Visualisierung von Caenorhabditis elegans Cuticle Strukturen mit der lipophilen Vital Dye, DiI

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Summary

Wir präsentieren eine Methode zur Nagelhaut in Live-Visualisierung

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Schultz, R. D., Gumienny, T. L. Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI. J. Vis. Exp. (59), e3362, doi:10.3791/3362 (2012).

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Abstract

Die Kutikula von C. elegans ist eine sehr widerstandsfähige Struktur, die das Äußere des Tieres 1-4 umgibt. Die Nagelhaut schützt nicht nur das Tier aus der Umwelt, sondern bestimmt auch Körperform und spielt eine Rolle in Motilität 4-6. Mehrere Schichten von epidermalen Zellen abgesondert umfassen die Kutikula, darunter eine äußerste Lipid-Schicht 7.

Umlaufende Stege in der Kutikula genannt Kreisringe Muster der Länge des Tieres und sind in allen Phasen der Entwicklung 8 vorhanden. Alae sind Längsrippen, die vorhanden sind während bestimmter Phasen der Entwicklung, darunter L1, Dauer, und adulte Stadien 2,9. Mutationen in Genen, die Kutikula Kollagen Organisation beeinflussen können alter Kutikula Struktur und tierischen Körper Morphologie 5,6,10,11. Während Kutikula Bildgebung mit Verbindung Mikroskopie mit DIC-Optik ist es möglich, aktuelle Methoden, die Highlight Kutikula Strukturen gehören FluoreszenzProzent Transgenexpression 12, Antikörper-Färbung 13 und Elektronenmikroskopie 1. Labeled Weizenkeimagglutinin (WGA) wurde ebenfalls verwendet, um Kutikula Glykoproteine ​​visualisieren, ist aber bei der Lösung von feineren Strukturen Kutikula 14 begrenzt. Die Färbung der Kutikula Oberfläche unter Verwendung von fluoreszierenden Farbstoff wurde beobachtet, aber nie im Detail 15 gekennzeichnet. Wir präsentieren eine Methode zur Nagelhaut in Live-C visualisieren elegans mit dem rot fluoreszierenden Farbstoff lipophil DiI (1,1 '-Dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine Perchlorat), die üblicherweise in C verwendet elegans zu visualisieren umwelt ausgesetzt Neuronen. Diese optimierte Protokoll für DiI Färbung ist eine einfache, robuste Methode für hochauflösende Fluoreszenz-Visualisierung von Ringen, alae, Vulva, männlichen Schwanz, und Hermaphroditen Tailspike in C. elegans.

Protocol

1. Vorbereitung der DiI Fleck

  1. Bereiten Sie eine Stammlösung von 20 mg / mL DiI (Biotium, Inc., Hayward, CA) in DMF. DiI ist lichtempfindlich, so schützen DiI von Licht durch das Einwickeln in Folie.
  2. Erstellen Sie ein Arbeitsverzeichnis Verdünnung von DiI durch Zugabe von 0,6 ul DiI Lager auf 399,4 ul M9 für jede Population. Dies sollte eine abschließende Arbeiten Verdünnung von 30 ug / mL DiI in M9. Dies kann bis zur Färbung mehrere Populationen gleichzeitig skaliert werden. Schild DiI von Licht durch Umwickeln des Rohres (s) in Folie.

2. Vorbereitung der Nematoden

  1. Verwenden Sie eine 60 mm Platte mit einer Bevölkerung von unberührten Nematoden. Wash Tiere von der Platte mit einer Lösung von 0,5% Triton X-100 in M9-Puffer durch vorsichtiges Schwenken Flüssigkeit in einer kreisförmigen Bewegung über die Oberfläche der Platte, alle Larven und ausgewachsene Tiere zu lockern. Transfer waschen in ein steriles 1,5 ml Tube.
  2. Sofort-Spin-Down der Tiere bei 2000 rpm für 30 sek. Entfernen und so viel sup verwerfenernatant wie möglich, ohne die Masse der Tiere am Boden des Röhrchens.
  3. Um die restlichen Triton X-100 zu reduzieren, spülen Tiere mit M9-Puffer, Spin und Überstand entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
  4. Add 400 ul arbeiten DiI-Lösung in M9 mit dem Rohr und kurz vortexen, um Tiere in der Lösung zu resuspendieren.
  5. Schütteln Rohr bei 20 ° C horizontal für 3 Stunden bei 350 rpm in einem Licht-geschützten Umgebung. Wenn gewünscht, können die Tiere bis zu 16 Stunden für die Färbung inkubiert werden.
  6. Zur Verringerung der Menge an ungebundenem Farbstoff, Spin-down der Tiere bei 2000 rpm für 20 sek. Entfernen und entsorgen Sie so viel Überstand wie möglich, ohne die Masse der Tiere.
  7. Resuspendieren Tiere in 400 ul M9-Puffer und gießen Flüssigkeit auf eine Bakterien-freie Teil einer NGM-Agar-Platte mit OP50 E. ausgesät coli. Erlauben Tiere mindestens 30 Minuten zu erholen. Während der Erholungszeit der Tiere sollte weg zu kriechen aus der DiI Färbung flüssig und auf das Essen. Dieser Schrittreduziert Hintergrundfluoreszenz aus freien DiI.

3. Montage und Beachtung Proben

  1. Melt 4% Agar in Wasser unter Verwendung eines Autoklaven oder eine Mikrowelle.
  2. Erstellen Sie wiederverwendbare Spacer, die verwendet werden, um gleichmäßige Dicke der Agar-Pad zu gewährleisten, kann durch Schichtung zwei Stücke von Labor-Band auf einem Glasträger. Machen Sie zwei spacer Dias insgesamt.
  3. Vereinbaren Sie einen sauberen Objektträger aus Glas zwischen zwei spacer Dias. Pipette etwa 150 ul (vier Tropfen) von geschmolzenem 4% Agar auf die Mitte des sauberen Objektträger aus Glas. Schnell die geschmolzenen Agar mit einer zusätzlichen Folie in einem Agar-Pad zu bilden. Entfernen Sie vorsichtig den Deckel gleiten, halten Sie das Pad auf der Oberseite der Halterung schieben zentriert.
  4. Pipette etwa 5 ul der Nematoden-Narkose (100 uM - 1 mM Levamisol, zum Beispiel) auf dem Pad.
  5. Montieren von 8 bis 12 Tieren in der Narkose und mit einem Mikroskop Deckglas.
  6. Beobachten Sie Tiere unter Verwendung einer Verbindung oder konfokalen Mikroskop mit mindestens einem 40x Objektivierung ausgestattet ve und DsRed / TRITC (oder einem anderen kompatiblen)-Filter. Die Fluoreszenzanregung maximal DiI ist 549 nm und dessen Emissionsmaximum liegt 565 nm für gebundene Farbstoff (Biotium, Inc., Hayward, CA).

4. Repräsentative Ergebnisse

DiI färbt die Nagelhaut von Wildtyp-und Mutanten-C elegans. Die Kutikula Oberfläche enthält Kreisringe durch umlaufende Rillen voneinander getrennt und in manchen Phasen, genannt Längsrippen alae. Jede Entwicklungsstufe hat Kutikula-Strukturen mit unterschiedlichen Zusammensetzungen 2. Ridges oder Furchen der beiden Nasenflügel und Kreisringe Fluoreszenz-Färbung, je nach Zusammensetzung der Oberfläche, während Larven und adulte Stadien und sichtbar bleiben bis zu einem Tag nach der Wiederherstellung mit dieser Methode. Hintergrund fluoreszierenden Flecken werden manchmal beobachtet (Abb. 2F, G), aber nicht routinemäßig (Abbildung 1, 2A-E, H, I). Alle Bilder wurden mit Spinning-Disk-konfokale oder, wenn vermerkt, Weitfeld (wf) Verbindung Mikroskopie genommen.

ENT "> Abbildung 1
Abbildung 1. DiI Flecken Nagelhaut und umweltfreundliche ausgesetzt Neuronen. L2 Bühne Tier. 630x Vergrößerung. Mosaic Bildteile wurden unter Verwendung iVision-Mac-Software (BioVision Technologies, Exton, PA). Die Bilder wurden trat mit Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems, Inc., San Jose, CA). Balken = 10 um. DiI auch fluoreszierend Flecken amphid und phasmid sensorischen Neuronen im Kopf und Schwanz bzw. (Pfeile markieren einige).

Abbildung 2
Abbildung 2. DiI fluoreszierend Flecken C. elegans Schuppenschicht auf allen Stufen der post-embryonale Entwicklung. 630x Vergrößerung. Balken = 10 um. Die Färbung von Wildtyp-Tieren in A) L1; B) L2; C) Dauer; D) L3; E) L4 und F) adulte Stadien. Die Alen und ringförmige Grate sind fluoreszierend in L1 und dauer Tiere gefärbt (A, C). DiI Flecken ringförmige Grate in L2 Tiere(B). Ringförmigen Furchen Fleck in L3 und L4 Tiere (D, E). Die Furchen der Nasenflügel und Kreisringe sind bei erwachsenen Tieren (FH) gefärbt. Alae bestehen aus zwei, fünf, oder drei Rippen (in L1, Dauer, oder Erwachsener Tiere), dass die Länge des Tieres (Pfeile) 16 laufen zusammen. Kreisringe erstellen umlaufende Stege rund um das Tier (Pfeilspitzen, F und J). Die Kutikula der Erwachsenenbildung mutierten Tiere Display moderate Kutikula Organisation Mängel (GH). G) Ridges von Alen sind diskontinuierliche (wf). H) Überzählige alae Grate sind verschmolzen und verzweigt oder gegabelt (wf). Collagen-Gen-Mutanten weisen Alen und ringförmige Organisation Mängel (IJ). I) In transgenen Tieren überexprimierenden pRF4 (rol-6 (su1006)), Kämme alae liegen in einem Winkel zu der Länge des Tieres. J) Kreisringe in transgenen Tieren überexprimierenden pRF4 (rol-6 (su1006)) Display ein unregelmäßiges Muster.

Abbildung 3
Abbildung 3. External morphologischen Strukturen sind durch DiI Färbung beleuchtet. 630x Vergrößerung. Maßstabsbalken = 10 pm. DiI hebt auch andere äußere Merkmale, darunter A) erwachsene Hermaphrodit Vulva, B) erwachsenen männlichen Schwanz Strahlen und Lüfter, und C) Zwitter Tailspike (forked in dieser Mutante Hintergrund).

Abbildung 4
Abbildung 4. Cuticle länger dauert, bis mit DiI als umweltfreundliche ausgesetzt Neuronen Fleck. 630x Vergrößerung. Balken = 10 um. Nach zwei Stunden nach dem Färben sind amphid (nicht dargestellt) und phasmid sensorischen Neuronen (Pfeile) ausreichend gefärbt. Im Gegensatz dazu ist die Kutikula der jüngeren Tieren nur teilweise in Patches (Pfeilspitze) gefärbt.

Waschen Stain-Lösung (+ DII) Inkubationszeit Cuticle gebeizt
M9 + 0,5% Triton X-100 M9 + 0,5% Triton X-100 2 Stunden nicht
M9 + 0,5% Triton X-100 M9 + 0,5% Triton X-100 3 Std. nicht
M9 + 0,5% Triton X-100 M9 2 Stunden teilweise
M9 + 0,5% Triton X-100 M9 3 Std. ja
M9 + 0,5% Triton X-100 H 2 0 2 Stunden teilweise
M9 + 0,5% Triton X-100 H 2 0 3 Std. ja

Tabelle 1. Kutikula Färbung unter verschiedenen Bedingungen. Various Inkubationslösungen und Zeiten wurden getestet, um Kutikula Färbung der Tiere zu optimieren. H 2 0, sterilem, destilliertem Wasser. Teilweise Färbung zeigt fleckige Färbung Larvencuticula (Abbildung 4), obwohl erwachsene Nagelhaut Flecken consistently.

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Discussion

Die DiI Färbung hier vorgestellte Methode ermöglicht eine relativ schnelle und bequeme Möglichkeit, um die Schuppenschicht in C. elegans zu visualisieren. Durch Wiederverwendung und Optimierung eines Verfahrens gemeinhin Bild umwelt ausgesetzt sensorischen Neuronen 15,17 verwendet wird, kann DiI verwendet werden, um Fluoreszenz-Färbung sowohl Alen und ringförmige Strukturen (Abbildungen 1 und 2) sowie der Vulva, männlichen Schwanz, und Hermaphroditen Tailspike werden (Abbildung 3). Wir haben festgestellt, dass die Inkubationszeit Lösung und Zeit beeinflussen die Fähigkeit der DiI konsequent Fleck der Oberhaut (Tabelle 1, Abbildung 4). Die Methode für die DiI Färbung umweltfreundliche ausgesetzt Neuronen verwendet eine Zwei-Stunden Inkubationszeit in M9 mit Triton X-100 15. Eine erste Wäsche des M9 mit dem Tensid Triton X-100 hilft bei der Entfernung Verunreinigungen aus der Kutikula Oberfläche und verhindert die Tiere aus verklumpen. Allerdings Inkubation der Tiere 3 Stunden in einer Färbelösung in dem gleichen Puffer verhindert, dass der Farbstoff aus der Färbung der Oberhaut (Tabelle 1).Dies kann durch Lipide auf dem Fadenwurm Oberfläche durch die längere Behandlung in der Reinigungslösung entfernt verursacht werden. Die Inkubation von Tieren in Wasser mit DiI färbt die Nagelhaut, was darauf hinweist, dass die M9 Salz-Lösung ist nicht für DiI Färbung der Kutikula benötigt. Obwohl ein auf Wasser basierendes Protokoll für die neuronale DiI Färbung 15 Empfohlene ist, finden wir, dass die Tiere behandelt diese Weise erscheinen oft ungesund. Washing Tiere kurz in 0,5% Triton X-100 in M9, durch eine dreistündige Inkubation in Färbelösung mit M9 gemacht gefolgt, liefert konsistente Färbung der Kutikula-Strukturen und pflegt das Wohlbefinden der Tiere.

Tiere können nach Beobachtung gerettet und gepflegt werden, die einen unmittelbaren Downstream-Analysen. Diese Methode ist ein praktisches Tool, dass in vielen Studien verwendet werden können, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Kutikula-Sekretion und-organisation, Epidermiszelle Entwicklung, heterochronische Gen Wege und Nematoden Entwicklung begrenzt.

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Disclosures

Wir haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Wir möchten S. Taneja-Bageshwar, K. Beifuss, S. Kedroske und HC danken. Hsiao für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde durch eine Anschubfinanzierung aus dem TAMHSC Department of Molecular and Cellular Medicine finanziert. Die Verbindung Umfang und drehende Scheibe wurden mit Mitteln der Abteilung und des TAMHSC Dekanat vorgesehen erworben. Einige Stämme wurden von den Caenorhabditis Genetics Center, das vom National Center for Research Resources finanziert wird. pRF4 (rol-6 (su1006)) war ein Geschenk von A. Fire.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DiI (1,1’-Dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) Biotium, Inc. 60010 Stock dilution:
20 mg/mL in DMF
working dilution: 30 mg/mL
DMF (Dimethylformamide) Sigma-Aldrich D4551
Triton X-100 (Octylphenoxypolyethoxyethanol) VWR international EM-9410
M9 (22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1mM MgSO4)
NGM (Nematode growth medium) IPM Scientific, Inc. 11006-501 Can be prepared following NGM agar protocol18
Agar-agar EMD Millipore 1.01614 4% in water
Levamisole (Levamisole hydrochloride) Sigma-Aldrich 31742 100 μM - 1 mM levamisole as required
Microscope slides VWR international 16005-106
Microscope cover glasses VWR international 16004-302
Compound scope Carl Zeiss, Inc. A1m Use objectives to match the needs of the experiment
TRITC or other compatible filter Chroma Technology Corp. 49005 ET - DSRed (TRITC/Cy3) sputtered filter set

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References

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