تصور انواع معينة ايليجانس استخدام الصبغة الحيوية محبة للدهون ، صلاح الغيدان

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

نقدم طريقة لتصور العيش في إهاب

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Schultz, R. D., Gumienny, T. L. Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI. J. Vis. Exp. (59), e3362, doi:10.3791/3362 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

إهاب من C. ايليجانس هو بنية شديدة المقاومة التي تحيط الخارجي للحيوان 1-4. إهاب لا يحمي فقط من الحيوان والبيئة ، ولكن كما يحدد شكل الجسم ويلعب دورا في حراك 4-6. عدة طبقات يفرز من قبل خلايا البشرة تتكون من إهاب ، بما في ذلك طبقة الدهون الأبعد 7.

دعا التلال كفافي في إهاب للحلقة نمط طول الحيوان وموجودة في جميع مراحل التنمية 8. أجنحة هي التلال الطولية التي موجودة خلال مراحل معينة من التنمية ، بما في ذلك L1 ، dauer ، ومراحل البالغين 2،9. يمكن أن الطفرات في الجينات التي تؤثر على المنظمة جليدية تغيير بنية الكولاجين جليدية والحيوان التشكل 5،6،10،11 الجسم. بينما التصوير المجهري باستخدام جليدية مجمع مدينة دبي للإنترنت مع البصريات هو ممكن ، الطرق الحالية التي تبرز هياكل جليدية تشمل fluores12 في المائة التحوير التعبير ، وتلطيخ الضد 13 ، والمجهر الإلكتروني 1. جرثومة القمح المسمى راصة (WGA) كما تم استخدامها لتصور جليكوبروتينات جليدية ، ولكن محدودة في حل هياكل جليدية الدقيقة 14. وقد لوحظ تلون سطح جليدية باستخدام صبغة الفلورسنت ، ولكن لم تتميز بالتفصيل 15. نقدم طريقة لتصور العيش في C. إهاب ايليجانس باستخدام صبغ أحمر فلوري محبة للدهون الجاذبة (1،1 '- dioctadecyl - 3 ، 3،3' ، 3' - tetramethylindocarbocyanine البركلورات) ، والذي يستخدم عادة في C. ايليجانس الخلايا العصبية لتصور المعرضة بيئيا. هذا البروتوكول الأمثل لتلطيخ الجاذبة هو بسيط ، طريقة قوية لرؤية ارتفاع القرار من الفلورسنت للحلقة ، جناح الكبير والفرج ، وذيل الذكور ، وارتفاع الذيل خنثى في C. ايليجانس.

Protocol

1. إعداد صلاح الغيدان وصمة عار

  1. يعد حل سهم الجاذبة ملغ / مل 20 (Biotium ، شركة ، هايوارد ، كاليفورنيا) في DMF. صلاح الغيدان هو الضوء الحساسة وحمايتها حتى من الضوء الجاذبة التي التفاف في احباط.
  2. إنشاء تخفيف العمل الجاذبة بإضافة 0،6 الأسهم الجاذبة ميكرولتر إلى 399.4 M9 ميكرولتر لكل السكان. هذا يجب أن تعطي تخفيف العمل النهائية من 30 ميكروغرام / مل الجاذبة في M9. يمكن زيادتها لتصل هذه تلطيخ السكان متعددة في وقت واحد. درع الجاذبة من الضوء التفاف الأنبوب (ق) في احباط.

2. إعداد النيماتودا

  1. استخدام لوحة 60 ملم تحتوي على عدد سكان الديدان الخيطية غير ملوثة. غسل الحيوانات من لوحة باستخدام حل تريتون 0.5 ٪ X - 100 في M9 العازلة التي يحوم السائل بلطف في حركة دائرية على سطح اللوحة لتخفيف جميع الحيوانات اليرقات وتعليم الكبار. يغسل نقل في أنبوب معقم مل 1.5.
  2. تدور على الفور من الحيوانات عند 2000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. إزالة والتخلص من أكبر قدر سوبernatant ممكن من دون إزعاج كتلة الحيوانات في قاع الأنبوب.
  3. للحد من تريتون المتبقية X - 100 ، شطف الحيوانات باستخدام M9 العازلة ، وتدور ، وإزالة طاف. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
  4. إضافة 400 ميكروليتر من محلول الجاذبة العاملة في M9 في أنبوب لفترة وجيزة إلى دوامة resuspend الحيوانات في الحل.
  5. هز أنبوب عند 20 درجة مئوية لمدة 3 ساعات أفقيا في 350 دورة في الدقيقة في بيئة محمية الضوء. إذا رغبت في ذلك ، يمكن المحتضنة الحيوانات تصل إلى 16 ساعة للتلوين.
  6. لتقليل كمية من الصبغة غير منضم ، وتدور باستمرار على الحيوانات في 2000 دورة في الدقيقة لمدة 20 ثانية. إزالة وتجاهل وطاف أكبر قدر ممكن من دون إزعاج كتلة الحيوانات.
  7. Resuspend الحيوانات في 400 العازلة M9 ميكرولتر وسكب السائل على جزء البكتيريا خالية من طبق آغار NGM المصنف مع E. OP50 القولونية. سماح للحيوانات لاسترداد ما لا يقل عن 30 دقيقة. خلال فترة الانتعاش ينبغي أن الحيوانات الزحف بعيدا عن السائل تلطيخ الجاذبة وعلى الطعام. هذه الخطوةمضان الخلفية يقلل من الجاذبة الحرة.

3. تصاعد ومراقبة العينات

  1. آغار تذوب في الماء 4 ٪ باستخدام الأوتوكلاف أو ميكروويف.
  2. إنشاء الفواصل التي يعاد استخدامها ، والتي يمكن استخدامها لضمان سمك موحد لوحة آغار ، من خلال طبقات قطعتين من الشريط مختبر على شريحة زجاجية. هل جعل الشرائح two الإجمالي.
  3. ترتيب شريحة زجاجية نظيفة بين الشرائح هل اثنين. ماصة حوالي 150 ميكروليتر (أربع نقاط) من 4 ٪ المنصهر أغار على مركز للشريحة زجاجية نظيفة. تغطية بسرعة آغار المنصهر باستخدام شريحة إضافية لتشكيل لوحة آغار. إزالة الغطاء بعناية الشريحة ، والحفاظ على وسادة تركز على الجزء العلوي من الشريحة المتزايدة.
  4. ماصة حوالي 5 ميكرولتر من مخدر الخيطية (100 ميكرون -- 1 levamisole ملم ، على سبيل المثال) على وسادة.
  5. جبل 8-12 الحيوانات في التخدير ، وتغطي مع ساترة المجهر.
  6. مراقبة الحيوانات باستخدام المجهر المركب أو مبائر مزودة objecti على الأقل 40X لقد وDSRed / TRITC (أو غيرها متوافق) التصفية. الحد الأقصى من الإثارة مضان الجاذبة هو 549 نانومتر ، والحد الأقصى من الانبعاثات هو 565 نانومتر لصبغ منضم (Biotium ، شركة ، هايوارد ، كاليفورنيا).

4. ممثل النتائج

البقع الجاذبة للبشرة من نوع جيم البرية ومتحولة ايليجانس. دعا التلال طولية جليدية على سطح يحتوي على فصل للحلقة التي الأخاديد وكفافي ، في بعض المراحل ، جناح الكبير. كل مرحلة تنموية وهياكل جليدية مع تركيبات مختلفة 2. التلال أو الأخاديد كل من أجنحة وصمة عار للحلقة fluorescently ، اعتمادا على تكوين سطح ، طوال مراحل اليرقات والكبار وتبقى مرئية حتى بعد يوم من استرداد باستخدام هذا الأسلوب. ولوحظت بقع الفلورسنت الخلفية في بعض الأحيان (أرقام 2F ، G) ، ولكن ليس بشكل روتيني. (الشكل 1 ، الشكل 2A - E ، H ، I) وقد اتخذت كافة الصور مع مبائر القرص أو الغزل ، وعندما لاحظت ، widefield المجهر المركب (WF).

الأنف والحنجرة "> الشكل 1
الشكل 1. البقع الجاذبة بشرة والخلايا العصبية المعرضة بيئيا. L2 المرحلة الحيوانية. 630x التكبير. تم القبض على قطع الفسيفساء باستخدام صورة iVision ماك البرمجيات (BioVision تكنولوجيز ، إكستون ، والسلطة الفلسطينية). وانضم الصور باستخدام أدوبي فوتوشوب CS3 ​​(أدوبي سيستمز ، سان خوسيه ، كاليفورنيا). شريط النطاق = 10 ميكرون. الجاذبة أيضا fluorescently البقع والخلايا العصبية الحسية amphid فصمية في الرأس والذيل على التوالي (سهام علامة بعض).

الشكل 2
الشكل 2. الجاذبة البقع fluorescently جيم ايليجانس جليدة في جميع مراحل تطور الجنين في مرحلة ما بعد. 630x التكبير. شريط النطاق = 10 ميكرون. تلون من النوع البري والحيوانات في L1) ؛ ب) L2 ، C) dauer ؛ D) L3 ؛ E) L4 ، وF) في المراحل الكبار. هي ملطخة fluorescently التلال أجنحة والحلقي في الحيوانات وL1 dauer (A ، C). بقع التلال الحلقي الجاذبة في الحيوانات L2(B). الحلقي الأخاديد وصمة عار في L3 L4 والحيوانات (D ، E). في الأخاديد من جناح الكبير والملون للحلقة في الحيوانات الكبار (FH). وتتكون من اثنين من أجنحة التلال الخمس ، أو ثلاث ، (في L1 ، dauer ، أو الحيوانات البالغة على التوالي) ، التي تعمل على طول الحيوان (الأسهم) 16. للحلقة خلق التلال كفافي حول الحيوانية (النصال وواو وياء). إهاب الحيوانات طافرة الكبار العرض المعتدلة عيوب المنظمة جليدية (GH). G) ومرتفعات من أجنحة متقطعة (WF). H) وتنصهر التلال أجنحة الزائدين ومتشعبة متفرعة أو (WF). المسوخ الجين الكولاجين المعرض أجنحة وعيوب التنظيم الحلقي (IJ). I) في الحيوانات المعدلة وراثيا overexpressing pRF4 (رول - 6 (su1006)) ، التلال تكمن جناح الكبير في زاوية لطول الحيوان. J) للحلقة المعدلة وراثيا في pRF4 overexpressing الحيوانات (رول - 6 (su1006)) عرض على نمط منتظم.

الشكل 3
الشكل 3. خارجيهي مضيئة بن هياكل شكلية بواسطة تلطيخ الجاذبة. 630x التكبير. أشرطة النطاق = 10 ميكرون. الجاذبة كما يبرز المزايا الخارجية الأخرى ، بما في ذلك A) أشعة الكبار الكبار خنثى الفرج ، B) ومروحة الذيل الذكور ، وجيم). خنثى ارتفاع الذيل (متشعب في هذه الخلفية متحولة)

الشكل 4
الشكل 4. البشرة وقتا أطول لطخه مع صلاح الغيدان من الخلايا العصبية المعرضة بيئيا. 630x التكبير. شريط النطاق = 10 ميكرون. بعد ساعتين من تلطيخ ، ملطخة بما فيه الكفاية amphid (لا يظهر) والخلايا العصبية الحسية فصمية (الأسهم). في المقابل ، إهاب الأصغر سنا حيوانات ليست سوى جزئيا في بقع ملطخة (رأس السهم).

غسل وصمة عار حل (+ الجاذبة) حضانة الوقت بشرة ملون
M9 آر + 0.5 ٪iton X - 100 M9 تريتون + 0.5 ٪ X - 100 2 ساعات لا
M9 تريتون + 0.5 ٪ X - 100 M9 تريتون + 0.5 ٪ X - 100 3 ساعات لا
M9 تريتون + 0.5 ٪ X - 100 M9 2 ساعات جزئي
M9 تريتون + 0.5 ٪ X - 100 M9 3 ساعات نعم
M9 تريتون + 0.5 ٪ X - 100 H 2 0 2 ساعات جزئي
M9 تريتون + 0.5 ٪ X - 100 H 2 0 3 ساعات نعم

الجدول 1. تم اختبار تلطيخ جليدية تحت ظروف مختلفة. حضانة حلول مختلفة ومرات لتحسين تلطيخ جليدية في الحيوانات. H 2 0 ، ماء مقطر معقم. تلطيخ جزئية تشير تلطيخ متفاوتة من إهاب اليرقات (الشكل 4) ، على الرغم من البقع بشرة الكبار جonsistently.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

طريقة تلوين الجاذبة المقدمة هنا يسمح للطريقة سريعة ومريحة نسبيا لتصور في إهاب ايليجانس جيم. بواسطة repurposing وتحسين طريقة تستخدم عادة لصورة الخلايا العصبية الحسية 15،17 المعرضة بيئيا ، يمكن أن تستخدم لصبغ الجاذبة fluorescently كلا أجنحة وهياكل حلقية (الشكلان 1 و 2) ، فضلا عن الفرج ، وذيل الذكور ، وارتفاع الذيل خنثى (الشكل 3). لقد وجدنا أن الحل الحضانة والنفوذ الوقت قدرة الجاذبة للبشرة وصمة عار على الدوام (الجدول 1 ، الشكل 4). طريقة لتلوين الخلايا العصبية الجاذبة المعرضة بيئيا يستخدم فترة حضانة لمدة ساعتين في M9 مع 100 15 X - تريتون. وغسل الأولي M9 مع بالسطح تريتون X - 100 يساعد على إزالة التلوث من على سطح الأرض جليدية ويمنع الحيوانات من التثاقل. ومع ذلك ، يحتضنها الحيوانات ثلاث ساعات في محلول تلوين في نفس المخزن يمنع الصبغة من تلطيخ للبشرة (الجدول 1).قد يكون سبب ذلك عن طريق الدهون على سطح الخيطية يجري خلع من قبل يعد العلاج في حل المنظفات. حضانة الحيوانات في الماء مع البقع الجاذبة للبشرة ، مشيرا الى انه لا يطلب من محلول الملح M9 لتلطيخ الجاذبة للبشرة. على الرغم من أنه أوصى بروتوكول المستندة إلى الماء لتلطيخ الجاذبة العصبية 15 ، نجد أن الحيوانات المعالجة بهذه الطريقة غالبا ما تظهر غير صحية. غسل الحيوانات في فترة وجيزة بنسبة 0.5 ٪ تريتون X - 100 في M9 ، تليها الحضانة لمدة ثلاث ساعات في حل تلطيخ المصنوعة من M9 ، ويوفر تلوين ثابت من هياكل جليدية ويحافظ على رفاهية الحيوانات.

ويمكن انقاذ الحيوانات بعد المراقبة والحفاظ عليها ، تسمح تحليلات المصب مباشرة. هذا الأسلوب هو أداة مريحة والتي يمكن استخدامها في العديد من الدراسات ، بما في ذلك ، ولكن ليس على سبيل الحصر ، وتنظيم إفراز جليدية ، البشرة التنمية الخلية ، متغاير التوقيت مسارات الجينات ، وتطور النيماتودا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

Acknowledgments

نود أن نشكر S. تانيجا - Bageshwar ، Beifuss K. ، Kedroske S. ، والمراكز الصحية. هسياو للمناقشات مفيدة. وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق بدء الأموال من وزارة TAMHSC الطب الجزيئي والخلوي. تم شراؤها في نطاق المجمع والقرص الغزل مع الأموال المقدمة من قبل الدائرة ومكتب TAMHSC عميد. وقدمت بعض سلالات من قبل مركز علم الوراثة انواع معينة ، والذي يتم تمويله من قبل المركز الوطني لبحوث الموارد. وكان pRF4 (رول - 6 (su1006)) هدية من الحرائق أ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DiI (1,1’-Dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) Biotium, Inc. 60010 Stock dilution:
20 mg/mL in DMF
working dilution: 30 mg/mL
DMF (Dimethylformamide) Sigma-Aldrich D4551
Triton X-100 (Octylphenoxypolyethoxyethanol) VWR international EM-9410
M9 (22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1mM MgSO4)
NGM (Nematode growth medium) IPM Scientific, Inc. 11006-501 Can be prepared following NGM agar protocol18
Agar-agar EMD Millipore 1.01614 4% in water
Levamisole (Levamisole hydrochloride) Sigma-Aldrich 31742 100 μM - 1 mM levamisole as required
Microscope slides VWR international 16005-106
Microscope cover glasses VWR international 16004-302
Compound scope Carl Zeiss, Inc. A1m Use objectives to match the needs of the experiment
TRITC or other compatible filter Chroma Technology Corp. 49005 ET - DSRed (TRITC/Cy3) sputtered filter set

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cox, G. N., Kusch, M., Edgar, R. S. Cuticle of Caenorhabditis elegans: its isolation and partial characterization. The Journal of Cell Biology. 90, 7-17 (1981).
  2. Cox, G. N., Staprans, S., Edgar, R. S. The cuticle of Caenorhabditis elegans. II. Stage-specific changes in ultrastructure and protein composition during postembryonic development. Dev. Biol. 86, 456-470 (1981).
  3. Hall, D., Altun, Z. C. elegans Atlas. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  4. Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. The C. elegans Research Community. WormBook. (2007).
  5. Kramer, J. M., Johnson, J. J., Edgar, R. S., Basch, C., Roberts, S. The sqt-1 gene of C. elegans encodes a collagen critical for organismal morphogenesis. Cell. 55, 555-565 (1988).
  6. Mende, N. von, Bird, D. M., Albert, P. S., Riddle, D. L. dpy-13: a nematode collagen gene that affects body shape. Cell. 55, 567-576 (1988).
  7. Blaxter, M. L. Cuticle surface proteins of wild type and mutant Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 268, 6600-6609 (1993).
  8. Costa, M., Draper, B. W., Priess, J. R. The role of actin filaments in patterning the Caenorhabditis elegans cuticle. Dev. Biol. 184, 373-384 (1997).
  9. Sapio, M. R., Hilliard, M. A., Cermola, M., Favre, R., Bazzicalupo, P. The Zona Pellucida domain containing proteins, CUT-1, CUT-3 and CUT-5, play essential roles in the development of the larval alae in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol.. 282, 231-245 (2005).
  10. Johnstone, I. L. Cuticle collagen genes. Expression in Caenorhabditis elegans. Trends Genet. 16, 21-27 (2000).
  11. Kramer, J. M., French, R. P., Park, E. C., Johnson, J. J. The Caenorhabditis elegans rol-6 gene, which interacts with the sqt-1 collagen gene to determine organismal morphology, encodes a collagen. Mol. Cell Biol. 10, 2081-2089 (1990).
  12. Thein, M. C. Caenorhabditis elegans exoskeleton collagen COL-19: an adult-specific marker for collagen modification and assembly, and the analysis of organismal morphology. Dev. Dyn. 226, 523-539 (2003).
  13. McMahon, L., Muriel, J. M., Roberts, B., Quinn, M., Johnstone, I. L. Two sets of interacting collagens form functionally distinct substructures within a Caenorhabditis elegans extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 14, 1366-1378 (2003).
  14. Link, C. D., Ehrenfels, C. W., Wood, W. B. Mutant expression of male copulatory bursa surface markers in Caenorhabditis elegans. Development. 103, 485-495 (1988).
  15. Tong, Y. G., Burglin, T. R. Conditions for dye-filling of sensory neurons in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. Methods. 188, 58-61 (2010).
  16. Singh, R. N., Sulston, J. E. Some observations on moulting in Caenorhabditis elegans. Nematologica. 24, 63-71 (1978).
  17. Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 148, 187-200 (1998).
  18. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics