의 시각화 Caenorhabditis Elegans 표피 구조

Biology

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Summary

우리는 사는 표피를 시각화하는 방법을 제시

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Schultz, R. D., Gumienny, T. L. Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI. J. Vis. Exp. (59), e3362, doi:10.3791/3362 (2012).

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Abstract

C.의 표피 elegans는 동물 1-4 외관을 둘러싸는 매우 강한 구조입니다. 표피는 환경에서 동물을 보호뿐만 아니라 몸 모양을 결정하고 운동성 4-6에서 역할을뿐만 아니라. 표피 세포에 의해 분비 여러 레이어 바깥쪽의 지질 층 7 포함하여 표피를 구성.

표피의 주변 산등성이는 annuli 패턴 동물의 길이라는 개발 8 모든 단계 동안 존재하고 있습니다. Alae는 L1, dauer, 그리고 성인 단계 2,9를 포함하여 발달의 특정 단계 동안 존재하는 세로 능선입니다. cuticular 콜라겐 조직에 영향을 유전자에 돌연변 cuticular 구조와 동물 신체 형태 5,6,10,11을 변경할 수 있습니다. DIC 광학과 복합 현미경을 사용하여 cuticular 이미지가 강조 가능한, 현재 방법이지만 cuticular 구조 fluores 포함센트 transgene 표현 12, 항체 염색법 13, 그리고 전자 현미경 1. 분류 밀 배아 agglutinin (WGA)도 cuticular glycoproteins을 시각화하는 데 사용되었지만 미세한 cuticular 구조 14 해결 제한됩니다. 형광 염료를 사용하여 표면의 얼룩 cuticular을 준수하지만, 세부 15 특징 적이되었습니다. 우리는 살아 C로 표피를 시각화하는 방법을 제시 일반적으로 C로 사용되는 적색 형광 염료 lipophilic DiI를 (1,1 '- dioctadecyl - 3, 3,3', 퍼클로레이트을 3'이 - tetramethylindocarbocyanine) 사용 elegans elegans은 환경 노출 뉴런을 시각화합니다. DiI의 얼룩에 대한이 최적화된 프로토콜은 고해상도 형광 annuli의 시각화, alae, 외음부, 남성 꼬리, 그리고 C로 남녀 추니 꼬리 증가를위한 간단하고 강력한 방법입니다 elegans.

Protocol

1. DiI의 준비 얼룩

  1. DMF 20 밀리그램 / ML DiI (Biotium, 주식 회사, 헤이워드, CA)의 주식 솔루션을 준비합니다. DiI가 민감한 빛이기 때문에 호일에 포장하여 빛으로부터 DiI를 보호합니다.
  2. 각 인구 399.4 μL M9 0.6 μL DiI 주식을 추가하여 DiI의 작업 희석를 만듭니다. 이것은 30 μg / M9에 ML DiI의 최종 작업 희석를 제공해야합니다. 이것은 동시에 여러 인구를 얼룩에 확장할 수 있습니다. 호일에 튜브 (들)을 포장하여 빛으로부터 쉴드 DiI.

2. nematodes의 준비

  1. 오염 nematodes의 인구를 포함하는 60mm 플레이트를 사용하십시오. 부드럽게 모든 애벌레와 성인 동물을 풀어야 접시의 표면에 걸쳐 원형 운동에 액체를 소용돌이로 M9 버퍼에서 0.5 % 트라 이튼의 솔루션 X - 100을 사용하는 접시에서 동물을 씻으십시오. 멸균 1.5 ML 튜브로 세척을 전송합니다.
  2. 즉시 30 초 2000 RPM에서 동물을 돌린다. 많이 먹어 볼래요 제거하고 폐기튜브의 하단에있는 동물의 질량을 방해하지 않고 가능한 ernatant.
  3. 잔여 트리톤 X - 100을 줄이기 위해, M9 버퍼, 스핀을 이용하여 동물 린스, 그리고 뜨는 제거합니다. 일단이 단계를 반복합니다.
  4. 솔루션에서 동물 resuspend 수있는 튜브 및 와류 간략하게하기 위해 M9에서 일하는 DiI 솔루션 400 μL를 추가합니다.
  5. 20 튜브를 흔들어 ° C 수평 가벼운 보호된 환경에서 350 rpm으로 3 시간 동안. 원하는 경우, 동물 얼룩 16 시간까지 incubated 수 있습니다.
  6. 언바운드 색소의 양을 줄이기 위해 20 초 2000 RPM에서 동물을 돌린다. 제거하고 동물의 질량을 방해하지 않고 가능한 한 많은 뜨는으로 폐기하십시오.
  7. 400 μL M9 버퍼와 OP50 E.와 씨앗 NGM 한천 플레이트의 박테리아가없는 부분에 액체를 부어 Resuspend 동물 대장균. 적어도 30 분 복구하는 동물을 허용합니다. 복구 기간 동안 동물 DiI의 얼룩 액체로부터 식품에 떨어져 크롤 링해야합니다. 이 단계는무료 DiI에서 배경 형광을 줄일 수 있습니다.

3. 표본을 장착하고 관찰

  1. 압력솥이나 전자 레인지를 사용하여 물에 4 % 한천을 용융.
  2. 유리 슬라이드에 실험실 테이프 겹겹이 두 가지로, 한천 패드의 균일한 두께를 보장하는 데 사용할 수있는 재사용 가능한 스페이서를 만듭니다. 이 스페이서 슬라이드 총하십시오.
  3. 이 스페이서 슬라이드 사이에 깨끗한 유리 슬라이드를 마련. 깨끗한 유리 슬라이드의 중심에 용융 4 % 한천의 피펫 약 150 μL (4 방울). 신속 한천 패드를 양식에 추가 슬라이드를 사용하여 용융 한천을 커버. 조심스럽게 장착 슬라이드의 상단을 중심으로 패드를 유지, 커버 슬라이드를 제거합니다.
  4. 피펫 선충류 마취 (100 μm의 - 1 ㎜의 levamisole, 예를 들어) 5 μL에 대한 패드에.
  5. 마운트 8-12 마취의 동물과 현미경 coverslip로 커버.
  6. 적어도 40x objecti 장착되어 화합물이나 공촛점 현미경을 사용하여 동물을 관찰 적 및 TRITC / DSRed (또는 다른 호환) 필터. DiI의 형광 여기 최대 549 NM이며 방사 최대 행 염료 (Biotium, 주식 회사, 헤이워드, CA)에 565 nm의 수 있습니다.

4. 대표 결과

야생 유형과 돌연변 C.의 DiI 얼룩은 표피 elegans. cuticular 표면 annuli 어떤 단계에서 원주 고랑로 구분하여 포함하고, 세로 능선이 alae했다. 각 발달 단계는 뚜렷한 작곡 2 cuticular 구조를하고 있습니다. alae와 annuli 모두 산등성이 또는 고랑이 찬란 애벌레와 성인 단계에 걸쳐, 표면 구성에 따라, 얼룩 및 최대이 방법을 사용하여 복구 후 하루에 보이는 남아 있습니다. 배경 형광 speckles 때로는 (그림 2 층 G) 관찰 아니지만 정기적으로 (그림 1, 그림 2A - E, H, I). 아르 모든 이미지는 언급 스피닝 디스크 공촛점거나, widefield (WF) 복합 현미경과 함께 찍은 사진.

엔트 "> 그림 1
그림 1. DiI는 얼룩 표피하고 환경 노출 뉴런. L2 단계 동물. 630x 확대. 모자이크 이미지 부품은 iVision - 맥 소프트웨어 (BioVision 기술, Exton, PA)를 사용하여 점령했다. 이미지는 어도비 포토샵 CS3 (어도비 시스템즈, 산호세, CA)를 사용하여 합류했다. 스케일 바 = 10 μm의. DiI도 찬란 얼룩 amphid하고 머리와 꼬리에 선충 감각 뉴런 각각 (화살표가 일부 표시).

그림 2
그림 2. DiI 찬란 얼룩 C. 이후 배아 발달의 모든 단계에서 elegans 표피. 630x 확대. 스케일 바 = 10 μm의. A) L1에서 야생 타입 동물의 얼룩, B) L2, C) dauer, D) L3, E) L4 및 F) 성인 단계. alae과 환상 산등성이가 찬란 (A, C) L1과 dauer 동물에 얼룩이 있습니다. L2 동물의 DiI는 얼룩 환상 산등성이를(B). 환상은 L3 및 L4 동물 (D, E)에 얼룩 고랑. alae의 고랑과 annuli는 성인 동물 (FH)에 얼룩이 있습니다. Alae는 동물의 길이 (화살표) 16를 실행하는 두 다섯, 또는 세 산등성이 (각각 L1, dauer, 또는 성인 동물에)의 구성됩니다. Annuli는 동물 주위 원주 산등성이 (화살촉, F와 J)를 만들 수 있습니다. 성인 돌연변이 동물의 표피는 적당한 cuticular 조직 결함 (GH)를 표시합니다. G) alae의 산등성이가 (WF) 불연속 있습니다. H) 정원 외의 alae의 산등성이는 융합과 분기 또는 (WF) bifurcated 있습니다. 콜라겐 유전자 돌연변이 alae와 환상 조직 결함 (IJ)를 나타냅니다. I) 유전자 변형 동물에 overexpressing pRF4 (rol - 6 (su1006)), 동물의 길이 각도로 alae의 거짓말의 산등성이. 유전자 변형 동물 overexpressing pRF4 (rol - 6 (su1006))에 J) Annuli이 불규칙 패턴을 표시합니다.

그림 3
그림 3. 통근자알 형태학의 구조 DiI의 얼룩에 의해 불이됩니다. 630x 배율은. 스케일 바 = 10 μm의. DiI 또한 A) 성인 남녀 추니 외음부, B) 성인 남성 꼬리 광선 및 팬 등 다른 외부 기능을 강조하고, C) 남녀 추니 꼬리 스파이크 (이 돌연변이 배경에 갈래).

그림 4
그림 4. 표피는 환경 노출된 뉴런보다 DiI와 얼룩이 오래 걸립니다. 630x 확대. 스케일 바 = 10 μm의. 얼룩 두 시간 후, amphid (표시되지 않음) 및 선충 감각 뉴런은 (화살표) 충분히 스테인드 수 있습니다. 대조적으로, 젊은 동물의 표피는 일부 패치 (화살촉)에 얼룩 있습니다.

빨래 얼룩 솔루션 (+ DiI) 배양 시간 표피 자국
M9 + 0.5 % TRiton X - 100 M9 + 0.5 % 트리톤 X - 100 2 시간 아니
M9 + 0.5 % 트리톤 X - 100 M9 + 0.5 % 트리톤 X - 100 3 시간 아니
M9 + 0.5 % 트리톤 X - 100 M9 2 시간 일부의
M9 + 0.5 % 트리톤 X - 100 M9 3 시간
M9 + 0.5 % 트리톤 X - 100 H 2 0 2 시간 일부의
M9 + 0.5 % 트리톤 X - 100 H 2 0 3 시간

표 1. 다른 조건 하에서 Cuticular 얼룩. 다양한 인큐베이션 솔루션 및 시간은 동물 cuticular 얼룩을 최적화하기 위해 테스트되었습니다. H 2 0, 멸균 증류수. 부분 얼룩하지만 성인 표피의 얼룩 C, 애벌레의 표피의 곳곳에 얼룩 (그림 4)을 나타냅니다onsistently.

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Discussion

여기에 제시 DiI의 얼룩 방법은 C. elegans의 표피를 시각화하기 위해 상대적으로 신속하고 편리하게 얻을 수 있습니다. 일반적으로 이미지의 환경 노출 감각 뉴런 15,17하는 데 사용하는 방법을 repurposing 및 최적화함으로써, DiI는 찬란 alae와 환상 구조 (그림 1 및 2)뿐만 아니라 외음부, 남성 꼬리, 그리고 남녀 추니 꼬리 스파이크를 모두 얼룩하는 데 사용할 수 있습니다 (그림 3). 우리는 DiI 능력 배양 솔루션과 시간에 영향이 일관되게 표피 (표 1, 그림 4) 얼룩 것으로 나타났습니다. DiI 얼룩 환경 노출 뉴런에 대한 방법은 트리톤 X - 100 15 M9에 두 시간 부화 시간을 사용합니다. 계면 활성제와 함께 M9의 초기 세척는 Triton X - 100은 cuticular 표면에서 오염을 제거하는 데 도움과 clumping에서 동물을 방지할 수 있습니다. 그러나, 동일한 버퍼에 얼룩 솔루션 동물 세 시간 잠복기하면 표피 (표 1) 얼룩에서 염료를 방지할 수 있습니다.이것은 세제 솔루션에서 더 이상 치료에 의해 해제 벗겨지고되는 선충류 표면에 lipids로 인해 발생할 수 있습니다. M9 소금 솔루션 표피의 DiI의 얼룩이 필요 없습니다 나타내는 DiI 얼룩 표피와 물 속에 동물 부화. 물을 기반 프로토콜의 연결을 DiI의 얼룩 15 권장하지만, 우리는 동물이 방법은 종종 건강에 해로운 나타납니다 취급 것을 발견했습니다. 0.5 %에서 잠시 동물을 세탁 M9로 만든 얼룩 솔루션에서 3 시간 배양하여 다음 튼과 M9의 X - 100, cuticular 구조의 일관성있는 얼룩을 제공하고 동물의 웰빙을 유지하고 있습니다.

동물을 관찰 후 구출 직접 스트림 분석을 허용, 유지하실 수 있습니다. 이 방법을 포함한 여러 연구에서 사용할 수있는 편리한 도구이지만, cuticular 분비 및 조직, 표피 세포 개발, heterochronic 유전자 경로와 선충류의 진화에 국한되지 않습니다.

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Disclosures

우리는 공개 아무것도 없어.

Acknowledgments

우리는 S. Taneja - Bageshwar, K. Beifuss, S. Kedroske 및 HC 감사하고 싶습니다. 도움이 토론 샤오. 이 작품은 분자 및 세포 의학 TAMHSC학과에서 자금 업을 시작하여 기금을했다. 화합물 범위 및 회전 디스크는 부서와 학장의 TAMHSC 사무소에서 제공하는 자금을 구입했다. 일부 변종은 연구 자원을위한 국립 센터의 후원됩니다 Caenorhabditis 유전학 센터에 의해 제공되었다. pRF4 (rol - 6 (su1006)은) A. 화재의 선물했다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DiI (1,1’-Dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) Biotium, Inc. 60010 Stock dilution:
20 mg/mL in DMF
working dilution: 30 mg/mL
DMF (Dimethylformamide) Sigma-Aldrich D4551
Triton X-100 (Octylphenoxypolyethoxyethanol) VWR international EM-9410
M9 (22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1mM MgSO4)
NGM (Nematode growth medium) IPM Scientific, Inc. 11006-501 Can be prepared following NGM agar protocol18
Agar-agar EMD Millipore 1.01614 4% in water
Levamisole (Levamisole hydrochloride) Sigma-Aldrich 31742 100 μM - 1 mM levamisole as required
Microscope slides VWR international 16005-106
Microscope cover glasses VWR international 16004-302
Compound scope Carl Zeiss, Inc. A1m Use objectives to match the needs of the experiment
TRITC or other compatible filter Chroma Technology Corp. 49005 ET - DSRed (TRITC/Cy3) sputtered filter set

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References

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