because once during the shaking all the layer came off the bottom of the flask, what do you think would be the reason for this?.And in my experience when FBS is used in OPC culture media it made OPC's to differentiate to astrocytes rather then oligodendrocytes.Overall I couldnt replicate this procedure unfortunately and trying to find other methods..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 20, 2014 - 5:33 PM
  32. Hi Aysel - from what you describe in your message, you didn't follow my protocol.

    1) So you didn't shake the flasks? Or you didn't use the same method of shaking?

    2) As far as I know, all standard tissue culture incubators have some level of CO2 buffering (usually 5%). Strictly speaking, if you tighten the cap of your flasks, there will be no gas exchange between the incubator and the flask, if you are using plugged caps. I use vent-capped flasks (0.22um pore), so gas exchange occurs between the flask and the incubator when the caps are tight. To answer your question, CO2 buffering will have little-to-no effect on the pH of the media if you are using tightly-screwed plugged flask caps.

    3) I haven't experienced fibroblast contamination in my cultures, I imagine this would be a dissection issue. The only source of fibroblasts I can imagine would be from the meninges, so be sure to fully remove this prior to dissociation of the cortex. Unless you are confusing fibroblasts for astrocytes. Too many astrocytes is a result of too much agitation at the differential adhesion step.

    4) I have always used coated flasks, in my experience OPCs will not adhere to uncoated surfaces. I am willing to bet you'll get almost no OPCs if you continue to use uncoated flasks. If you want you can try to use other substrates such as PDL, poly-O-ornithine, collagen etc.

    5) I haven't noticed any significant transformation of OPCs into astrocytes in the presence of FBS. I imagine this might occur more frequently in immortalized OPC cell lines. Perhaps that's what you are thinking of.

    I hope this helps, otherwise best of luck in your research.

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 20, 2014 - 8:52 PM
  33. Hi Ryan, thank you ver much for detailed answer. Sorry for my english, i couldnt explain good.
    I did the shaking of course but without putting shaker inside the CO2 incubator, I did shaking at 37 degree incubation only and at 180 rpm. Because the flasks are uncoated(I have used uncoated flasks for rat OPC"s without problem, that is why I tried this way with mouse as well) I hesitated to increase rpm to 240 or so, to prevent astrocyte detachment, and I also think that fibroblast contamination is because of the meninges. Second time I will prevent it.
    It is good to know that I must use coated flasks, I will try again, if you say so.
    Thank you so much, good luck to too..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 21, 2014 - 6:22 AM
  34. Hi Again,
    Alright - I strongly suggest to put the shaker in the incubator for the overnight shake, as I have found this to be a crucial step in maintaining pH balance. The media on your cells should always be a rich red colour (indicative of a balanced pH) all the time. Mouse OPCs are very sensitive to pH, and will die with too much fluctuation. If during your shaking, the media becomes at all purple-ish or yellow-ish, your OPC yield will drastically reduce. I wouldn't be surprised either if this was a contributing factor to the monolayer detachment you experienced previously. There is a significant difference in the in vitro behaviour/viability of mouse OPCs as compared to rat, hence the generation of this protocol. Your best bet is to simply follow this protocol exactly as is.

    Thanks for your comment, and good luck,
    Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 21, 2014 - 12:25 PM
  35. Hi.
    One more question Ryan, about amount of the brains seeded, I was seeding 2 rat brains/ T75 flask , in the mouse case to obtain same amount of cells seeded I was using 6 brains per flask. Would you suggest to use 3-4 instead of six? and if i seed 6 animals should I increase concentration of insulin added to mixed culture media? Overall what would be optimum amount of brains per T75 flask in your opinion? Does it matter to much? Because here you use 1 brainper T25 flask.
    Thanks again..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 26, 2014 - 4:20 PM
  36. Hi Aysel,
    Again, your best bet for success is to follow the protocol exactly as is - T25 flasks are what this method has been optimized for. I suppose T75 flasks have 3 times the surface area, so in theory 3 mice would have to be seeded to a T75 to yield the same cell density. I've never tried this protocol with T75 flasks, and I know that different culture vessels have different impact on growth and survival of OLs.
    Best - RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 27, 2014 - 10:47 AM
  37. Hi Ryan . I want to say that I replicated the procedure exactly as here, and have got very good yield, but I have 1 more question to you, majority of OPCs die in the differentiation media after 6-7 days of incubation. You indicated that it is important not to distrub them until fixation, but how do you do the medium chage, I put 1 ml media first day and did 2/3 media change each 3 days, I seeded all cells to one 24 well format plate, at each time points(3 d, 6 d, 9 d) I transfer the slides to new plate and fix them there and do medium change for rest of the slides. By the way I culture OPCs at 5% CO2, becaue I have only 2 options 5% and 10%, i cant adjust ph of the incubators at this time point. Is it the contributing factor for death of the cells after 4-5 days of incubation?

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    March 19, 2014 - 2:43 PM
  38. Hi Aysel - I'm glad to hear things are looking up -

    1. I don't suggest differentiating the OLs for longer than 6 days. If you're finding they are not differentiating fast enough, you can add 4 mg of L-Thyroxine to the 100X OL-supplement (see the media recipe list above).

    2. It is normal to lose OLs over the time course of differentiation. That being said, you don't want to encourage death by moving the cells or culturing at low pH. You should not be changing the media of the purified OL cultures at any point - they do not require media changes. The protocol also says to culture the OLs at 8.5% CO2. Since you have access to both 5 and 10% CO2 incubators, and 8.5 is closer to 10 than it is to 5, I suggest culturing them at 10%.

    3. Rather than culturing all of your time points in one dish, use 3 dishes (one for 3 days, one for 6 etc). That way, you won't have to disturb your other time points.

    4. Do not remove the coverslips from the wells of your 24 well dish during fixation - simply add concentrated PFA directly into the media and allow to fix for about 15 mins at room temp.

    Sounds like you're almost there, Best of luck - Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    March 19, 2014 - 3:58 PM
  39. Let me write it again to see if I have understood you correct, you say dont do any media change ever, neither at 3 days or 6 days or further? The other things I will try what you suggest, culturing and seeding in different plates at 10% CO2
    I want to thank you a lot for your help and all of the explanations.
    Thanks ..
    Best,
    Aysel

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    March 19, 2014 - 4:22 PM
  40. Thats correct :)
    You're very welcome,

    Ryan

    Posted by: Ryan O.
    March 19, 2014 - 5:49 PM
  41. Hi Ryan,

    Thanks for sharing this protocol, looks really good and will try it out. I have a couple of questions regarding your protocol and was hoping you could shed some light on some problem I am experiencing at the moment.

    With regards to what you have just described, we actually perform a very similar mixed glial culture on P0-P3 rat brains. Our isolation stages are very similar with the exception we use DNAse1 and L-cysteine along with Papain. Upon plating our cell suspensions the flasks are densely populated with microglia on top, then opc's below and then astrocytes. We basically shake off our microglia before doing the overnight shake for the OPC's.

    My question is how do you get rid/ not see any microglia in your mouse cultures? Is it also possible to obtain microglia from your method?

    We are currently experiencing problems with obtaining OPC's from our overnight shake (in rat). The cells look healthy when in culture with the microglia but once the microglia are removed and we perform the steps required to plate the OPC's we have a lot of contaminants in with the cells, almost like long fibrous structures that are stained by trypan blue. We still obtain + 5 million OPC's but the cells do not look healthy and the morphology is not consistent with OPC's. Upon plating these cells they fail to show characteristics of OPCs and a lot die off. I will mention we do not shake in an incubator but in an orbital shaker at 250rpm with the caps sealed tight and parafilm. Have you ever encountered this?

    Many thanks .

    Reply
    Posted by: Graeme I.
    February 9, 2015 - 1:06 PM
  42. Hi Graeme, thanks for your question.
    We do in fact get microglia in our mixed cultures, but we remove them prior to the overnight shake with a slow short shake (as in the rat method). These shaken off microglia are a very pure population, and can be cultured separately if desired.
    With regard to the problems you’re encountering shaking your rat cultures, I can’t say I’ve experienced anything quite like what you’re describing. It almost sounds like your cultures are suffering from contamination (maybe yeast?). We’ve experienced contamination a couple of times, and it resulted in much of the monolayer dissociating from the base of the flask during the overnight shake. If you like, you can send me a pic of the fibrous structures in the hopes that I could recognize what they are (romea077@uottawa.ca).
    We have never had luck shaking flasks in an orbital shaker – we exclusively use tissue culture incubators with vented caps. One risk of using an orbital shaker is they pose a threat for contamination, as they are often used for bacterial cultures.
    I hope this helps and best of luck,
    Ryan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 20, 2015 - 11:12 AM
  43. Hi Ryan,

    Thanks for your reply.

    I tried the protocol and achieved very nice OPC's so everything seems ok there.

    With regards to what I was seeing after my rat OPC shake, I believe it not to be of any contamination but more something coming out of solution in our media. As a test I shook DMEM10% in a T75 flask, 37 degrees, 250rpm overnight. The next day I took an aliquot and looked at it with trypan blue. To my surprise I saw the same fibrous clumps that I was seeing after the OPC shake

    . My DMEM only contains FBS and pen-step so this has to be something in FBS. My most recent shake off I decided to shake off 5 flasks with DMEM 10% and 5 flasks with OPC media (our OPC media contains 2.5ml FBS vs 50ml in DMEM). The next day after following normal protocol I counted the cells from both conditions. The OPC media flasks had almost none of the fibrous clumps whereas the DMEM flasks had alot. I can now partially get round this problem by filtering with 40uM strainer but have you ever heard or seen this kind of thing. We have used several batches if FBS so it cannot be that every batch has precipitated proteins in it but perhaps what were doing is causing precipitation of FBS proteins that are affecting the OPC's?

    Thanks

    Graeme

    Reply
    Posted by: Graeme I.
    March 15, 2015 - 4:16 PM
  44. Hi Ryan,

    Is your FBS from Invitrogen decomplemented ? If so did you buy decomplemented or did you heat it at 56*C and for how long.

    Thanks

    Reply
    Posted by: Ludovic D.
    February 24, 2017 - 10:40 AM
  45. Hi Ludovic,
    I've used FBS that has been heat-inactivated by the manufacturer, and I've also used FBS that I've heat inactivated myself. For the latter, if memory serves, about 30 minutes at roughly 50 degrees C should do the trick (water bath).
    Good luck, Ryan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 26, 2017 - 11:49 AM
  46. Hi Ryan,
    I am wondering if you have any experience with adding Cre Recombinase Adenovirus to the cultures? And if you think a particular day would be best to add it? I was thinking of adding it on D8 (1 day before the full media change) but wasn't sure if adding virus and then shaking the cells would cause too much stress?
    Thanks,
    Megan

    Reply
    Posted by: Megan R.
    April 30, 2018 - 2:39 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics