Author Produced

Post-natal murin Dokular Co-kültürler Myelinating zenginleştirilmiş oligodendrosit Kültürleri ve oligodendrosit / Nöron türetilmesi

Neuroscience
 

Summary

Bu makale, olgun oligodendrosit (EKK) üretmek için ayırt primer kültür fare oligodendrosit öncü hücreler (OPC) zenginleştirilmiş nüfus, elde etmek için yöntemler anlatılmaktadır. Buna ek olarak, bu rapor üretmek için teknikler açıklar fare fare dorsal kök ganglion nöronlar (DRGNs) neurite yatağa fare OPC ekim ortak kültürler myelinating.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues. J. Vis. Exp. (54), e3324, doi:10.3791/3324 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

OL geliştirme altında yatan moleküler mekanizmaları belirleme OL biyoloji bilgimizi ilerletmek için yalnızca kritik değil, Multipl Skleroz (MS) gibi demiyelinizan hastalıkların patogenezinde anlamak için de etkileri vardır. Hücresel gelişimi sık primer hücre kültür modelleri ile çalışılmaktadır. Primer hücre kültürü, in vivo olarak bulunan gereksiz değişkenlerin kontrollü bir ortam sağlayarak, belirli bir hücre tipi değerlendirilmesi kolaylaştırır . Sıçanlarda türetilen OL kültürler OL biyoloji içgörü büyük bir miktar olsa da, fareler OL kültürler kurmayı benzer çabalar büyük engellerden ile karşılandı. Transgenik fare hatları yararlanmak amacıyla kültür fare primer OLS için yöntemler geliştirmek zorunludur.

Neurosphere türev, diferansiyel yapışma arıtma ve 1-3 immunopurification arasında değişen, kemirgen dokusundan OPC çıkarılması için birden çok yöntem tarif edilmiştir. Pek çok yöntem başarı sunarken, en kapsamlı kültür ve / veya pahalı ekipman / reaktifler gerektirir. Bunu aşmak için, başlangıçta McCarthy & de Vellis 2 tarafından açıklanan yöntemi bir adaptasyon fare doku OPC arındırıcı tercih edilir. Bu yöntem, fiziksel neonatal kemirgen korteks türetilen karışık bir glial kültüründen ayıran OPC içerir. Sonuç, bir saflaştırılmış OPC nüfusu OL-zenginleştirilmiş kültür ayrılabilir. Bu yaklaşım, görece kısa bir kültür zaman ve büyüme faktörleri veya immunopanning antikorlar için gereksiz gereksinimi nedeniyle itiraz ediyor.

, Saflaştırılmış bir kültür OL gelişme mekanizmaları keşfetmek bilgilendirici olmasına rağmen, miyelin kılıf oluşumu değerlendiren için en önemli fizyolojik bir ortam sağlamaz. Co-kültür OLS nöron aksonları OL-aracılı miyelinasyonun düzenleyen moleküler temellerinin içgörü ödünç. / OL nöron ko-kültür çalışmaları birçok insan için, dorsal kök ganglion nöronlar (DRGNs) seçim nöron türü olduğu kanıtlanmış. Ekstraksiyon, kirlenmesine neden olan hücreler az miktarda ve yoğun neurite yatak oluşumu kolaylığı nedeniyle OLS ile ko-kültür için idealdir. 4-6 xenocultures myelinating sıçan / fare kullanarak çalışmalar yayınlanmış olsa da, böyle derivasyon için bir yöntem DRGN / OL post-natal fare doku ortak kültürler myelinating tanımlanmıştır değil. Burada etkili beklenen sonuçlar örnekleri ile birlikte, bu tür kültür üretmek için nasıl ayrıntılı yöntemler sunuyoruz. Bu yöntemler OL geliştirme / myelinating fonksiyonu ile ilgili sorulara yanıt için yararlı ve faydalı araçlar sinirbilim alanında.

Protocol

Etik Beyanı

Bu çalışmada kullanılan fareler, Kanada Hayvan Bakım Konseyi (CCAC) yönergeleri doğrultusunda bakım. Ottawa Hayvan Bakımı Komitesi Üniversitesi OGH-119 protokol numarası altında yapılan deneyler için etik kurul onayı alınmıştır.

1. Diseksiyon - OPC ekstraksiyonu için yenidoğan fare korteks

  1. Kurumsal kurallarına göre P0-P2 fare Kurban.
  2. Buz MEM (antibiyotik ücretsiz) içeren bir Petri kabındaki beyin ve yer ayır.
  3. Diseksiyon mikroskobu çanak aktarın.
  4. Sagittally beyin dorsal yüzü bir neşter kullanarak, her korteks (Şekil 1a) en medial kenarı boyunca sığ bir kesi olun. Bu kesi sadece onun kaldırma kolaylaştırmak amacıyla meningeal katmanı üzerinden geçmelidir.
  5. Lateral moda menenjlerde soyulabilir ince uçlu forseps kullanın. Dikkatli bir şekilde yapılırsa, bu katman tek parça halinde çıkarılabilir. Bu adım sırasında, koku ampuller çıkarın.
  6. Beynin ventral taraf-up ile korteks ve ventral diensefalon alanı (Şekil 1b) karşılayan bir derin sagital kesi yapmak.
  7. Yan beyin dorsal doku yanal moda (Şekil 1c, c) medial meraklı orta beyin korteks ayırın. Bu aşamada herhangi bir kalıntı meninksler çıkarın.
  8. Yaklaşık 4 adet her korteks Zar ve yavaşça 15 ml konik tüp 350 mcL MEM başına fare beyin içeren bir transfer. Tüm fareler işlendikten kadar buz üzerinde tüp tutun.
  9. Kalan fareler için 1,1-1,8 adımları tekrarlayın.

2. Karma glial kültürlerin neonatal korteks ve bakım Fototerapisi

Not: baloncuklar hücre süspansiyonu içine giriş aşağıdaki adımları sırasında kaçınılmalıdır.

  1. 3 dakika süreyle 37 ° C su banyosunda taze disseke beyinleri içeren 15 ml konik tüp ekleyin.
  2. Steril doku kültürü kaputu beyinleri aktarın.
  3. Yavaşça küçük parçaları oluşturmak için P1000 pipet ile doğranmış korteks geçmektedir. Hiçbir beyin adet pipet ucu ile süspansiyon düzgün bir şekilde akışını kesintiye uğratmak için yeterince büyük bir pipetleme durdurun.
  4. Başına OPC papain beyin çözüm konik tüp içine 75 mcL ekleyin. OPC papain çözümü 37 önceden ısıtılmış olmalıdır ° C de 20 dakika önce için kullanmak.
  5. 20 dakika süreyle 37 ° C su banyosunda inkübe edin. Yaklaşık her 2 dakika, doku agregasyonunu önlemek için tüp hafifçe çevirin. Bu süre boyunca, her 37 ° C doku kültürü inkübatör poli-L-lisin (PLL) kaplamalı (1 mg / ml) T25 balonuna (fare beyin başına bir balon) ve yerde 5 mL karışık glial kültür ortamı eklemek % 8.5 CO 2.
  6. 20 dakika sonra, steril kaput doku süspansiyonu dönmek ve beyin başına karışık glial kültür ortamı tüpüne 2 mL ekleyin. OPC papain çözüm inaktivasyon izin için 10 dakika oda sıcaklığında bekletin.
  7. 5 ml plastik tüpler içine kısım doku süspansiyon. Tüpler, tüp başına yaklaşık 2.5 mL disseke beyinlerin numarası eşleşmesi gerekir.
  8. Steril bir alev parlatılmış cam Pasteur pipeti kullanarak, her tüp hafifçe doku çiğnemek. Ilk başta yavaş yavaş Karışım ve parçaları ayrıştırmaları kademeli olarak hızını artırmak. Karışım, yaklaşık 10-15 kez bu sayı, ancak sindirim etkinliğini göre değişebilir.

Not: Under-öğütme, aşırı-öğütme hücre canlılığı üzerindeki olumsuz etkisi ise doku yoksul disosiyasyon neden olacaktır. Bu hücre canlılığı ciddi bir etkisi olarak, çözüm kabarcıkları tanıtmak için çok önemlidir.

  1. Bir kez süspansiyon kalan görünür doku kümeleri vardır, 4 mL beyin başına karışık glial kültür ortamı (yani, 4 beyinleri = 16 mL karışık glial kültür ortamı) içeren 50 ml konik tüp transferi .
  2. Kalan 5 ml tüpler için 50 ml konik tüp ve tekrar yavaşça çevirin.
  3. (15 ml tüp başına yaklaşık 6.5 ml) 15 ml konik tüpler içine kısım toplanmış hücre süspansiyonu. 15 ml tüpler disseke beyinlerin sayısını eşleşmesi gerekir.
  4. 5 dakika boyunca 1200 rpm (~ 300 g), tüplerin santrifüjleyin.
  5. Süpernatantı dikkatlice aspire ve her 15 ml konik tüp için 1 ml sıcak karışık glial kültür ortamı eklemek.
  6. Yavaş yavaş baloncuklar tanıtmak için dikkatli, P1000 bir pipet ile pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Toplam 6 mL kültür ortamı volume rendering hücre süspansiyonu, her tüpten bir ön dengelenmiş PLL kaplı T25 balon ekleyin.
  7. 3-4 saat için bir doku kültürü inkübatör şişeler hücreleri PLL substrat eklemek için izin yerleştirin. Medya pipetleme ve şişeler taze karışık glial kültür ortamı 6 ml ekleyerek tam bir medya değişiklik yapın. Bu adım çok enkaz kaldırıröğütme yol açtığı ve kültür canlılığı arttırır. Co-kültür DRGN / OL istenirse, bu protokolün Bölüm 3'e bakın.
  8. Kültür 3 gün sonra, 4 mL medya kaldırılması, ve 4 mL taze karışık glial kültür ortamı ile değiştirilmesi 2 / 3 medya değişim gerçekleştirmek. Bu noktada, bir şişe baz astrosit tek tabaka oluşturan olmalıdır.
  9. 6. Gün, 2 / 3 medya son bir konsantrasyon ile 5 mg / ml insülin şişeler değiştirmek ve ek gerçekleştirin. Bu noktada, bir astrosit tek tabaka üstüne OPC prolifere olacağı açıkça görünür olmalıdır.

3. DRGN izolasyon

Not: ortak kültürler DRGNs / OL DRGNs karışık glial kültür nesilden gün kurulmuş olmalıdır üretmek için kullanılır. Her iki kültür tipleri bağımsız olarak büyüdü ve 9-10 gün sonra birleştirilir.

  1. Kurban P5-P10 kurumsal kurallarına göre fare.
  2. Omurga Özü, ve temiz bir Petri kabı transfer.
  3. Dorsal kök gangliyon (DRG) diseksiyonu kolaylığı gibi, omurga (Şekil 1d, d ') mümkün olduğunca fazla kas ve kemik gibi uzak kesin.
  4. Yeni bir Petri kabı ventral taraf-up için kesilmiş omurga aktarın. Diseksiyon makas kullanma ve kaudal başlangıç, uzunlamasına bir moda omurga üzerinden mediale kesti.
  5. Forseps, iki çift kullanarak, hafifçe omurilik maruz omuriliğe açmak gözetlemek.
  6. DRG'ler altında bulunan ve spinal kord lateral olabilir. Ganglia (Şekil 1e) zarar kaçınırken, ince uçlu forseps kullanarak hafifçe DRG'ler kaldırmak.
  7. Çıkarılan DRG'ler yeni bir Petri kabındaki buz Hank tamponlu tuz solüsyonu (HBSS, antibiyotik-free) aktarın. Disektör fare başına 40 DRG'ler (Şekil 1f) ayıklamak amacı olmalıdır.
  8. DRG'ler ayıklandıktan sonra, kültür kirlenmesine neden olan hücreleri giriş (glial hücreler, fibroblastlar) en aza indirmek için herhangi bir aşırı uzun kökleri (Şekil 1g, g ') DRG'ler kırpın.
  9. DRG'ler 500 mcL buz HBSS içeren 1.5 ml santrifüj tüpüne aktarın.
  10. 4 5 dakika 1200 rpm (~ 300 g) ° C pelet DRG'ler santrifüjleyin.
  11. Steril doku kültürü kaputu santrifüj tüplerine transferi ve tüpler HBSS kaldırmak.
  12. Önceden ısıtılmış 500 mcL ekleyin (20 dakika 37 ° C) DRG papain çözümü, tüpler ve 10 dakika süreyle 37 ° C su banyosunda inkübe edin. Tüpler doku agregasyonunu önlemek için her 2 dakikada bir ters çevirin.
  13. 3.10 adımı tekrarlayın.
  14. DRG papain çözüm çıkarın ve kollajenaz bir çözüm önceden ısıtılmış (37 ° C'de 20 dakika) 500 mcL ekleyin. 10 dakika, 2 dakika tersini her 37 ° C'lik su banyosunda inkübe edin.
  15. 3.10 adımı tekrarlayın.
  16. Süpernatantı ve DRGN medya 1 ml ekleyin. Tüpü birkaç kez ters çevirin.
  17. 3.10 adımı tekrarlayın.
  18. 3.16 adımı tekrarlayın.
  19. Kat HBSS birkaç kez% 0.25 BSA bir çözüm pipetleme (BSA), sığır serum albümini ile steril bir alev parlatılmış cam Pasteur pipeti. BSA çözümü ile kaplama, cam pipet duvarlarına yapışmış DRG'ler önleyecektir.
  20. Ilk bakışta BSA ile kaplanmış pipet yardımıyla hafifçe DRG'ler Karışım ve artan yoğunluğu ile kümeleri dissociating başlar kez. Karışım, yaklaşık 10-15 kez bu sayı, ancak sindirim derecesine bağlıdır ve tüp başına DRG'ler sayısı.
  21. Disosiasyon elde sonra, 7 ml DRGN medya içeren steril bir Petri kabı içine filtre 50 mikron ile süspansiyon geçmektedir. Filtrasyon, bu adımı çok önemli olmasa da hücre süspansiyonu enkaz ortadan kaldıracaktır.
  22. % 8.5 CO 2 Petri kabı, yaklaşık 1.25 saat inkübe edin .
  23. Bu inkübasyon süresi boyunca 24-iyi bir çanak LN2 (PBS içinde 10 mcg / ml) ile Kat birkaç 12 mm lamelleri.
  24. Inkübasyon bittiğinde altında Petri kabı, parlak bir alan gözlemliyoruz. DRGNs geniş gövdeli, faz karanlık hücreler olarak tanımlanır. Herhangi bir yapıştırılır DRGNs kaldırmak için hafifçe Swirl Petri kabı.

Not: Birçok kirlenmesine neden olan hücreleri güçlü, böylece DRGNs hücre süspansiyonu zenginleştirici, Petri kabı yapıştırılır olacak.

  1. 15 ml konik tüp hücre süspansiyonu aktarın. Yavaşça herhangi bir kalıntı DRGNs toplamak için DRGN medya 4 mL çanak durulayın. Konik tüp için ek 4 mL aktarın.
  2. 1200 rpm (~ 300 g) 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
  3. Süpernatant aspire edin ve taze DRGN medya 500 mcL pelet tekrar süspansiyon.
  4. Hemasitometre kullanarak vermiştir DRGNs sayısını hesaplayın. DRGNs ve diğer hücre tipleri sadece saymak emin olun. DRGNs büyük küresel hücre organları tarafından tespit edilebilir.
  5. Bir gecede% 8.5 CO 2 DRGN medya 1 mL her LN2 kaplı lamel ve 37 ° C doku kültürü inkübatör yer Seed 30,000-50,000 DRGNs.
  6. Ertesi sabah, DRGN yerini tam bir ortam değişikliği yapılması(eksi CNTF)% 1 Kalem / Strep ve 10 mcM FuDR son bir konsantrasyon ile OL medya ile medya.
  7. Gün 3 ve 5, 3 / 4 Adım 3.30 olarak aynı medya ortamı değiştirmek gerçekleştirin.
  8. Gün 7, OL medya (eksi CNTF, Pen / Strep, FuDR) ile tam bir medya değişim gerçekleştirmek.
  9. 9. gününde, DRGNs geniş bir neurite yatak oluşturulur ve OPC ile birlikte kültürlü olmaya hazır olmalıdır.

4. OL-zenginleştirilmiş kültür veya DRGN / OL ortak kültürler kurulması için karışık glial kültürlerden gelen OPC saflaştırılması

  1. Karışık glial kültür 9. gününde,% 5 CO 2 doku kültürü inkübatör orbital çalkalayıcı şişeler aktarın. Orbital çalkalayıcı üretilen herhangi bir ısı karışık glial kültürlerin olumsuz etkilemesini önlemek için, boş T25 şişeler şişeler üstüne yerleştirin. Kültürlerin, 1 saat süreyle bu yeni inkübatör gelmesini sağlayın.
  2. Matara dengelenmiş sonra, şişeler için 50 rpm'de 45 dakika sallayın. Bu titremesinin amacı, tek tabaka herhangi bir gevşek yapışık kirlenmesine neden olan hücreler ortadan kaldırmaktır.
  3. Bir doku kültürü kaputu hücreleri hareket ettirin ve şişeler tüm medya kaldırmak. 4 mL 5 mg / ml insülin ile desteklenmiş taze karışık glial kültür ortamı değiştirin.
  4. Şişeler geri çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve yaklaşık 3 saat boyunca gelmesini sağlayınız.
  5. Matara dengelenmiş sonra, orbital çalkalayıcı güvenle tutturmak ve 220 rpm (gece) yaklaşık 16 saat şişeler sallamak.
  6. Ertesi sabah, OLS DRGNs olmaması (yani, OL-zenginleştirilmiş kültür), LN2 (PBS içinde 10 mcg / ml) 1 saat ile birkaç kat steril 12 mm lamelleri yetiştirilen isteniyorsa. 24-iyi yemekleri lamelleri Transferi, bir OL medya yıkama tarafından takip PBS ile yıkayın. Her kuyuya OL medya 1 ml ekleyin ve% 8.5 CO 2 dengeye.
  7. % 5 az 10 cm doku kültürü yemekleri 30 dakika dengelenmesi için 2 CO. Bir çanak her 2 şişeler için gerekli olacaktır. Bu askıya OPC ayırıcı yapışma zenginleştirme için kullanılır.
  8. 30 dakika dengeleme süre geçtikten sonra, bulaşıkları sarsılmış şişeler medya transfer. Her çanak 10 cm çanak başına hücre süspansiyonu yaklaşık 8 ml eşit, 2 şişeler medya almak gerekir.
  9. Yemekler 15 dakika nazik bir dürtme sağlarken,% 5 CO 2 30 dakika inkübe edin. Bu dürtmek OPC 10 cm çanak yapışmasını önlemeye yardımcı olacaktır.
  10. Inkübasyon tamamlandıktan sonra, parlak bir alan altında bulaşıkları inceleyin. OPC genellikle 3-5 hücreleri küçük hücre kümeleri olarak tespit edildi ama bazen neurospheres benzeyen büyük bir araya toplanırlar. Olmayan birçok OL soy hücrelerin plaka tabanına sıkıca uyulmalıdır. Yavaşça girdap plakaları herhangi bir gevşek yapıştırılır OPC ayırmak ve 15 ml konik bir tüp içine her plaka hücre süspansiyonu transfer.
  11. 5 dakika için 1200 rpm (~ 300 g) Santrifüj.
  12. P200 pipet ile tabanda takip P1000 pipet ucu, 1 mL OL medya pelletini tekrar.
  13. Hemasitometre kullanarak hücrelerin güvenin.
  14. Zenginleştirilmiş OL kültürleri, tohum 25.000 - 50.000 OPC son hacmi 1 ml OL medya her 12 mm LN2 kaplı lamel.
  15. DRGN ortak kültürler / OL bölümünden DRGNs tam OL medya (eksi CNTF) değişimi gerçekleştirmek için [3] ve OPC zenginleştirilmiş hücre süspansiyonu 50.000 hücreler yavaşça ekleyin. OPC eklenmesi sırasında DRGN neurite yatak bozmayacak özen gösterin.
  16. Yeri 37 ° C inkübatör kültürler ve% 8.5 CO 2 fiksasyonu kadar kaldırarak önlemek. Murin OPC pH değişiklikleri ve inkübatör çıkarıldıktan duyarlı OL medya pH değiştirecektir. Ayrıca, hücre kültürleri çevresindeki boş kuyu dH 2 O Ayrıca kültür ortamı buharlaşmasını önlemek, böylece OL medya içinde konsantrasyonları çözünenlerin dalgalanmaları en aza indirmek. Bu, OPC için daha tutarlı bir ortam sağlayacaktır.

5. Immünofloresan mikroskopi için kültürler İşleme

  1. -20 ° C'de 15 dakika süreyle oda sıcaklığında 10 dakika, ya da% 3 paraformaldehid için% 100 metanol ile kültürler sabitleyin.
  2. Lamelleri Permeabilize% 0.1 Triton X-100 10 dakika ile 1 saat,% 10 keçi serum fosfat tamponlu salin (PBS) ve blok ile yıkayın.
  3. 4 gece çözümü engelleme seyreltilmiş primer antikorlar ile inkübe lamelleri ° C
  4. PBS ile lamelleri 3 kere yıkayın ve 45 dakika için çözüm engelleme seyreltilmiş Alexa-Florlu konjuge sekonder antikor (Invitrogen) ile inkübe edin.
  5. 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Counterstain ve lamelleri PBS ile birkaç kez yıkayın.
  6. DAKO floresan Mount lamelleri orta montaj.
  7. Slaytlar immünofloresan mikroskobu ile analiz edin. Bu protokol, slaytlar, Zeiss Axiovert 200M ters floresan ya ile analiz edildimikroskop veya konfokal mikroskop tarama Zeiss LSM 510 META lazer.

6. OL-zenginleştirilmiş kültürlerden gelen tüm hücre proteini çıkarma

  1. 3 dakika buz, kuvöz ve serin 24-kuyu kültürler çıkarın.
  2. Medya dikkatlice çıkarın ve 10-20 mcL lizis tamponu (0.1% pepstatin 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl,% 0.1 SDS,% 0.5 sodyum deoksikolatın,% 1 Triton X-100, aprotinin, PMSF, her kuyuya leupeptin, sodyum orthovanadate) (numune başına 8 kuyu en az tavsiye edilir).
  3. Geniş çaplı bir P1000 pipet kullanarak kuyular Pençe ve 1.5 ml santrifüj tüpüne lizat aktarmak.
  4. 30 ½ göstergesi şırınga ile yaklaşık 15 kez ve 30 dakika süreyle buz soğuk lizat iletin.
  5. 15 dakika 4 ° C için 14.000 rpm (~ 20.000 g) Santrifüj tüpleri
  6. Yeni santrifüj tüplerine ve mağaza supernatant transfer -80 ° C

7. Zenginleştirilmiş-OL kültür protein SDS-PAGE analizi

  1. Standart% 12 poli-akrilamid jeller SDS-PAGE ile tampon azaltmada örnek başına 30 mg protein giderin.
  2. PVDF membranlar üzerine yarı-kuru transfer jeller.
  3. 1 saat süreyle% 5 Blok membranlar TBST süt tozu yağsız (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl,% 0.1 Tween-20).
  4. Membranlar, 1 saat süreyle çözüm bloke seyreltilmiş primer antikorlar ile inkübe edin.
  5. 10 dakika için TBST membranları 3 kez yıkayın.
  6. Membranlar çözümü engelleme 45 dakika için HRP-konjuge sekonder antikor ile inkübe edin.
  7. TBST ile membranlar birkaç kez yıkayın ve 5 dakika boyunca Amersham ECL Plus western blot tespit reaktifi (GE Healthcare) ile inkübe edin.
  8. Standart bilimsel görüntüleme film ile protein bantları algılar.

8. Temsilcisi Sonuçlar:

Bu protokol, OPC astrosit karışık bir glial kültürü içinde bir tek tabaka genişletilmiştir. Bu karışık glial kültür P0-P2 yenidoğan fare korteks türetilmiştir. In vitro (div1) 1. gün, karışık glial kültürü, faz kontrast mikroskobu (Şekil 2a) görüldüğü gibi değişik morfolojileri ile hücreler içerir . DIV3, balonun tabanındaki bir astrosit tek tabaka oluşturacak şekilde başlar ve DIV8 az OPC tek tabaka yüzeyinde açıkça gözlenebilir. DIV9, prolifere OPC gecede yüksek hızda orbital sallayarak arındırılmalıdır yeterli yoğunluk ulaşmıştır. Arınma süreci tamamlandıktan sonra, sonuç bir OPC-zenginleştirilmiş hücre popülasyonu. Div1 sonrası arıtma, OPC birkaç süreçler (Şekil 2b) uzanan, basit morfoloji var. DIV3 yazılan arıtma, hücreler olgunlaşmamış EKK'nın anımsatan süreçlerin karmaşık bir ağda, genişletmiştir. DIV6 yazılan arıtma, arıtılmış OLS basık ve broşür gibi membran yapılar yansıtılan var. Bu morfolojik gelişimi EKK'nın in vitro olgunlaşma tipik .

İmmünofloresan mikroskopi saflaştırılmış hücreleri OL-soyundan (Şekil 3a) gösterir. Tohumlu başlangıçta ifade kondroitin sülfat proteoglikan (NG2) OPC, üç gün tohumlama (Şekil 3b) içinde myelin ilişkili glikoprotein (MAG) pozitif olgunlaşmamış OLS dönüşebilir. DIV6 anda birçok OLS ifade miyelin bazik protein (MBP) ve sahip tipik olgun OL morfolojisi. Yüzde OL-lineage hücreleri OL zenginleştirilmiş kültürleri (Şekil 3c) saflığını belirlemek için farklı zaman noktalarında ölçüldü. Div1 yazılan arıtma, kültürler 50 ±% 14 NG2 + ve OPC, hiçbir MAG + ve veya MBP + Ve OLS. Bu saflaştırılmış OL-lineage hücreleri farklılaşmış OLS ihmal numaraları ile, ekim zamanında habercisi aşamasında gösterir. DIV3 bazı habercisi fenotip korumak ve NG2 kalırken, birçok OLS MAG + Ve hücreleri (24 ±% 5.9) ayrılabilir + (13 ±% 8.0). DIV3, MAG + Ve hücreleri (3.2% 1.2) küçük bir oranda da MBP ifade. DIV6, EKK'nın 20 ±% 5.9 MAG + 12 ±% 7.3 NG2 + ve OPC olarak devam Ve iken. Buna ek olarak, kültür hücreleri içinde 21 ±% 9.3 MBP + Ve bu kez noktada OLS. SDS-PAGE analizi, daha ölümcül (Şekil 3d olgun OLS ayırt etmek için kültürü içinde OPC yeteneğini gösteren 2'3'-siklik nükleotidin 3'-fosfodiesteraz (CNP) ve 6 günlük kültür dönemi boyunca MBP aşamalı ifade .) Olursak, bu veriler OPC OL olgunlaşma çalışma için uygun bir OL-zenginleştirilmiş kültür sistemi üreten bir araç olarak bu yöntem kurar.

Bu protokol, fare sadece doku kaynakları kullanarak DRGN / OL ortak kültürler kurmak için yöntemler de açıklamaktadır. Ancak, ortak kültür üretmek amacıyla, DRGNs ilk kez tek başına yeterli bir neurite ağ oluşturmak için kültür olmalıdır. Bu post-natal fare nöron kültürleri kirlenmesine neden olan fibroblastlar ve gl yayılması önlemek için 10 mcM FuDR takviyesi ile düşük serum medyada 9 gün için yetiştirilen ial hücreleri. In vitro 9 gün boyunca yoğun bir neurite yatak (Şekil 4a), izole DRGNs üretir. Bu neurite yatak nöronal belirteçlerinin nörofilaman 200 (NF) ve Tuj1 (Şekil 4b) immünopozitif. Bu noktada, saflaştırılmış OPC neurite yatak eklenebilir ve ortak kültürler myelinating üretmek için ek bir 6 gün kültüre.

Ko-kültür DRGN / OL, birçok MBP + Ve OLS NF + ve DRGN neurites (Şekil 5a) arasında gözlenen olabilir DIV6 anda. Daha yakından bir inceleme üzerine, EKK, onları sık sık bir MBP + ve membran (Şekil 5b, c) ensheathing, çok sayıda DRGN neurites ile temas kurmaya kanıtlandığı.

Şekil 1
Şekil 1. Yenidoğan fare korteks ve DRG izolasyon belirli yönlerini Diseksiyon mikroskobu görüntüleri. (A) taze çıkarılan yenidoğan fare beyin Dorsal görünümü. Noktalı çizgiler kesiler meningeal tabakasının kaldırılmasını kolaylaştırmak için yapılmış olmalıdır alanı belirtir, (b) Ventral görüntüsü, beynin korteks ventral diensefalon karşılayan noktalı çizgiler alanı belirtir . Korteks izolasyonu yardım etmek için noktalı çizgiler boyunca derin kesiler yapılabilir gerekir. Beynin geri kalanı uzak korteks gözetlemek nasıl Görsel tasviri (c-c ') (d) taze izole P5-P10 fare omurga aşırı kas ve kemik (d) kırparak önce omuriliğe içinde DRG'ler (e) Yer ve (f) bir fare izole edilmelidir DRG'ler yaklaşık sayısı (g) DRG gerektiren uzun köklere sahip enzimatik sindirim önce kırparak. Noktalı çizgi kökler kesilmiş olmalı bölgede gösterir. Yazılan kök kırpma DRG (g ').

Şekil 2
Şekil 2. OPC, glial karışık bir kültürün içinde genişletilmiş, saflaştırılmış ve daha sonra bir OL-zenginleştirilmiş kültür olarak farklılaşmış . (A), karışık glial kültürlerin farklı gelişim aşamalarında Faz kontrastlı görüntüler . Div1 birkaç basık hücreleri, hücreler yuvarlak görünür. Karışık glial kültür Tabakalaşma astrositler OPC prolifere edildiği termos, tabanı düzgün bir tek tabaka oluşturur DIV3 başlar. Birçok OPC DIV8 astrosit tek tabaka yüzeyine yapıştırılır (oklar) görülmektedir (b) karışık glial kültürü arınmış, div1 OPC sadece birkaç süreçleri genişletmiştir. DIV3, hücre ara-aşamalı EKK anımsatan birçok süreçleri, genişletmiştir. DIV6, basık OLS (yıldız) (kesikli çizgi) membranöz yaprak görünür. Ölçek barlar, 50 mm.

Şekil 3
Şekil 3. OL-zenginleştirilmiş kültür Karakterizasyonu. (A) farklı gelişim aşamalarında izole OLS Konfokal görüntüler. NG2 + MAG + Ve OLS birden fazla arborous süreçleri sahip ise ve OPC, basit morfoloji var . MBP + Ve OLS membranöz miyelin gibi yaprak genişletilmiş. Ölçeği bar, 50 mikron (b) Saf OL-lineage hücreleri OPC olarak köken ve 6 DIV içinde MAG, MBP + ve + Ve OLS farklılaşırlar. Hiçbiri MAG + ve veya MBP + Ve iken div1, tüm OPC, NG2 + ve. DIV3, MAG + ve birkaç MBP + Ve OLS artık ortadadır. EKK'nın çoğunluğu kalan birkaç NG2 + ve OPC ile, MAG ve MBP + ve DIV6. Ölçeği bar, 100 mikron (c) Ortalama değerler ± SD DIV 6 farklı gelişim aşamalarında yüzde OL-lineage hücreleri. Div1, tüm OL-lineage hücreleri NG2 + 50 Ve, muhasebe ±% 14 toplam hücre kültürü içinde. DIV3 ve DIV6, OL-soyundan hücrelerin sırasıyla 36 ± 6.8 ve% 32 ±% 8.4, toplam hücre, NG2 arasında değişen oranlarda oluşan + ve MAG + ve MBP + Ve OLS. (D) SDS-PAGE ile yapıldı 6 SAYI kültür dönemi boyunca kademeli ifade OL-belirteçlerinin CNP ve MBP gösteren zenginleştirilmiş OL kültürler elde edilen protein.

Şekil 4
Şekil 4. DRGN kültür öncesi OPC tohumlama Karakterizasyonu. (A) ön-OPC tohumlama 9 SAYI kültür dönemi üzerinde Faz DRGNs kontrastlı görüntüler. DRGNs birkaç süreçleri ile büyük gövdeli hücreleri gibi kaynaklanan ve giderek daha karmaşık neurite ağ üretirler. Ölçek çubuğu, 100 mikron (b), DIV9 (pre-OPC tohumlama) sabit ve nöron spesifik belirteçler Tuj1 ve NF200 lekeli DRGN kültürlerin Konfokal görüntüler . DRGNs OPC DRGN / OL ortak kültürler myelinating numaralı seribaşı olabilir bunun üzerine bir neurite ağ üretmişlerdir. Ölçeği bar, 50 mm.

ent "> Şekil 5
Şekil 5. EKK MBP DRGN neurites + ve membran OL-aracılı sarma DRGNs sonucu ile birlikte kültüre. (A), DIV6 DRGN / OL ko-kültür, montaj 4-alan konfokal görüntü . Birçok MBP + Ve OLS altta yatan DRGN neurite yatak ile etkileşim görülebilir. Ölçeği bar, 100 mikron (b) MBP büyütülmüş konfokal görünümü + çoklu DRGN neurites sarma ve OLS. Ölçeği bar, 50 mikron (c) bölge Dijital büyütme (b) DRGN neurite OL zarı ile sarılmış olduğu belirtilir. Ölçeği bar, 25 mm.

Discussion

Bu rapor, kültürleri ya da OL-zenginleştirilmiş DRGN / OL ortak kültürler farklılaşma fare OPC izole etmek için bir yöntem açıklanır. Yalnız kültür, OPC MBP içine ayırt + Ve EKK, miyelin benzeri membranöz levha üretim. Neurite yatak DRGN eklendiği zaman, OLS MBP DRGN neurites sarmak + ve membran. Bu model, OL-aracılı aksonal ensheathment yöneten karmaşık temellerinin araştırılması yarar sağlar.

Büyük bir değer olsa da, bu tür kültürlerin kurulması, teknik olarak çok zordur. Özellikle zorlu yönlerini etkili doku sindirim / disosiasyon, dengeli bir kültür ortamı pH bakım ve DRGN medya değişiklikleri içerir. Sindirim uzunluğu, doku miktarı sindirilir ve öğütme miktarı doku ayrılma etkinliği ve sonuçta etkiler olduğunu göz önünde bulundurmak önemlidir. Ayrışmış sinir sistemi dokularında düşük hücresel verimi elde etmek için deneyimli araştırmacılar için alışılmadık bir durum değildir. Buna ek olarak, fare OPC, özellikle alkali koşullar altında, kültür ortamı pH değişikliklerine duyarlı olma eğilimindedirler. % 8.5 CO 2 kültürlerin bakım OPC temel üzerinde hafif asidik koşullarda daha iyi tolere görünen bu yana, bu önlemek için amaçlamaktadır. Ancak, medya değişiklikleri, beslenme DRGNs ile ilgili olarak, nöronlar ile kurutun olarak hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilir olmalıdır gelişmekte neurite yatak bozmayacak gibi hafif olmalıdır. Ani medya değişiklikleri yüzey neurite yatak, ve lamel tam ayrılma olası sonuç yerinden olabilir.

Bu model sisteminin potansiyel liyakat, teknik açıdan zorlu doğa büyük ölçüde düşer. Bu sistemin bir avantajı, embriyonik doku hasat üreme kadın feda etmeye gerek engellemeyi, hücre kültürü derivasyon için post-natal farelerin kullanılması. Diğer bir avantajı OPC genişlemesi için büyüme faktörleri için gereğinin olmaması (GDS). Karışık glial kültürler astrosit türetilen trofik faktörlerin varlığı nedeniyle muhtemelen OPC yayılmasını destekleyen bir ortam sağlar. Türetme yoluyla neurospheres 7,8 gibi diğer yöntemler, temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF), epidermal büyüme faktörü (EGF) ve OPC genişleme için trombosit kökenli büyüme faktörü (PDGF) gibi GF'lerin mitojenik özellikleri güveniyor. Benzer şekilde, postnatal (P5-10) DRGNs için fareler kullanarak, sinir büyüme faktörü (NGF), embriyonik DRGNs 9, 10, in vitro hayatta kalmak için gerekli bir nörotrofik faktör ile kültür ortamı tamamlayan gereği önler . Ilgi DRGNs 4 ile kültüre EKK'nın myelinating kapasitesini olumsuz etkiler olarak NGF kullanmaktan kaçının. Kullanımı kaçınmak GF-desteklenmiş büyük ölçekte kullanılan bu reaktifler pahalı gibi medya da, ekonomik faydaları vardır.

Belki de bu kültürün modelin en önemli yararı, bu nedenle, transgenik fare hatları çok çeşitli OPC ve DRGNs elde etmek için fırsatlar sağlayarak, sadece fare dokuları türevidir. Bu her iki DRGN ve / veya miyelinasyonun yöneten OPC-spesifik özellikleri çalışma için izin verir. Bu aksonlar OL-aracılı miyelinasyonun düzenleyen reseptör / ligand etkileşimleri nedenlerine açıklık için özellikle önemli olacaktır. Bu teknikte, miyelinasyonun altında yatan moleküler ipuçları anlamaya yönelik uygulamaları nedeniyle nörolojik araştırma açısından büyük bir değer taşımaktadır.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu proje, Kanada Multipl Skleroz Derneği RKRWO bir hibe ile finanse edildi Kanada Multipl Skleroz Derneği Bursu bir alıcı. SDR, Kanada ve Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri Multipl Skleroz Derneği Doktora Sonrası Araştırma Bursu bir alıcı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Multicell 319-005-CL
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Invitrogen 14170-112
Minimum Essential Media (MEM) GIBCO, by Life Technologies 12360-038
Fetal Bovine Serum (FBS) GIBCO, by Life Technologies 10091-148
Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) GIBCO, by Life Technologies 15140-122
GlutaMAX Invitrogen 35050-061
Poly-l-lysine Sigma-Aldrich P2636
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503
Human merosin purified protein (LN2) EMD Millipore CC085
Recombinant rat ciliary neurotrophic factor (CNTF) PeproTech Inc 450-50
L-thyroxine Biochemika 89430
Holo-transferrin Sigma-Aldrich T0665
B27 supplement GIBCO, by Life Technologies 0080085-SA
Bovine insulin Sigma-Aldrich I6634
3,3',5-Triiodo-L-thyronine Sigma-Aldrich I6634
Progesterone Sigma-Aldrich P8783
Putrescine Sigma-Aldrich P7505
Sodium Selenite Sigma-Aldrich S5261
5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FuDR) Sigma-Aldrich F0503
Papain solution Worthington Biochemical LS003126
DNaseI Roche Group 1010159001
L-cysteine Sigma-Aldrich C7352
24-well tissue culture dishes Cellstar 662-160
T25-tissue culture flasks with vent cap Corning 430639
10 cm tissue culture dishes Corning 430167
10 cm petri dish Fisher Scientific 0875713
Collagenase A Roche Group 103578
CellTrics 50 μm filter (optional) PARTEC 04-004-2327
Myelin Basic Protein (MBP) Antibody AbD Serotec MCA409S
NG2 antibody EMD Millipore AB5320
Myelin-Associated Glycoprotein (MAG) antibody EMD Millipore MAB1567
2',3'-Cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNP) antibody Covance SMI-91R-100
Actin pan Ab-5 antibody Fitzgerald 10R-A106AX
Neurofilament-200 (NF) antibody Sigma-Aldrich N4142
Tubulin beta-3 chain (Tuj1) antibody EMD Millipore MAB5544
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11008
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A21422
Alexa Fluor 647 goat anti-rat (IgG) (H+L) secondary antibody Invitrogen A21247
Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody Bio-Rad 170-6516
Goat anti-rat IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-2065
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542

Media Recipes

100X OL-Supplement*

IngredientAmount to add
DMEM100 mL
BSA1.02 g
Progesterone0.6 mg
Putrescine161 mg
Sodium Selenite0.05 mg
3,3',5-Triiodo-L-thyronine4 mg

*Store at -80 °C in 250 μL aliquots

OL media

IngredientAmount to add
DMEM23.75 mL
100X OL-Supplement250 μL
Bovine insulin (from 1 mg/mL stock)125 μL
GlutaMAX250 μL
Holo-transferrin (from 33 mg/mL stock)37.5 μL
B27 Supplement500 μL
FBS125 μL
CNTF (from 50 ng/μL stock)25 μL

Mixed glial culture media (made up in DMEM)

IngredientFinal concentration
FBS10%
Pen/Strep (0.33% from stock)33 units/mL Penicillin and 33 μg/mL Streptomycin
GlutaMAX1%

DRGN media (made up in DMEM)

IngredientFinal concentration
FBS10%
Pen/Strep (1% from stock)100 units/mL Penicillin and 100 μg/mL Streptomycin

Digestion Solution Recipes:

OPC papain solution (made up in MEM)

IngredientFinal concentration
Papain solution1.54 mg/mL
L-cysteine360 μg/mL
DNaseI60 μg/mL

DRG papain solution (made up in HBSS)

IngredientFinal concentration
Papain1.54 mg/mL
L-cysteine360 μg/mL

DRG Collagenase A solution (made up in HBSS)

IngredientFinal concentration
Collagenase A4 mg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Avellana-Adalid, V. Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential. J Neurosci Res. 45, 558-570 (1996).
  2. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
  3. Barres, B. A. Cell death and control of cell survival in the oligodendrocyte lineage. Cell. 70, 31-46 (1992).
  4. Chan, J. R. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43, 183-1891 (2004).
  5. Camara, J. Integrin-mediated axoglial interactions initiate myelination in the central nervous system. J Cell Biol. 185, 699-712 (2009).
  6. Ishibashi, T. Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses. Neuron. 49, 823-832 (2006).
  7. Chen, Y. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat Protoc. 2, 1044-1051 (2007).
  8. Pedraza, C. E. Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors. Glia. 56, 1339-1352 (2008).
  9. Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors. J Neurosci. 12, 1896-1905 (1992).
  10. Greene, L. A. Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons. Dev Biol. 58, 106-113 (1977).

Comments

46 Comments

  1. very nice video and presentation....

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 28, 2011 - 12:44 PM
  2. Nice explanation. I have been carrying out this procedure for some time now and find that it works quite well.

    How many OPCs you generally obtain from a single mouse brain?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 26, 2012 - 4:35 PM
  3. Hi - thanks for your comment, typically I yield about ²00,000 OPCs per mouse brain (on average).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 1:04 AM
  4. Excellent. I am using B6 mice, usually P4-5 (because we also take cerebellar neurons from these same pups). I usually yield between 100-130,000 cells/brain. I see some differences in our protocols (I seed three brains/T75, use trypsin instead of papain, etc.). What steps have you found to dramatically increase your OPC yield post shake-off?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 12:17 PM
  5. The largest factor in OPC yield is the efficiency of your digestion (ie. minimal cell death). In addition, the age of the mice from which you isolate the mixed glial cultures is a factor. I think if you go too far past P², many OPCs will be postmitotic, and therefore limit their proliferation capacity. I usually try to go as young as possible (P0) as this seems to work best. If you absolutely need to use P4-P5, maybe try to culture your monolayers longer than 9 days - try waiting ² weeks prior to shake off. Hope this helps - RO

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 1:06 PM
  6. Thanks for the great info. That is interesting, as many of the protocols for the "DeVellis-method" use different enzymatic preparations (trypsin +/- EDTA, +/- DNAase, papain, etc.). I had basically adapted my rat OPC protocol for mice, but am realizing that they are just not the same. I will trip your papain method and let you know how things pan out. Also, is there a reason you use T²5 flasks instead of combining brains into a T75?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 4:55 PM
  7. No there is no specific reason for using T²5, simply this is what I have always been using. I would imagine combining 3 mice into a T75 flask would roughly be the same thing. Good Luck!

    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 12:00 PM
  8. Hi Ryan, nice video and explanation. Do you do lectin panning to further get rid of microglia or do you find that a 30 min incubation at 37 degrees is enough? Also, how do you know cells are ready to shake? are they always ready at day 9? what do you look for specifically?
    thank you

    Reply
    Posted by: luisa t.
    April 10, 2013 - 12:39 PM
  9. hello...I have gone through this video...very nicely presented...but I have one doubt that if I put the flasks on shaker which only maintains temp and speed but not CO² level, the pH will change...would it not allow the OPCs to survive at all??? and can I use HEPES in medium to solve this problem???
    M willingly waiting for your reply....

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 4, 2012 - 12:35 PM
  10. Thank you for your comment, you are correct in that it will not work without CO² buffering. HEPES buffer will likely not solve this problem either. I'm afraid you will absolutely need to have CO² buffering for this isolation to work.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 11:56 AM
  11. Hi, very INFORMATIVE video, I zalak parikh working on glial cells. In your protocol you are not using any filter after papain digestion but I am facing one problem of Fibroblasts contamination. What could be the possible solution for this problem?
    thank you
    Zalak.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 24, 2012 - 7:59 AM
  12. Hi Zalak, thanks for your comment. What glial cell type are you trying to culture? Oligodendrocytes, astrocytes or microglia? I have never experienced fibroblast contamination.. are you sure they are fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 24, 2012 - 10:47 AM
  13. Hi there. Excellent video, very informative. I was just wondering if you can incubate the flasks in 5% CO² instead of 8% CO²?
    Thanks
    Matt

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 11, 2012 - 12:48 PM
  14. Hi Matt, Actually no, you need to have these at at least 8.5% CO² - otherwise you will have trouble establishing your mixed glial cultures - Good luck

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 11, 2012 - 10:22 PM
  15. Hi Ryan. Very nice video and presentation.
    I have to establish a DRG neuronal culture. Majority of all the papers I've read are using a embryonic source of DRG unlike you using post-natal mouse. What do you think will be the major difference between the cultures of the two??

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 1, 2012 - 12:23 PM
  16. Hi Lipi,
    You're right most papers use embryonic DRGs. The benefit of using post-natal DRGs is that you don't have to sacrifice the mother, and if you use P5-P10 mice, there is no need to use nerve growth factor (in my hands). Embryonic DRG neurons require NGF supplementation to the media for their survival. In terms of the difference between cultures, embryonic dervied ones may have a bit more contaminating cells, since I find they divide pretty quickly. Otherwise I imagine they would be the same as post-natal derived cultures. Good luck!

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    October 1, 2012 - 4:37 PM
  17. Thank you Ryan.

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 3, 2012 - 2:39 AM
  18. Thank you Ryan.

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 3, 2012 - 2:51 AM
  19. Great article Ryan. I had a question for you. Our lab generates mixed glial cell cultures by isolating NPCs from P1 mouse pup brains,expanding the NPCs via neurospheres in the presence of GFs, and then plating the spheres on matrigel for subsequent differentiation without GFs. My main goal in using the neurosphere protocol is to obtain OPCs, but I routinely get only ²0-30% O1+ OPCs following 8 days of differentiation on matrigel. GFAP+ astrocytes seem to dominate the whole culture, with OPCs growing on top of them. I wanted to try to incorporate your protocol into the neurosphere protocol by dissociating the spheres using TrypLE or Accutase, plating them on Poly-D-Lysine, letting the astrocytes grow to confluency while having OPCs proliferate on top, and then use the shaking technique to isolate OPCs. Do you think this is possible? When we perform in vitro studies with the NPCs, we usually plate the neurospheres on matrigel for a day and then trypsinize the cells for seeding into new dishes. Not only do I think the trypsin digest kills many OPCs, but I also remove astrocytes from the matrigel that then contaminate my cultures. Thanks for the help!

    Reply
    Posted by: Brett M.
    November 3, 2012 - 7:37 PM
  20. Hi Brett - To answer your question, yes I think it would be possible to do what you are suggesting. However, it seems to be a pretty roundabout approach. I think the more streamlined approach would be to simply seed your dissociated P1 neural cells onto PLL substrate to generate a monolayer. That way you would avoid having to generate neurospheres (which I imagine takes about 10 days) and then subsequently generating an astrocyte monolayer with the spheres (which would take another 10+ days). In my experience, OPCs don't like trypsin. If you wanted, you could try 0.05% Trypsin instead of 0.²5% and that seems to be more gentle. And if you don't incubate for too long, most astrocytes should remain on the plate. Hope this helps! -Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    November 5, 2012 - 12:14 PM
  21. Ryan, thanks for the help! I tried your protocol and everything appeared to go well. However, one issue I ran into occurred during the overnight shaking step and subsequent differential adhesion assay to isolate a more pure population of OPCs. What I noticed was that after the overnight shaking I had many large oligospheres (maybe 10-²0 cells in size). These spheres did not stick down during the 30 minute plate incubation and I had difficulties trying to dissociate them as you described using the P1000 and P²00 tips. When I took the cells counts and plated the cells onto chamber slides, many smaller clumps remained and stuck down to the matrix. However, the clumps did not flatten out on the gel matrix very well (like neurospheres do) and eventually flaked off after about 5 days of cultures, leaving only sparse population of OPCs. Have you ever encountered this problem? I was thinking of seeding at a higher cells density than what you describe in the protocol.

    Reply
    Posted by: Brett M.
    December 2, 2012 - 10:21 PM
  22. Hi Brett - sounds like you're doing everything right. Normally I see lots of these "oligospheres" as a result of the overnight shaking protocol. However, I find that these are not the majority of OPCs, as there are many single cells and cells in clumps of ²-4. The oligospheres are difficult to dissociate, and due to this, I generally do not go out of my way to try and break them up. In my hands, these spheres spread out very nicely after about ²4hrs on Laminin-² substrate. You can try to seed at higher densities if you like, but the seeding density should be determined based on the experiment you want to conduct. For example, if you want to perform immunocytochemistry, it may not be ideal to have a very dense cell culture. Also, it's possible the clumps aren't super compatible with your matrix substrate - I always use Laminin. I hope this helps :)

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    December 3, 2012 - 11:42 AM
  23. HI Ryan, very informative and nice presentation. I have tried your protocol and everything seem to work fine except at the overnight shaking. There were very few OPCs isolated and it seems there are still many OPCs adhere to the astrocytes. Have you encounter this issue?

    Reply
    Posted by: Esther W.
    December 13, 2012 - 3:25 AM
  24. Hi Esther, Thanks for your comment. How many OPCs are you yielding per mouse? I usually yield on average ²00,000 OPCs per mouse brain, but this is quite variable. At times I have yielded 500,000 or 50,000 per brain, and I'm not sure what accounts for this variability. In any case, you will never dissociate 100% of the OPCs from the monolayer, I've noticed a lot remain stuck. My advice would be to simply give it another shot and see if your yields are a bit higher next time. Hope this helps - RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    December 16, 2012 - 5:35 PM
  25. Thanks Ryan for your advice. My yield is definitely much lower than yours. I will definitely try another round. :)

    Reply
    Posted by: Esther W.
    December 16, 2012 - 8:24 PM
  26. HI Ryan, I face the problem of getting immature OPC instead of mature OPC after 6 days of OL-enriched culture. What is your view?

    Reply
    Posted by: Esther W.
    January 23, 2013 - 2:51 AM
  27. Hi Esther, you should always expect to have some OPCs that don't differentiate during the timecourse. However, the majority of OLs should at least be expressing MAG, if not MBP at DIV6. My guess would be that your media is not exactly correct. Make sure that all the ingredients are at the correct concentration in your 100x OL-supplement stock - especially tri-iodothyronine and L-thyroxine (4mg per 100mL). I hope this helps, let me know if you still have problems.

    Posted by: Ryan O.
    January 23, 2013 - 12:56 PM
  28. Thanks Ryan for replying. I have added tri-iodothyronine only as there is no mentioned of L-thyronine in the 100x OL-supp recipe. Can i still add L-thyronine when the OL-enriched is on DIV5?

    Posted by: Esther W.
    January 23, 2013 - 8:05 PM
  29. Thanks for notifying me of this mistake, I'll notify the editorial team ASAP. Yes you can try to add it on DIV5, but no guarantees this will drive them any farther since they are aleady 5 days in. Give the protocol a second try, and let me know if the lack of differentiation still occurs. -Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    January 24, 2013 - 12:47 AM
  30. Hi Luisa thanks for your comment :) I don't do lectin panning, as I find that incubation on the culture plates is enough to get rid of most of them, but if you're having a problem with microglia that is an additional option. I usually shake on day 9, but I've found you can shake anywhere from 9 to 1² days, but any longer than that you will get less OPCs. Generally if you see a lot of cells on top of the astrocyte monolayer, they are ready to go. However in my experience this dŒsn't really happen before day 9. Hope this helps RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    April 10, 2013 - 2:28 PM
  31. Hi Ryan.Thanks for this protocol. I did exactly what you have described in this protocol, except the shaking step. I did it without CO2, but the caps are tightly sealed, how is it possible that CO2 will effect pH of tightly sealed flask? My yield was very low, besides I had fibroblast contamination as well. I used uncoated flasks as well, because once during the shaking all the layer came off the bottom of the flask, what do you think would be the reason for this?.And in my experience when FBS is used in OPC culture media it made OPC's to differentiate to astrocytes rather then oligodendrocytes.Overall I couldnt replicate this procedure unfortunately and trying to find other methods..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 20, 2014 - 5:33 PM
  32. Hi Aysel - from what you describe in your message, you didn't follow my protocol.

    1) So you didn't shake the flasks? Or you didn't use the same method of shaking?

    2) As far as I know, all standard tissue culture incubators have some level of CO2 buffering (usually 5%). Strictly speaking, if you tighten the cap of your flasks, there will be no gas exchange between the incubator and the flask, if you are using plugged caps. I use vent-capped flasks (0.22um pore), so gas exchange occurs between the flask and the incubator when the caps are tight. To answer your question, CO2 buffering will have little-to-no effect on the pH of the media if you are using tightly-screwed plugged flask caps.

    3) I haven't experienced fibroblast contamination in my cultures, I imagine this would be a dissection issue. The only source of fibroblasts I can imagine would be from the meninges, so be sure to fully remove this prior to dissociation of the cortex. Unless you are confusing fibroblasts for astrocytes. Too many astrocytes is a result of too much agitation at the differential adhesion step.

    4) I have always used coated flasks, in my experience OPCs will not adhere to uncoated surfaces. I am willing to bet you'll get almost no OPCs if you continue to use uncoated flasks. If you want you can try to use other substrates such as PDL, poly-O-ornithine, collagen etc.

    5) I haven't noticed any significant transformation of OPCs into astrocytes in the presence of FBS. I imagine this might occur more frequently in immortalized OPC cell lines. Perhaps that's what you are thinking of.

    I hope this helps, otherwise best of luck in your research.

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 20, 2014 - 8:52 PM
  33. Hi Ryan, thank you ver much for detailed answer. Sorry for my english, i couldnt explain good.
    I did the shaking of course but without putting shaker inside the CO2 incubator, I did shaking at 37 degree incubation only and at 180 rpm. Because the flasks are uncoated(I have used uncoated flasks for rat OPC"s without problem, that is why I tried this way with mouse as well) I hesitated to increase rpm to 240 or so, to prevent astrocyte detachment, and I also think that fibroblast contamination is because of the meninges. Second time I will prevent it.
    It is good to know that I must use coated flasks, I will try again, if you say so.
    Thank you so much, good luck to too..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 21, 2014 - 6:22 AM
  34. Hi Again,
    Alright - I strongly suggest to put the shaker in the incubator for the overnight shake, as I have found this to be a crucial step in maintaining pH balance. The media on your cells should always be a rich red colour (indicative of a balanced pH) all the time. Mouse OPCs are very sensitive to pH, and will die with too much fluctuation. If during your shaking, the media becomes at all purple-ish or yellow-ish, your OPC yield will drastically reduce. I wouldn't be surprised either if this was a contributing factor to the monolayer detachment you experienced previously. There is a significant difference in the in vitro behaviour/viability of mouse OPCs as compared to rat, hence the generation of this protocol. Your best bet is to simply follow this protocol exactly as is.

    Thanks for your comment, and good luck,
    Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 21, 2014 - 12:25 PM
  35. Hi.
    One more question Ryan, about amount of the brains seeded, I was seeding 2 rat brains/ T75 flask , in the mouse case to obtain same amount of cells seeded I was using 6 brains per flask. Would you suggest to use 3-4 instead of six? and if i seed 6 animals should I increase concentration of insulin added to mixed culture media? Overall what would be optimum amount of brains per T75 flask in your opinion? Does it matter to much? Because here you use 1 brainper T25 flask.
    Thanks again..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 26, 2014 - 4:20 PM
  36. Hi Aysel,
    Again, your best bet for success is to follow the protocol exactly as is - T25 flasks are what this method has been optimized for. I suppose T75 flasks have 3 times the surface area, so in theory 3 mice would have to be seeded to a T75 to yield the same cell density. I've never tried this protocol with T75 flasks, and I know that different culture vessels have different impact on growth and survival of OLs.
    Best - RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 27, 2014 - 10:47 AM
  37. Hi Ryan . I want to say that I replicated the procedure exactly as here, and have got very good yield, but I have 1 more question to you, majority of OPCs die in the differentiation media after 6-7 days of incubation. You indicated that it is important not to distrub them until fixation, but how do you do the medium chage, I put 1 ml media first day and did 2/3 media change each 3 days, I seeded all cells to one 24 well format plate, at each time points(3 d, 6 d, 9 d) I transfer the slides to new plate and fix them there and do medium change for rest of the slides. By the way I culture OPCs at 5% CO2, becaue I have only 2 options 5% and 10%, i cant adjust ph of the incubators at this time point. Is it the contributing factor for death of the cells after 4-5 days of incubation?

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    March 19, 2014 - 2:43 PM
  38. Hi Aysel - I'm glad to hear things are looking up -

    1. I don't suggest differentiating the OLs for longer than 6 days. If you're finding they are not differentiating fast enough, you can add 4 mg of L-Thyroxine to the 100X OL-supplement (see the media recipe list above).

    2. It is normal to lose OLs over the time course of differentiation. That being said, you don't want to encourage death by moving the cells or culturing at low pH. You should not be changing the media of the purified OL cultures at any point - they do not require media changes. The protocol also says to culture the OLs at 8.5% CO2. Since you have access to both 5 and 10% CO2 incubators, and 8.5 is closer to 10 than it is to 5, I suggest culturing them at 10%.

    3. Rather than culturing all of your time points in one dish, use 3 dishes (one for 3 days, one for 6 etc). That way, you won't have to disturb your other time points.

    4. Do not remove the coverslips from the wells of your 24 well dish during fixation - simply add concentrated PFA directly into the media and allow to fix for about 15 mins at room temp.

    Sounds like you're almost there, Best of luck - Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    March 19, 2014 - 3:58 PM
  39. Let me write it again to see if I have understood you correct, you say dont do any media change ever, neither at 3 days or 6 days or further? The other things I will try what you suggest, culturing and seeding in different plates at 10% CO2
    I want to thank you a lot for your help and all of the explanations.
    Thanks ..
    Best,
    Aysel

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    March 19, 2014 - 4:22 PM
  40. Thats correct :)
    You're very welcome,

    Ryan

    Posted by: Ryan O.
    March 19, 2014 - 5:49 PM
  41. Hi Ryan,

    Thanks for sharing this protocol, looks really good and will try it out. I have a couple of questions regarding your protocol and was hoping you could shed some light on some problem I am experiencing at the moment.

    With regards to what you have just described, we actually perform a very similar mixed glial culture on P0-P3 rat brains. Our isolation stages are very similar with the exception we use DNAse1 and L-cysteine along with Papain. Upon plating our cell suspensions the flasks are densely populated with microglia on top, then opc's below and then astrocytes. We basically shake off our microglia before doing the overnight shake for the OPC's.

    My question is how do you get rid/ not see any microglia in your mouse cultures? Is it also possible to obtain microglia from your method?

    We are currently experiencing problems with obtaining OPC's from our overnight shake (in rat). The cells look healthy when in culture with the microglia but once the microglia are removed and we perform the steps required to plate the OPC's we have a lot of contaminants in with the cells, almost like long fibrous structures that are stained by trypan blue. We still obtain + 5 million OPC's but the cells do not look healthy and the morphology is not consistent with OPC's. Upon plating these cells they fail to show characteristics of OPCs and a lot die off. I will mention we do not shake in an incubator but in an orbital shaker at 250rpm with the caps sealed tight and parafilm. Have you ever encountered this?

    Many thanks .

    Reply
    Posted by: Graeme I.
    February 9, 2015 - 1:06 PM
  42. Hi Graeme, thanks for your question.
    We do in fact get microglia in our mixed cultures, but we remove them prior to the overnight shake with a slow short shake (as in the rat method). These shaken off microglia are a very pure population, and can be cultured separately if desired.
    With regard to the problems you’re encountering shaking your rat cultures, I can’t say I’ve experienced anything quite like what you’re describing. It almost sounds like your cultures are suffering from contamination (maybe yeast?). We’ve experienced contamination a couple of times, and it resulted in much of the monolayer dissociating from the base of the flask during the overnight shake. If you like, you can send me a pic of the fibrous structures in the hopes that I could recognize what they are (romea077@uottawa.ca).
    We have never had luck shaking flasks in an orbital shaker – we exclusively use tissue culture incubators with vented caps. One risk of using an orbital shaker is they pose a threat for contamination, as they are often used for bacterial cultures.
    I hope this helps and best of luck,
    Ryan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 20, 2015 - 11:12 AM
  43. Hi Ryan,

    Thanks for your reply.

    I tried the protocol and achieved very nice OPC's so everything seems ok there.

    With regards to what I was seeing after my rat OPC shake, I believe it not to be of any contamination but more something coming out of solution in our media. As a test I shook DMEM10% in a T75 flask, 37 degrees, 250rpm overnight. The next day I took an aliquot and looked at it with trypan blue. To my surprise I saw the same fibrous clumps that I was seeing after the OPC shake

    . My DMEM only contains FBS and pen-step so this has to be something in FBS. My most recent shake off I decided to shake off 5 flasks with DMEM 10% and 5 flasks with OPC media (our OPC media contains 2.5ml FBS vs 50ml in DMEM). The next day after following normal protocol I counted the cells from both conditions. The OPC media flasks had almost none of the fibrous clumps whereas the DMEM flasks had alot. I can now partially get round this problem by filtering with 40uM strainer but have you ever heard or seen this kind of thing. We have used several batches if FBS so it cannot be that every batch has precipitated proteins in it but perhaps what were doing is causing precipitation of FBS proteins that are affecting the OPC's?

    Thanks

    Graeme

    Reply
    Posted by: Graeme I.
    March 15, 2015 - 4:16 PM
  44. Hi Ryan,

    Is your FBS from Invitrogen decomplemented ? If so did you buy decomplemented or did you heat it at 56*C and for how long.

    Thanks

    Reply
    Posted by: Ludovic D.
    February 24, 2017 - 10:40 AM
  45. Hi Ludovic,
    I've used FBS that has been heat-inactivated by the manufacturer, and I've also used FBS that I've heat inactivated myself. For the latter, if memory serves, about 30 minutes at roughly 50 degrees C should do the trick (water bath).
    Good luck, Ryan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 26, 2017 - 11:49 AM
  46. Hi Ryan,
    I am wondering if you have any experience with adding Cre Recombinase Adenovirus to the cultures? And if you think a particular day would be best to add it? I was thinking of adding it on D8 (1 day before the full media change) but wasn't sure if adding virus and then shaking the cells would cause too much stress?
    Thanks,
    Megan

    Reply
    Posted by: Megan R.
    April 30, 2018 - 2:39 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics