可视化线虫角质层结构的亲脂性的重要染料,直接投资收益

Biology

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Summary

我们提出了一个可视化生活角质层的方法

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Schultz, R. D., Gumienny, T. L. Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI. J. Vis. Exp. (59), e3362, doi:10.3791/3362 (2012).

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Abstract

角质层的C.线虫是一种高度耐药的结构,周围的动物 1-4外部。角质层不仅可以保护环境的动物,但也决定体形和蠕动4-6次的作用。由表皮细胞分泌的几层组成的角质层,包括最外层脂质层7。

在角质层的圆周脊称为环空中的模式动物的长度, 目前在8发展的所有阶段。 Alae有纵脊目前是在特定的发展阶段,包括L1的dauer,和成人阶段2,9。影响表皮胶原组织的基因突变可以改变表皮结构和动物的身体形态 5,6,10,11 。虽然使用DIC的光学显微镜复合表皮成像是可行的,目前的方法,突出表皮结构包括荧光12%的转基因表达,抗体染色,电子显微镜1。也被用来标记麦胚凝集素(WGA)的可视化表皮糖蛋白,但受限于解决更精细的表皮结构 14 。使用荧光染料染色表皮表面已被观察到,但从来没有在细节 15的特点。我们提出了一个方法来可视化角质层在现场 C. 线虫使用红色荧光亲脂性染料DII(1,1' -双十八烷基- 3,3,3',3' - tetramethylindocarbocyanine高氯酸盐),也就是通常用于 C 线虫可视化环境接触的神经元。这是一个简单可靠的方法,高分辨率的荧光可视化的环空中,alae,外阴,男性的尾巴, C和雌雄同体的尾穗DII染色的优化协议线虫

Protocol

1。 DII制备染色

  1. 准备的20毫克/毫升DII(Biotium公司,公司,海沃德,CA)在DMF原液。 DII是光敏感,所以保护光箔包装DII。
  2. 每个人口0.6μLDII股票加入到399.4微升M9的创建工作的DII稀释。这应该给最后的30微克/毫升DII在M9的工作液。这可以扩展多个种群同时染色。盾DII在铝箔包装管(S)。

2。线虫的制备

  1. 包含一个未被污染的线虫人口使用60毫米的钢板。洗轻轻摇动整个板面的液体的圆周运动,放松所有的幼虫和成年动物,动物板,解决了0.5%的Triton X - 100的使用M9的缓冲区。转移到无菌1.5毫升管洗。
  2. 立即降速在2000转每分钟30秒的动物。取下并丢弃很多SUPernatant尽可能在试管底部,而不会干扰动物的质量。
  3. 为了减少残留的TRITON X - 100,冲洗动物使用M9的缓冲区,旋转,去除上清液。重复此步骤一次。
  4. 管和涡简要加入400μL的工作DII M9的解决方案,以重悬在溶液中的动物。
  5. 摇管在20 ° C水平为3个小时在350 RPM轻保护环境。如果需要的话,动物可以被孵育染色16小时。
  6. 为了减少未结合的染料量,自旋向下的动物,在2000转,持续20秒。删除尽可能上清液丢弃,而不会干扰动物的质量。
  7. 在400μLM9的缓冲区,并倒到无细菌的接种与OP50 E.一个NGM琼脂板部分液体悬浮动物大肠杆菌 。让动物恢复至少30分钟。在恢复时间的动物应该爬远离DII染色液体到食品。这一步免费直接投资收益减少背景荧光。

3。安装和观察标本

  1. 使用高压灭菌器或微波熔体4%水琼脂。
  2. 创建可重复使用的垫片,可用于确保琼脂板厚度均匀,分层两件实验室磁带载玻片上。共两个间隔的​​幻灯片。
  3. 两个间隔幻灯片之间安排一个洁净的载玻片。移液器熔化的4%到洁净的载玻片中心琼脂约150μL(四滴)。迅速覆盖使用一个额外的幻灯片的形式琼脂垫熔化的琼脂。小心地取下封面幻灯片,安装幻灯片的顶部为中心的垫。
  4. 移液器约5μL线虫麻醉(100微米 - 1毫米左旋咪唑,例如,)上垫。
  5. 山8 - 12只动物在麻醉剂,并与显微镜的盖玻片覆盖。
  6. 使用装有至少40倍objecti的化合物或共聚焦显微镜观察动物 VE和一个DsRed的/ TRITC(或其他兼容)过滤器。激发最大的投资收益为549纳米,其最大发射约束染料(Biotium公司,公司,海沃德,CA)是565纳米。

4。代表性的成果

DII污渍角质层的野生型和突变株C.线虫 。表皮表面含有环空中圆周沟分开,并在某些阶段,纵脊alae。每个发展阶段有2个不同成分的表皮结构。 alae和环空中的山脊或沟荧光染色,取决于表面成分,整个幼虫和成年阶段,仍然可见使用这种方法恢复后的一天。有时观察到的背景荧光斑点(图2F,G)的,但不是常规(图1,图2A - E,H,我)。所有图像旋转盘共聚焦或时指出,广角(WF)复合显微镜。

耳鼻喉科“> 图1
图1。 DII污渍角质层和环境接触的神经元。 L2阶段的动物。 630x放大倍率。马赛克图像部分使用iVision - Mac软件(BioVision的技术,位于宾夕法尼亚州Exton)被抓获。使用Adobe Photoshop CS3(Adobe系统公司,加利福尼亚州圣何塞)加入图像。比例尺= 10微米。 DII还荧光污渍amphid phasmid感觉神经元的头部和尾部分别为(箭头标记一些)。

图2
图2。 DII C.荧光污渍线虫角质层后胚胎发育的各个阶段 。 630x放大倍率。比例尺= 10微米。野生型动物染色)L1,B)二级C)的dauer,D)三级,E)L4;和F)成人阶段。在L1和的dauer动物alae和环形脊荧光染色(A,C)。 DII污渍二级动物的环形脊(二)。环形沟L3和L4动物(D,E)染色。在alae沟和环空中成年动物(FH)的染色。 Alae是由二,五,或三个脊(L1,的dauer,或成年动物,分别)运行长度的动物(箭头)16。环空中创建圆周周围的动物脊(箭头,F和J)。角质层成人突变动物显示温和的表皮组织缺损(GH)。 G)alae的脊不连续(WF)。高)编外alae脊融合和分支或分叉(WF)。胶原蛋白基因的突变体表现alae和环形组织缺损(IJ)。 i)在过表达转基因动物pRF4(ROL - 6(su1006)),alae谎言脊动物的长度角度。 J)在转基因动物的过度表达pRF4(ROL - 6(su1006))环空中显示一个不规则的图案。

图3
图3。为extern人的形态结构,照亮了DII染色。630x放大倍率。比例尺= 10微米。 DII还突出等外观特征,包括一)成人雌雄同体外阴,B)的成年雄性的尾巴射线和风扇和C)雌雄同体的尾穗(在这种突变的背景分叉)。

图4
图4。角质层需要更长的时间比环境接触的神经元与DII染色。 630x放大倍率。比例尺= 10微米。经过两个小时的染色,amphid(未显示)和phasmid感觉神经元(箭头)有足够的染色。相比之下,年轻动物的角质层只是部分补丁(箭头)染色。

染色解决方案(DII) 孵育时间 角质层染色
M9的± 0.5%TRiton X - 100 M9 + 0.5%的Triton X - 100 2小时没有
M9 + 0.5%的Triton X - 100 M9 + 0.5%的Triton X - 100 3小时没有
M9 + 0.5%的Triton X - 100 M9 2小时部分
M9 + 0.5%的Triton X - 100 M9 3小时
M9 + 0.5%的Triton X - 100 H 2 O 2小时部分
M9 + 0.5%的Triton X - 100 H 2 O 3小时

表1。表皮染色,在不同的条件下,各种孵化的解决方案和时间进行了测试,以优化在动物表皮染色。 H 2 O,无菌蒸馏水。部分染色表明幼虫角质层片状染色(图4),虽然成人角质层污渍的彗星onsistently。

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Discussion

这里介绍DII的染色方法,允许一个相对快速和方便的方法来可视化角质层线虫。再利用和优化常用的图像环境暴露15,17感觉神经元的方法,直接投资收益可用于荧光染色alae和环状结构(图1和2),以及外阴,男性的尾巴,和雌雄同体的尾穗(图3)。我们发现,洗液和时间的影响的直接投资收益的能力,始终染色的角质层(表1,图4)。 DII染色环境暴露的神经元的方法使用两个小时的孵育时间M9 TRITON X - 100 15。 M9与表面活性剂的初始洗TRITON X - 100有助于消除从表皮表面的污染和防止结块动物。然而,在同一个缓冲区染色液孵化三个小时的动物防止染料染色的角质层(表1)。这可能是引起血脂线虫表面上被剥夺了在洗涤剂溶液治疗。潜伏期的动物DII污渍角质层的水,表明M9盐溶液不是DII角质层染色的要求。虽然水为基础的协议是神经元DII染色15的建议,我们发现,动物治疗这种方式往往出现不健康的。洗衣机在0.5%的动物简要Triton X - 100在M9的的,在染色液三个小时的孵化与M9的表皮结构,提供一致的染色和维护动物福祉。

动物可以获救后的观察和维护,允许直接下游分析。这种方法是一种方便的工具,它可以在许多研究中使用,包括但不限于,表皮的分泌和组织,表皮细胞的发育,heterochronic基因的途径,和线虫的演变。

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Disclosures

我们什么都没有透露。

Acknowledgments

我们要感谢S.塔内加- Bageshwar,K. Beifuss,S. Kedroske,和HC。萧为有益的讨论。这项工作是由从分子和细胞医学TAMHSC系的启动资金。该化合物的范围和旋转盘购部门和TAMHSC院长办公室提供的资金。一些菌株提供了线虫遗传学中心,这是由国家研究资源中心资助。 pRF4(ROL - 6(su1006))答:消防的礼物。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DiI (1,1’-Dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) Biotium, Inc. 60010 Stock dilution:
20 mg/mL in DMF
working dilution: 30 mg/mL
DMF (Dimethylformamide) Sigma-Aldrich D4551
Triton X-100 (Octylphenoxypolyethoxyethanol) VWR international EM-9410
M9 (22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1mM MgSO4)
NGM (Nematode growth medium) IPM Scientific, Inc. 11006-501 Can be prepared following NGM agar protocol18
Agar-agar EMD Millipore 1.01614 4% in water
Levamisole (Levamisole hydrochloride) Sigma-Aldrich 31742 100 μM - 1 mM levamisole as required
Microscope slides VWR international 16005-106
Microscope cover glasses VWR international 16004-302
Compound scope Carl Zeiss, Inc. A1m Use objectives to match the needs of the experiment
TRITC or other compatible filter Chroma Technology Corp. 49005 ET - DSRed (TRITC/Cy3) sputtered filter set

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References

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