विखंडन खमीर के मात्रात्मक लाइव सेल विश्लेषण प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

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विखंडन खमीर,

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Bjerling, P., Olsson, I., Meng, X. Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast. J. Vis. Exp. (59), e3454, doi:10.3791/3454 (2012).

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Abstract

Protocol

1. विखंडन खमीर संस्कृति

  1. एडिनबर्ग मिनिमल (ईएमएम) मीडिया और ammoniumchloride बिना ईएमएम (ईएमएम - एन) 8 तैयार करें. Autofluorescence कम ग्लूकोज समाधान है, लेकिन नहीं किया जा autoclaved बजाय एक 0.2 फिल्टर और बाद में autoclaved मीडिया को जोड़ा सुक्ष्ममापी फिल्टर का उपयोग निष्फल होना चाहिए.
  2. टीका लगाना विखंडन खमीर कोशिकाओं हौसले एक अगर प्लेट पर अमीर मीडिया के साथ हो, YEA 8 फिल्टर निष्फल ग्लूकोज के साथ ईएमएम तरल मीडिया के 3 एमएल में,. एक हल्के टोपी पर धकेल दिया कोशिकाओं के अच्छा वेंटीलेशन सुनिश्चित करने के साथ 13mL ट्यूब का प्रयोग करें. चलो कोशिकाओं 225 rpm के साथ उन्हें 30 में झटकों से बढ़ने डिग्री सेल्सियस कोशिकाओं लॉग चरण में बढ़ रखें (1 एक्स 10 6 - 2 10 एक्स 7 कोशिकाओं / एमएल) 2 दिनों के लिए उन्हें गिनती एक Burker कक्ष का उपयोग करके उपयुक्त कमजोर पड़ने, हर सुबह और शाम तक पीछा किया.
  3. प्रयोग के दिन जल्दी लॉग चरण, 5 में कोशिकाओं के लिए सुनिश्चित करें कि 10 एक्स 6 - 1 एक्स 7 कोशिकाओं 10 / एमएल.
  4. टी भूखाईएमएम मीडिया से 20 मिनट ईएमएम - एन मीडिया पर स्विच करने के दौरान वह नाइट्रोजन के लिए कोशिकाओं. यह एक 1.5 एमएल Eppendorf ट्यूब में एक तेज गति पर centrifugation के रूप में एक बेंच अधिकतम 1.5 आरसीएफ में शीर्ष अपकेंद्रित्र में कोशिकाओं के 3 मिलीलीटर कटाई द्वारा किया जाता है विखंडन खमीर 9 में तनाव प्रतिक्रिया पैदा हो सकता है. डबल कताई तकनीक, जिसका अर्थ है का उपयोग करें, 2 मिनट के लिए पहले स्पिन, तो Eppendorf 180 ट्यूब बारी ° और 1.5 आरसीएफ 2 10 मिनट के लिए फिर से स्पिन. यह ट्यूब के नीचे एक गोली में सभी कोशिकाओं को इकट्ठा करने में मदद करता है. ईएमएम - एन के साथ एक बार धो लें और फिर ईएमएम - एन में गोली भंग करने और 30 में 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते · सी 225 rpm पर मिलाते और तब बिंदु 2 के लिए जारी है. नमूना तैयार.

2. नमूना तैयार

  1. फसल काटने वाले कक्षों की एक तेज गति पर centrifugation के रूप में एक बेंच अधिकतम 1.5 आरसीएफ में शीर्ष अपकेंद्रित्र में 1.5 एमएल Eppendorf ट्यूब में 1.5 एमएल विखंडन खमीर 9 में तनाव प्रतिक्रिया पैदा हो सकता है. डबल कताई तकनीक, meani का उपयोग करेंएनजी, पहली 2 मिनट के लिए स्पिन, तो Eppendorf 180 ट्यूब बारी ° और फिर 2 10 मिनट के लिए 1.5 आरसीएफ के लिए स्पिन. यह ट्यूब के नीचे एक गोली में सभी कोशिकाओं को इकट्ठा करने में मदद करता है.
  2. निकालें सतह पर तैरनेवाला, लेकिन 10-15 μL छोड़ और शेष मीडिया में कोशिकाओं resuspend. वैकल्पिक रूप से ताजा मीडिया के 10 μL जोड़ने सेल गोली resuspend.
  3. स्पष्ट गिलास स्लाइड और गिलास को कवर (1.5 नहीं) के लिए सुनिश्चित करें. आम तौर पर आप उन्हें साफ नहीं है, लेकिन वे धूल से भरा नहीं कर रहे हैं सुनिश्चित करें.
  4. फ्रीजर से बाहर 1mg/mL लेक्टिन के एक शेयर के समाधान है कि फिल्टर निष्फल गया है की एक विभाज्य ले लो. लेक्टिन समाधान refrozen हो एक बार कुछ कर सकते हैं. लेक्टिन कवर गिलास में खमीर कोशिकाओं को ठीक करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
  5. प्लेस उद्देश्य कांच पर फ़िल्टर निष्फल ग्लूकोज के साथ 5 ईएमएम की μL.
  6. कवर कांच के कोने में लेक्टिन समाधान के 5 μL रखें. इसके बाद उसी कोने में सेल संस्कृति के 5 μL जगह लेक्टिन ड्रॉप में अर्थात्. एक बार कुछ pipetting और तब से मिक्स विंदुक टिप के लंबे पक्ष का उपयोग द्वारा संस्कृति लेक्टिन मिश्रण सेल कवर गिलास भर फैल गया. अपने सेल मिश्रण के घनत्व के आधार पर सब कुछ छोड़ने के लिए या कवर कांच के विपरीत कोने में अतिरिक्त तरल चूसना.
  7. कांच कवर, शीर्ष अप, उद्देश्य और बेंच पर दूसरी तरफ कांच पर एक पक्ष के साथ रखें. चलो कवर गिलास एक कुछ मिनट के लिए एक छोटे से सूखी. यह बिल्कुल हो सकता है, नहीं किया जाना चाहिए पूरी तरह से सूखे, लेकिन यह कांच पर बहुत अधिक तरल नहीं होना चाहिए.
  8. उद्देश्य गिलास से एक अनुमानित 70 ईएमएम के ड्रॉप द्वारा ° दूत के साथ कवर गिलास रखें. चलो कवर कांच के चलते इतना है कि यह शीर्ष ईएमएम के ड्रॉप में नीचे गिर जाएगी.
  9. सिलिकॉन तेल के साथ किनारों मुहर के लिए एक 2 एमएल सिरिंज तैयार करते हैं. 200 μl टिप की व्यापक अंत कट और सिरिंज के लिए देते हैं. सिलिकॉन तेल के लगभग 1 एमएल के साथ सिरिंज भरें. सिलिकॉन के एक लाइन ठीक धीरे मवाद द्वारा कवर कांच के किनारों को लागू किया जाता हैहिंग सिरिंज के पिस्टन. अब तुम एस के एक छोटे से वृद्धि चैम्बर pombe कोशिकाओं.

3. माइक्रोस्कोपी

  1. पारा क्सीनन दीपक / खुर्दबीन और कंप्यूटर पर मोड़ प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी initialise. प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी में खमीर विकास चैम्बर रखें. एक 63 एक्स उद्देश्य या एनए के साथ एक 100 एक्स 1.3 = या उच्चतर उद्देश्य का उपयोग करें. यदि एक तेल उद्देश्य प्रयोग किया जाता है, तेल जोड़ें.
  2. उज्ज्वल क्षेत्र का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं को खोजने के लिए और एक तेज तस्वीर मिल.
  3. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए सेटिंग करने के लिए खमीर कोशिकाओं और खुर्दबीन लेबल किया fluorochromes के आधार पर बदलती हैं. हम योजना Apochromat 16 लाइन औसत विमान स्कैन सेटिंग के साथ 63x तेल उद्देश्य लेंस (एनए = 1.4) के साथ एक confocal सूक्ष्मदर्शी Zeiss LSM 700 लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करें. pinhole 1-1.1 हवादार इकाइयों, जो 0.8 मिमी की एक ऑप्टिकल टुकड़ा देता है के लिए सेट किया जाना चाहिए. हम ट्रैक 1 में GFP का पता लगाने Alexa 488 के लिए 582 एनएम पर एक बीम फाड़नेवाला के साथ फिल्टर सेट का उपयोग इस प्रकार, घ488 और 582 एनएम के बीच तरंगदैर्य etecting. ट्रैक 2 में हम एक फिल्टर mCherry के लिए 578 एनएम पर एक बीम फाड़नेवाला का उपयोग इष्टतम सेट का उपयोग करें, इस प्रकार 578 और 600 एनएम के बीच तरंगदैर्य का पता लगाने. इसका मतलब यह है कि ट्रैक में 2 दोनों (SPB) mRFP और समुद्री मील दूर (mCherry) पता लगाया जाएगा.
  4. लो के रूप में कई चित्रों के लिए प्रत्येक तनाव के लिए 60 अलग अलग कक्षों में मापने के लिए सक्षम होने की जरूरत है. आम तौर पर स्वतंत्र माइक्रोस्कोपी क्षेत्रों के 15 चित्रों के लिए पर्याप्त हैं. यह अनुशंसा की जाती है कि ताजा कोशिकाओं के साथ एक नए विकास चैम्बर अगर आपके माइक्रोस्कोपी समय 60 मिनट से अधिक किया जाता है.

4. Subcellular दूरी के मात्रात्मक माप

  1. Zeiss ज़ेन लाइट संस्करण प्रोग्राम में चित्रों को खोलें. माप उपकरण उपाय जहां सभी संकेतों को एक ही फोकल हवाई जहाज़ में हैं सभी कोशिकाओं में अलग fluorochromes के बीच सुक्ष्ममापी में दूरी का उपयोग करना. प्रकाश तीव्रता और विपरीत समायोजित करने के लिए फ्लोरोसेंट संकेत के बीच की पहचान. यह सरल केवल दो अलग सी प्रोटोकॉल का उपयोग करता हैolours और इसलिए SPB और समुद्री मील दूर एक ही चैनल में हैं. SPB समुद्री मील में बड़े दौर संरचना से बाहर singled है. एक Notepad पत्रक दूरी स्थानांतरण. कम से कम 60 कक्षों में उपाय. ImageJ जैसे अन्य कार्यक्रमों में भी दूरी को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन अपनी तस्वीर की उच्च संकल्प और में और बाहर उस प्रोग्राम का उपयोग कर ज़ूम करने के लिए आसानी Zeiss ज़ेन लाइट के कारण पसंद है. चित्र LSM ImageJ में खोला प्रारूप में एक दूसरे के शीर्ष पर दो चैनलों होगा. दोनों चैनलों के साथ एक तस्वीर बनाने के लिए, पहले दो चैनलों विभाजन और उसके बाद उन्हें मर्ज. इसके बाद लाइन उपकरण दूरी के रूप में ऊपर वर्णित को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. मतलब या मंझला subcellular दूरी अलग अलग उपभेदों और उपचार के एक सांख्यिकीय कार्यक्रम का उपयोग कर, टी - परीक्षण या मान व्हिटनी श्रेष्टता श्रेणी योग टेस्ट उदाहरण के लिए, सॉफ्टवेयर SigmaStat-3.5 का उपयोग करके उदाहरण के लिए के बीच तुलना. अकसर डेटा सामान्य रूप से वहाँ के बाद से कम के साथ कोशिकाओं के लिए एक चयन नहीं किया जाएगा वितरित किया जाता हैसभी संकेतों के बाद से फ्लोरोसेंट संकेतों के बीच दूरी को एक ही फोकल विमान में मापा जा करने की आवश्यकता है. एक टी - परीक्षण केवल जब डेटा एक सामान्य वितरण गया है जबकि एक मान - व्हिटनी श्रेष्टता श्रेणी योग टेस्ट की अनुमति देता है डेटा सेट है कि सामान्य वितरण की कमी की तुलना में इस्तेमाल किया जा सकता है. एक टी - परीक्षण में दो अलग अलग डेटासेट का मतलब है, जबकि एक मान - व्हिटनी श्रेष्टता श्रेणी योग टेस्ट में औसत की तुलना में तुलना कर रहे हैं.

5. प्रतिनिधि परिणाम

PJ1185 तनाव: (ज + + his7:: dis1placR - GFP Chr1 [: ura4 + hphMX6 laco] sid4 mRFP: kanMX6 cut11 mCherry: natMX6 ura4-D18 leu1-32 ade6 DN-N /) ईएमएम में हो गया था . एक नमूना वापस ले लिया था और एक छोटे से वृद्धि कक्ष में घुड़सवार और चित्रों (छवि + 1A एन) ले जाया गया. इसके बाद विकास मीडिया ईएमएम w / ओ ammoniumchloride (ईएमएम - एन) के साथ बदल दिया गया था, और कोशिकाओं छ थे15 मिनट के लिए rown जबकि मिलाते हुए. नाइट्रोजन भूखे कोशिकाओं तो ईएमएम - एन और चित्रों के साथ एक विकास कक्ष में रखा गया (छवि 1 ए - एन) ले जाया गया. मापने उपकरण (GFP) के बिन्दुपथ और SPB (छवि 1B और तालिका 1) के बीच की दूरी को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था. इसके अलावा, (GFP) के बिन्दुपथ और समुद्री मील के बीच की दूरी (छवि 1B और टेबल 2) मापा गया था. पहले और बाद नाइट्रोजन रिक्तीकरण औसत subcellular दूरी SigmaStat 3.5 सॉफ्टवेयर (3 टेबल) का उपयोग की तुलना में थे. जीन एसबीपी की ओर समुद्री मील दूर से दूर जा रहा क्लस्टर के स्थानीयकरण में एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण बदलाव था. डेटा GFP और SBP के बीच की दूरी को मापने के एक परीक्षण टी (टेबल 1 और 3) का उपयोग की तुलना में किया जा सकता है है एक सामान्य वितरण और इसलिए मतलब दूरी (1.777 सुक्ष्ममापी + एन और 1587 सुक्ष्ममापी - एन) था. दो मतलब मूल्यों (पी = .008, टी परीक्षण) के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर था . GFP और समुद्री मील दूर के बीच की दूरी को मापने के डेटा एक सामान्य di नहीं थाstribution और इसलिए औसत दूरी (0 सुक्ष्ममापी + एन और 0.390 सुक्ष्ममापी - एन) का श्रेष्टता श्रेणी मान व्हिटनी रकम परीक्षण (तालिका 2 और 3) का उपयोग की तुलना में थे. वहाँ दो मंझला मूल्यों (पी <.001, रैंक मान व्हिटनी रकम परीक्षण) के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर था .

चित्रा 1
चित्रा 1. Chr1 नाम जीनों के एक क्लस्टर का स्थानीयकरण, GFP द्वारा चिह्नित, नाइट्रोजन भुखमरी के बाद बदल. (ए) वाम स्तंभ + N ईएमएम सही कॉलम में हो सेल, एन, एक ईएमएम - एन में हो कक्ष से एक प्रतिनिधि सेल नाभिक से एक प्रतिनिधि सेल नाभिक. ग्रीन GFP Chr1 क्लस्टर लेबलिंग संकेत है, लाल mRFP और mCherry SPB और समुद्री मील लेबलिंग, क्रमशः है. (बी) के समान सेल नाभिक के रूप में (ए), लेकिन अब मापा subnuclear दूरी के साथ, पीले: सेल नाभिक व्यास, नीले: SPB और GFP संकेत और गुलाबी के बीच की दूरी: GFP संकेत और परमाणु झिल्ली के बीच की दूरी.


तालिका 1
तालिका 1
तालिका 1. PJ1185 ईएमएम में बड़े तनाव के सुक्ष्ममापी में मापा subnuclear दूरी. प्रथम पंक्ति, सेल (घ), दूसरी पंक्ति, GFP और SPB के बीच की दूरी, तीसरी पंक्ति, GFP और समुद्री मील के बीच की दूरी के व्यास.

तालिका 2
तालिका 2
तालिका 2
तालिका 2. PJ1185 ईएमएम - एन में बड़े तनाव के सुक्ष्ममापी में मापा subnuclear दूरी. प्रथम पंक्ति, सेल (घ), दूसरी पंक्ति, GFP और SPB के बीच की दूरी, तीसरी पंक्ति, GFP और समुद्री मील के बीच की दूरी के व्यास.

तालिका 3 PJ1185 तनाव में मनाया subnuclear दूरी के वर्णनात्मक सांख्यिकी (एन) के पहले और बाद में (एन) नाइट्रोजन भुखमरी. प्रथम पंक्ति: सेल की संख्या में मापा जाता है, दूसरी पंक्ति: व्यास (घ), तीसरी पंक्ति का मतलब: मंझला व्यास (घ), आगे पंक्ति: GFP और समुद्री मील के बीच औसत दूरी: GFP और SPB, पांचवें पंक्ति के बीच की दूरी का मतलब है.

Discussion

पिछले दशक के दौरान रहते सेल इमेजिंग का उपयोग करने के लिए सेलुलर घटनाओं पर नजर रखने के तेजी से लोकप्रिय हो गया है. यह ग्रीन प्रतिदीप्ति प्रोटीन के उपयोग के साथ जेलिफ़िश Aequorea विक्टोरिया से शुरू किया और अब कई अलग अलग fluorochromes दूर लाल (648 एनएम) 11 सियान (475 एनएम) से एक व्यापक स्पेक्ट्रा के माध्यम से उपलब्ध उत्सर्जन प्रतिदीप्ति हैं . Immunofluorescence पर रहते सेल इमेजिंग के एक प्रमुख लाभ यह है कि कोशिकाओं formaldehyde या माइक्रोस्कोपी पहले इथेनॉल / एसीटोन उपचार द्वारा तय नहीं कर रहे हैं, इसलिए निर्धारण की प्रक्रिया से संभव कलाकृतियों से परहेज. इसके अलावा, जीना सेल इमेजिंग को व्यक्तिगत कक्षों का पालन करें और लगातार अंतराल पर चित्र लेने के ऊष्मायन घंटे या दिन के दौरान, यह सेलुलर 12 घटनाओं की मूवीज हासिल करने के लिए संभव बनाने की संभावना प्रदान करता है. स्तनधारी कोशिकाओं को एक बड़े आकार के होने का लाभ है, करीब 100 सुक्ष्ममापी के diameters के साथ के रूप में बारे में 3-4 की एक व्यास के साथ छोटे खमीर कोशिका की तुलना में,म्यू, मीटर दूसरी ओर, खमीर के साथ लाभ आसानी से छेड़छाड़ जीनोम है. मुताबिक़ पुनर्संयोजन खमीर में बहुत कुशलता से होता है और अलग 3 fluorochromes के लिए ब्याज की प्रोटीन को फ्यूज करने के लिए इस्तेमाल किया. इसके अलावा, laco दृश्यों और LacR - GFP प्रोटीन के बाद अभिव्यक्ति की लक्षित एकीकरण का उपयोग सेल नाभिक 2 भीतर जीनोम के एक विशिष्ट भाग का पता लगाने की अनुमति देता है. एस का उपयोग माइक्रोस्कोपी में pombe कोशिकाओं अतिरिक्त लाभ है क्योंकि वे प्राकृतिक कोशिकीय जीवों कि कम लागत सेल संस्कृति शर्तों में एक तेजी से पीढ़ी समय के साथ बढ़ने. इसके अलावा एस. pombe एक उत्कृष्ट यूकेरियोटिक मॉडल जीव है क्योंकि यह metazoan मुताबिक़ जीन है.

एक सच संकेत का पता लगाने परेशान खमीर सेल में इस तकनीक का प्रमुख सीमाओं के autofluorescence है. यह समस्या फिल्टर निष्फल ग्लूकोज के साथ न्यूनतम वृद्धि मीडिया का उपयोग करने के बजाय autoclaved द्वारा दूर किया जा सकता है. मेंइसके अलावा खमीर कोशिकाओं से पहले उन्हें बढ़ते लॉग चरण में 2 दिनों के लिए विकसित किया जाना चाहिए. यहाँ प्रस्तुत है एक अपेक्षाकृत सरल है, लेकिन अभी तक मात्रात्मक विधि खमीर कोशिका के भीतर प्रोटीन की subcellular स्थानीयकरण निर्धारित प्रोटोकॉल प्रदान करता है. इसके अलावा अलग - अलग समय बिंदुओं पर चित्र लेने के द्वारा हम सेलुलर घटनाओं का पालन कर सकते हैं.

Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgements

हम हमारे उपभेदों भेजने के लिए प्रोफेसर Hiraoka धन्यवाद. हम गोरान Gustafssons फाउंडेशन और स्वीडिश कैंसर सोसायटी (2008/939) से समर्थन स्वीकार करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lectin Sigma-Aldrich L1395
Silicon grease Dow Corning

Laser scanning microscope

LSM 700
Carl Zeiss, Inc. LSM 700 Other confocal microscope could be used.
SigmaStat3.5 Statcon SigmaStat3.5 Any software for statistical analysis could be used.

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References

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