Lipídic Bicelle विधि का प्रयोग झिल्ली प्रोटीन की उच्च throughput Crystallization

Biology

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Summary

Bicelles लिपिड / amphiphile मिश्रण है कि एक लिपिड bilayer के भीतर झिल्ली प्रोटीन (सांसदों) को बनाए रखने, लेकिन अद्वितीय चरण व्यवहार है कि crystallization रोबोटों द्वारा उच्च throughput स्क्रीनिंग की सुविधा है. इस तकनीक को सफलतापूर्वक दोनों prokaryotic और यूकेरियोटिक स्रोतों से उच्च संकल्प संरचनाओं के एक नंबर का उत्पादन किया. इस वीडियो lipídic bicelle मिश्रण पैदा bicelle मिश्रण में सांसदों को शामिल माध्यम से crystallizations (मैन्युअल रूप में अच्छी तरह के रूप में robotically) परीक्षण और कटाई क्रिस्टल स्थापित करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है.

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Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method. J. Vis. Exp. (59), e3383, doi:10.3791/3383 (2012).

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Abstract

Protocol

I) एक bicelle बनाने लिपिड की तैयारी:: Bicelle आधारित crystallization चार बुनियादी कदम (चित्रा 2) के शामिल है, ii) bicelle माध्यम में प्रोटीन शुद्ध का समावेश, iii) crystallization परीक्षण (मैन्युअल रूप से या robotically), amphiphile मिश्रण और iv) दृश्य, क्रिस्टल निष्कर्षण और ठंड. इन चरणों में विस्तार से नीचे वर्णित हैं

1. Bicelles की तैयारी

Amphiphile संयोजन और सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला पर: Bicelles लिपिड की एक किस्म में फार्म कर सकते हैं. इसलिए, एक प्रारंभिक संरचना आधारित पिछले सफल पर (1 टेबल) की सिफारिश की शर्तों है. CHAPSO bicelle तैयार है, जो या तो एक premixed तैयार तैयार करने के लिए उपयोग के रूप में वाणिज्यिक कर सकते हैं खरीदा जा (नीचे अभिकर्मकों तालिका देखें) या प्रयोगशाला के रूप में वर्णित में तैयार: सबसे सफल मिश्रण DMPC है. एक 2.8:1 दाढ़ अनुपात में CHAPSO मिश्रण: इस अभ्यास के लिए हम 35% DMPC के एक मिलीलीटर तैयार करेंगे.

  1. bicelle प्रतिशत के बीच 10% -40% के साथ भिन्न हो सकते हैं एक DMPC: CHAPSO दाढ़ अनुपात 2.6-3.0:1 (तालिका 1) से लेकर.
  2. नोट: उच्च bicelle एकाग्रता और अधिक कठिन है, यह करने के लिए एक उच्च चिपचिपापन समाधान में जिसके परिणामस्वरूप लिपिड भंग है. हालांकि, एक केंद्रित bicelle तैयार फायदेमंद है जब प्रोटीन एकाग्रता कम किया जा सकता है.
  3. लिपिड भंग करने के लिए एक समरूप समाधान प्राप्त करने के काफी प्रयास की आवश्यकता है, इस कदम के सबसे bicelle विधि में समय लगता बनाने. DMPC जब तक निम्न चरणों के माध्यम से साइकिल पूरी तरह से मिश्रित है:
    1. मिश्रण गर्म ~ 40 डिग्री सेल्सियस का उपयोग कर एक पानी स्नान या ~ 1 मिनट के लिए एक मशीन और भंवर.
      • नोट: के रूप में और अधिक चक्र बाहर किया जाता है, मिश्रण वार्मिंग जेल की तरह चुनाव में परिणाम होगायह मुश्किल भंवर बनाने sistency.
    2. और कुछ मिनट के लिए बर्फ भंवर पर मिश्रण अच्छा है. शीतलक में मदद करता है यह भंवर के लिए आसान बनाने के समाधान दव्र बनाना.
      • नोट: के रूप में और अधिक चक्र प्रदर्शन कर रहे हैं, मिश्रण ठंडा पर बादल बन सकता है.
    3. ऊपर सूचीबद्ध (1.2.1 और 1.2.2) जब तक लिपिड पूरी तरह भंग है चरणों को दोहराएँ.
      • नोट: इस प्रक्रिया में कई घंटे लग सकते हैं. CHAPSO तैयार: Bicelle गठन DMPC के चरण व्यवहार में परिवर्तन के संकेत दिया है. पूरा होने पर, मिश्रण में या कमरे के तापमान के ऊपर एक स्पष्ट जेल और बर्फ पर एक चिपचिपा तरल हो जाएगा.
  4. अब bicelle मिश्रण का उपयोग करने के लिए तैयार है और -20 डिग्री सेल्सियस पर लंबी अवधि के भंडारण (5 साल) के लिए रखा जा सकता है. फॉस्फोलिपिड सिर समूह की hydrolysis के जोखिम के कारण, यह सलाह विस्तारित अवधि के लिए कमरे के तापमान पर bicelles दुकान नहीं है.

2. प्रोटीन की bicelles में निगमन

अधिकांश सांसद bicelles से प्राप्त संरचनाओं DMPC में सघन गया: CHAPSO bicelle 2 से 8% से लेकर एकाग्रता 8 से 12 मिलीग्राम / एमएल (1 टेबल) के एक प्रोटीन एकाग्रता का उपयोग कर. यदि संभव हो तो, प्रारंभिक स्क्रीन इन दिशानिर्देशों का उपयोग करें और अतिरिक्त सांद्रता अनुकूलन स्तर पर जांच किया जा सकता है है चाहिए. LCP विधि की तुलना में, bicelles साथ प्रोटीन निगमन (चित्रा 3) एक साधारण प्रक्रिया है, जो उसी दिन crystallization परीक्षण के रूप में किया जाना चाहिए है .

  1. पहले गला लें DMPC: CHAPSO bicelle मिश्रण कमरे के तापमान पर जब तक एक स्पष्ट जेल चरण परिवर्तन.
    • नोट: एकाधिक - फ्रीज thaws bicelle व्यवहार को प्रभावित नहीं करेगा.
  2. Liquify और संक्षिप्त करने के लिए एक समरूप bicelle चरण पैर जमाने भंवर बर्फ पर मिश्रण रखें. जब बर्फ पर रखा मिश्रण बादल बन सकता है.
  3. फादरओम इस बिंदु पर रखने के लिए, bicelle मिश्रण और बर्फ पर शुद्ध प्रोटीन. यह एक तरल चरण में यह pipetting के लिए उत्तरदायी बनाने bicelle रखेंगे.
  4. शुद्ध 01:04 अनुपात (वी / वी) में प्रोटीन डिटर्जेंट solubilized bicelle मिश्रण जोड़ें.
    • उदाहरण के लिए: 100 μl मिश्रण प्रोटीन bicelle 20 μl bicelle के साथ 80 μl प्रोटीन मिश्रण द्वारा प्राप्त की है. यदि प्रोटीन एकाग्रता 15 मिलीग्राम / एमएल है और bicelle एकाग्रता 35% है, यह 12 मिलीग्राम / एमएल के एक प्रोटीन एकाग्रता और 7% की bicelle एकाग्रता के साथ एक प्रोटीन bicelle शामिल मिश्रण दे देंगे.
  5. धीरे सामग्री pipetting ऊपर और नीचे जब तक स्पष्ट और समरूप समाधान हो जाता है के द्वारा मिक्स.
    • नोट: यदि बुलबुले दिखाई देते हैं, एक tabletop अपकेंद्रित्र के साथ एक त्वरित स्पिन (30-60 सेकंड, 13000 rpm, 4 डिग्री सेल्सियस) की मदद कर सकते हैं उन्हें हटाने के लिए .
  6. बर्फ पर कम से कम 30 मिनट के लिए मिश्रण करने के लिए प्रोटीन int के पूरा समावेश को बढ़ावा देने के सेतेओ bicelles. अब मिश्रण प्रोटीन - bicelle crystallization परीक्षण के लिए तैयार है.

3. Crystallization परीक्षण की स्थापना

LCP जैसे अन्य लिपिड crystallization तकनीक मध्यम उच्च चिपचिपाहट की वजह से विशेष उपकरण की आवश्यकता, लेकिन bicelles का अनूठा चरण व्यवहार वस्तुतः किसी भी मानक crystallization रोबोटिक्स (चित्रा 3) सहित प्रारूप में कार्यान्वयन परमिट. Crystallization परीक्षणों या तो फांसी या ड्रॉप मानक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्क्रीन का उपयोग स्वरूपों में बैठे बाहर किया जा सकता है.

  1. स्थापना ट्रे मैन्युअल रूप से या एक crystallization रोबोट का उपयोग चाहे, बर्फ पर मिश्रण प्रोटीन bicelle बनाए रखें. यह प्रोटीन bicelle मिश्रण ठंडा रखने और सुनिश्चित करें कि समाधान का चिपचिपापन कम है.
  2. मैनुअल परीक्षण Crystallization - एक मानक विंदुक का प्रयोग, प्रोटीन - bicelle मिश्रण में एक ही तरीके से जलाशय समाधान के साथ मिश्रित किया जा सकता है के रूप में सामान्य प्रदर्शनघुलनशील या डिटर्जेंट - solubilized झिल्ली प्रोटीन के लिए एड.
    • नोट: बर्फ पर परीक्षण के दौरान प्रोटीन - bicelle मिश्रण रखें .
  3. रोबोट Crystallization परीक्षण - हम इन परीक्षणों मच्छर crystallization रोबोट के लिए सिलवाया है, लेकिन सिद्धांत रूप में (एक ही सावधानियों का पालन) तकनीक सभी crystallization रोबोट्स के साथ संगत होना चाहिए . निम्नलिखित युक्तियाँ सुनिश्चित करेगा कि प्रोटीन - bicelle मिश्रण ठंडा रहता है और सही रोबोट द्वारा pipetted:
    1. Precool यह बर्फ पर रखकर मिश्रण प्रोटीन - bicelle पकड़े थाली.
    2. थाली में मिश्रण प्रोटीन - bicelle पिपेट और बर्फ पर थाली रखने के लिए जारी है. यह प्लेट रन आरंभ करने से पहले रोबोट पर जाने के लिए पिछले आइटम होना चाहिए.
    3. मंच 3 और 5 पर जलाशय ट्रे और crystallization lids क्रमशः मच्छर रोबोट के ऊपर सेट.
    4. 4 मंच पर प्रोटीन bicelle मिश्रण युक्त थाली प्लेसमच्छर रोबोट की. यह भरोसा दिलाते हैं मिश्रण प्रोटीन - bicelle रोबोट द्वारा उठाया जा आखरी है और इसे तुरंत जारी है.
    5. हीटिंग और वृद्धि की चिपचिपाहट को रोकने के लिए, प्रोटीन bicelle मिश्रण के साथ जलाशय मिश्रण नहीं है.
    6. जब एकाधिक स्क्रीन प्रदर्शन के रूप में जल्द ही ठंडा है के रूप में एक रन पूरा हो गया है के लिए तुरंत बर्फ bicelle प्रोटीन की थाली वापस.
  4. पारंपरिक crystallization परीक्षण के लिए ड्रॉप मात्रा और अनुपात (प्रोटीन: जलाशय) के रूप में चुना जा सकता है है. उदाहरण के लिए, प्रारंभिक क्रिस्टल मच्छर रोबोट का उपयोग कर परीक्षण स्थापित किया जा सकता है है .25 μl प्रोटीन का उपयोग: bicelle मिश्रण प्लस 0.25 μl जलाशय.
  5. 20 पर एक कक्ष में क्रिस्टल परीक्षण सेते डिग्री सेल्सियस तापमान एक अच्छा स्क्रीनिंग और अनुकूलन पैरामीटर है क्योंकि bicelles के चरण व्यवहार तापमान निर्भर है.
    • उच्च तापमान तहदार चरण 12 (चित्रा 1) है, जो पूर्व आयोजन का लाभ प्रेरितपरतों में प्रोटीन. 20 से नीचे तापमान डिग्री सेल्सियस, जांच की जा सकता है, लेकिन आप 4 से नीचे नहीं जा ° सी इस के बाद से लिपिड समय की विस्तारित अवधि से अधिक वेग के कारण हो सकता है चाहिए.
  6. पारंपरिक crystallization परीक्षण के रूप में एक ही तरीके में, bicelle परीक्षण क्रिस्टल उपस्थिति और विकास के लिए एक नियमित आधार पर निगरानी की जानी चाहिए. हम 1 सेंट और 3 Rd दिन बाद सेटअप साप्ताहिक निरीक्षण के द्वारा पीछा किया पर ट्रे की जांच की सलाह देते हैं.
  7. क्रिस्टल अनुकूलन किया जा सकता है नियमित रूप से ग्रिड स्क्रीनिंग, additive स्क्रीनिंग, तापमान आदि इसके अतिरिक्त बदलने, bicelle प्रतिशत और प्रोटीन सहित डिटर्जेंट आधारित क्रिस्टल के लिए इस्तेमाल किया तरीकों का उपयोग कर: bicelle अनुपात अलग किया जा सकता है. इसके अलावा, bicelles विशिष्ट lipids कि प्रोटीन स्थिरता या समारोह के लिए आवश्यक हो सकता है के साथ doped किया जा सकता है है.

4. विज़ुअलाइज़ेशन, क्रिस्टल निष्कर्षण और ठंड

प्रोटीन bicelle मिश्रण के साथ क्रिस्टल परीक्षण के बाद से एक प्रोटीन डिटर्जेंट बूँदें, दृश्य और क्रिस्टल निकासी के लिए इसी तरह की चिपचिपाहट दिनचर्या है और पारंपरिक सेट अप की तरह बाहर किया जाता है.

  1. विज़ुअलाइज़ेशन: LCP मीडिया कि अक्सर क्रिस्टल का पता लगाने के लिए सामान्य और polarized प्रकाश के तहत उच्च गुणवत्ता रोशनी की आवश्यकता के विपरीत में, दृश्य bicelles द्वारा रुकावट नहीं है. रंगीन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बेरंग प्रोटीन क्रिस्टल बूँदें आसानी से मानक सूक्ष्मदर्शी और कोई विशेष उपकरणों की आवश्यकता है का उपयोग विश्लेषण कर सकते हैं.
  2. Bicelles अन्य lipídic मीडिया की तरह, झूठी सकारात्मक की एक उच्च प्रतिशत का उत्पादन करते हैं. एक यूवी खुर्दबीन बहुत नमक क्रिस्टल (चित्रा 4) से प्रोटीन फर्क में मदद करता है.
  3. निष्कर्षण और बर्फ़ीली: क्रिस्टल निष्कर्षण और ठंड अपेक्षाकृत सरल है और आसपास bicelle मीडिया के विघटन की आवश्यकता नहीं है. इसके अतिरिक्त, bicelle चरण में ही कुछ उदारवादी क्रायो संरक्षण प्रदान करता है.

5. प्रतिनिधि परिणाम:

nt "> यह आम तौर पर क्रिस्टल के लिए 2-3 दिन लगते हैं दिखाई देते हैं और उन्हें अपने अधिकतम आकार को बढ़ने के लिए लगभग एक सप्ताह या उससे अधिक यह bacteriorhodopsin और माउस आयनों वोल्टेज पर निर्भर 1 चैनल (mVDAC1) क्रिस्टल 4,8 के लिए मामला था . अन्य झिल्ली प्रोटीन के लिए यह कई हफ्तों के क्रिस्टल विकास के लिए ले, तो कर सकते हैं यह महत्वपूर्ण है के लिए पहले सप्ताह से परे अच्छी तरह से क्रिस्टल परीक्षण की निगरानी जारी है.

अन्य lipídic मीडिया के साथ के रूप में, bicelles आकृतियों में प्रकट हो सकता है कि क्रिस्टलीय हो के रूप में करते हैं. यह भी देखा गया है कि वे नमक और डिटर्जेंट क्रिस्टल की एक उच्च प्रतिशत करने के लिए नेतृत्व. यूवी खुर्दबीन कि tryptophan प्रतिदीप्ति का पता लगाता है है काफी मदद कर सकते हैं. ऐसे गैर प्रोटीनीय झूठी सकारात्मक समाप्त चित्रा 4 लिपिड आकार, नमक और प्रोटीन क्रिस्टल के रूप में दिखाई और यूवी प्रकाश में देखा मदद करने के लिए अलग परिणाम मनाया जा सकता है भेद से पता चलता है.

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चित्रा 1 Bicelle योजनाबद्ध. Bicelles DMPC (नीला) और CHAPSO (हरा), जो bilayer के हाइड्रोफोबिक किनारों की रक्षा के रूप में एक amphiphile जैसे bilayer बनाने लिपिड अणु बना रहे हैं. के रूप में तापमान बढ़ जाती है, डिस्क की तरह bicelles एक छिद्रित तहदार पत्रक 12 के एक चरण में परिवर्तन से गुजरना.

चित्रा 2
चित्रा 2 bicelle crystallization चार बुनियादी कदम रूपरेखा विधि के लिए फ़्लोचार्ट.

चित्रा 3
चित्रा 3 क्रिस्टल परीक्षण योजनाबद्ध सेट अप. शुद्ध डिटर्जेंट solubilized झिल्ली प्रोटीन सीधे बस सामग्री एक साथ pipetting द्वारा बर्फ पर bicelles के साथ मिलाया जा सकता है. ~ 30 मिनट, crystallization परीक्षण के लिए बर्फ पर मिश्रण / प्रोटीन bicelle incubating के बादसेट किया जा सकता रोबोटिक्स सहित किसी भी मानक प्रारूप का उपयोग कर.

चित्रा 4
चित्रा 4 क्रिस्टल परीक्षण के विज़ुअलाइज़ेशन. दर्शनीय (शीर्ष पैनल) (ए) सुई के आकार का नमक केवल एक शर्त में मनाया क्रिस्टल और यूवी छवि छवि (नीचे के पैनल). कोई प्रतिदीप्ति क्रिस्टल से पता लगाया जा सकता है, झूठी सकारात्मक का एक संकेत है. (बी) रॉड के आकार का क्रिस्टल एक एमपीडी हालत में गठित. क्रिस्टल कमजोर fluoresced लेकिन गैर - प्रोटीनीय एक्स - रे विवर्तन का उपयोग कर पाया था. (सी) क्रिस्टल परीक्षणों की स्थापना के बाद के बारे में चार सप्ताह मनाया. पराबैंगनी प्रकाश के तहत मजबूत प्रतिदीप्ति पुष्टि की है कि यह एक प्रोटीन क्रिस्टल है.

नहीं. प्रोटीन स्रोत Bicelle निरूपण Concentrati प्रोटीनपर 1 डिटर्जेंट संकल्प (A) संदर्भ
1 2 Bacteriorhodopsin Halobacterium salinarum 8% DMPC: CHAPSO (2.8:1) 8 मिलीग्राम / एमएल 2.0 Faham और बॉवी, 2002
8% DTPC: CHAPSO (3:1) 8 मिलीग्राम / एमएल 1.8 Faham एट, 2005 अल.
2 β2-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर / फैब जटिल मानव - जाति 8.3% DMPC: CHAPSO (3:1) 10 मिलीग्राम / एमएल DDM 3.4/3.7 रासमुसेन अल एट, 2007
3 वोल्ट निर्भर आयनों 1 चैनल मुसलमानों मस्कुलस 7% DMPC: CHAPSO (2.8:1) 12 मिलीग्राम / एमएल LDAO 2.3 Ujwal एट अल, 2008
4 Xanthorhodopsin Salinibacter Ruber 4.2% DMPC, 5% NM 4 मिलीग्राम / एमएल DDM 1.9 Luecke एट अल, 2009.
5 विषमकोण protease Escherichia कोलाई 2% DMPC: CHAPSO (2.6:1) 9 मिग्रा / मिली Nonyl glucoside 1.7 Vinothkumar, 2011

1 झिल्ली प्रोटीन शुद्धीकरण के लिए इस्तेमाल किया डिटर्जेंट
बैंगनी झिल्ली से 2 मूल निवासी लिपिड शुद्धि के दौरान साथ किया जा सकता है

तालिका 1. झिल्ली प्रोटीन संरचनाओं के लिए crystallization की स्थिति का सारांश bicelles का उपयोग कर हल.

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Discussion

Bicelles एक अद्वितीय lipídic मीडिया है कि एक देशी bilayer की तरह पर्यावरण की पेशकश करते हुए बर्ताव के रूप में यदि डिटर्जेंट द्वारा solubilized हैं. इस संपत्ति bicelles अन्य लिपिड आधारित crystallization तरीकों पर एक विशिष्ट लाभ देता है के बाद से वहाँ नहीं सीखने की अवस्था या विशेष इस तकनीक के लिए आवश्यक उपकरण है. एक बार bicelles उपलब्ध हैं, या तो वाणिज्यिक या प्रयोगशाला में तैयार किया है, वे सीधे मिश्रित प्रोटीन शुद्ध के साथ और इस बात से crystallization परीक्षण में लगभग बिल्कुल के रूप में मानक डिटर्जेंट आधारित प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ना पर किया जा सकता है. इसके अलावा, bicelles कई व्यावहारिक विस्तारित अवधि के भंडारण, प्रोटीन के सरल निगमन, उच्च throughput क्षमता मानक रोबोटिक्स और नियमित दृश्य और क्रिस्टल निष्कर्षण का उपयोग सहित अन्य तकनीकों की तुलना में लाभ, प्रदान करते हैं. एक अन्य विशिष्ट लाभ अनुकूलन के लिए विशिष्ट लिपिड के साथ डोप bicelles करने की क्षमता है या अगर ब्याज की प्रोटीन के लिए लाभप्रद दिखाया. साथ में ले ली, लिपिडीआईसी bicelle विधि संयोजन में व्यावहारिक आसानी के उपयोग के साथ काफी बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करता है, यह आसानी से सभी झिल्ली प्रोटीन crystallization परियोजनाओं के लिए ग्रहणीय बनाने.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम डीआरएस धन्यवाद देना चाहूंगा. जेम्स बॉवी और bicelle विधि और डा. अवीव पाज़ पर उपयोगी विचार - विमर्श के लिए तकनीकी विशेषज्ञता और मार्गदर्शन प्रदान करने के लिए सलेम Faham. हम समर्थन के लिए प्रयोगात्मक ले दू स्वीकार करते हैं. रचना Ujwal MemX बायोसाइंसेज LLC, जो, हालांकि, इस काम का समर्थन नहीं किया में वित्तीय हित है. इस काम के हिस्से में एनआईएच (GM078844 RO1) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMPC Affymetrix D514
CHAPSO Affymetrix C317
Ready-to-use Bicelles MemX Biosciences MX201001/MX201002
Crystallization Screens Qiagen, Hamptop Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience Standard commercially available screens can be used for initial screening
Crystallization Set-up Standard manual and/or robotic set-up available in lab can be used.

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References

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