मेटाबोलिक लेबल और फ्लो के साथ कोशिका चक्र प्रगति कैनेटीक्स मापने

Biology

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Summary

ट्रैकिंग और सेल चक्र के चरणों की प्रगति कैनेटीक्स में सूक्ष्म परिवर्तन nucleic एसिड के Propidium आयोडाइड के माध्यम से BrdU और कुल जीनोमिक डीएनए धुंधला के साथ चयापचय लेबलिंग का एक संयोजन का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है. इस विधि साइकिल कोशिकाओं के रासायनिक तुल्यकालन की जरूरत से बचा जाता है, जिससे गैर विशिष्ट डीएनए की क्षति, जो बारी में कोशिका चक्र प्रगति को प्रभावित करता है की शुरूआत को रोकने.

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Fleisig, H., Wong, J. Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (63), e4045, doi:10.3791/4045 (2012).

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Abstract

Protocol

1. सेल तैयार

0 चित्रा

  1. प्लेट के लिए confluency लगभग 60% की एक घनत्व को प्राप्त करने कोशिकाओं. कोशिकाओं लॉग चरण में संग्रह की समय पर होना चाहिए. Mcf7 कोशिकाओं के लिए, इस 5 x 10 5 कोशिकाओं / उपयुक्त मीडिया में 10 सेमी की प्लेट पर बोने के द्वारा पूरा किया है. HT29 और LS180 कोशिकाओं x 6 10 5 कोशिकाओं / 6 सेमी थाली पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं. हम प्रयोग किया जाता DMEM मीडिया 10% FBS और 1x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक. बीज में सही सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के लिए प्लेटों के लिए यकीन है किअपने परीक्षण के नमूने के अलावा. वे निम्नलिखित शामिल हैं:
मैं सकारात्मक नियंत्रण केवल BrdU
द्वितीय सकारात्मक नियंत्रण केवल पीआई
iii नकारात्मक नियंत्रण BrdU नकारात्मक, नकारात्मक पीआई

(यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित एक जैसे कई timepoints के साथ एक प्रारंभिक प्रयोग करने के लिए नीचे संकीर्ण समय सीमा के दौरान जो बाहर ले जाने के लिए भविष्य संग्रह करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.)

  1. मढ़वाया कोशिकाओं 37 में incubated हैं डिग्री सेल्सियस, 5% 24-48 घंटे के लिए सीओ 2, जिससे कोशिकाओं को ठीक करने के लिए और करने के लिए संलग्न करने की अनुमति है.
  2. (BrdU) bromodeoxyuridine साथ लेबल की कोशिकाओं नाड़ी, DMEM वाई बदल दिया हैवें ताजा मीडिया 10 माइक्रोन BrdU युक्त. कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 डीएनए में BrdU शामिल करने के लिए अनुमति देने के लिए incubated हैं. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करने के लिए अनुपचारित थाली छोड़ने के लिए सुनिश्चित.
  3. नाड़ी - लेबलिंग मीडिया निकाल दिया है और कोशिकाओं संक्षिप्त 1X पीबीएस के साथ धोए हैं.
  4. ताजा वृद्धि मीडिया (शून्य BrdU) को जोड़ा जाता है और कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 कटाई के लिए उपयुक्त timepoint तक पहुँच जाता है सेते हैं जारी रखने की अनुमति दी है.

2. फसल काटने वाले और फिक्सेशन

  1. 1.3 कदम से अनुपचारित कोशिकाओं timepoint शून्य माना जाता है. यह नमूना 1 घंटे timepoint है जो तुरंत BrdU इलाज के बाद एकत्र किया जाता है के साथ एक साथ काटा जा सकता है.
  2. कोशिकाओं को फसल, मीडिया निकाल दिया है और प्लेटें एक बार 1X पीबीएस के साथ धोए हैं.
  3. कोशिकाओं trypsinized संवर्धन मीडिया में एकत्र कर रहे हैं और बाद में pelleted 5 मिनट समर्थन के लिए 1500 rpm पर centrifugation द्वाराernatant खारिज कर दिया है.
  4. 5 मिलीलीटर बर्फ की ठंड 1X पीबीएस में 1-10 x 10 6 कोशिकाओं कुल्ला. 5 मिनट सतह पर तैरनेवाला के लिए 1500 rpm पर अपकेंद्रित्र खारिज कर दिया है.
  5. सेल गोली तो ठंडा पीबीएस / 1% FBS 100 μl में resuspended है. पीबीएस एड्स में 1% FBS सेल clumping को रोकने में इसके अलावा.
  6. -20 डिग्री सेल्सियस, 70% करने के लिए कोशिकाओं को ठीक इथेनॉल के 5 मिलीलीटर ड्रॉप द्वारा इन कोशिकाओं बूंद जोड़ें.
  7. बर्फ पर 30 या 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर मिनट दुकान के लिए सेते हैं. यह एक आदर्श कदम जो पर विभिन्न timepoints से रोकने के लिए नमूनों का संग्रह है. नमूने कई दिनों के लिए इथेनॉल में छोड़ दिया जा सकता है, उन्हें प्रोटोकॉल के शेष के माध्यम से संसाधित किया जा करने के लिए एक साथ की अनुमति है.

3. BrdU और पीआई धुंधला

  1. 5 मिनट के लिए 1500 rpm पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं.
  2. लगानेवाला निकालें, लेकिन ~ 50 μl जो vortexing द्वारा गोली ढीला छोड़ दें.
  3. डीएनए denature, धीरे 2N एचसीएल / एक्स-100 ट्राइटन की 1 मिलीग्राम जोड़नेdropwise जबकि vortexing. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए नमूने सेते हैं.
  4. 1500 rpm पर 5 मिनट के लिए नमूने centrifuging द्वारा गोली कोशिकाओं. महाप्राण (व्यंजन) और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  5. सेल गोली Resuspend 0.1M सोडियम tetraborate, 8.5 पीएच के 1 मिलीग्राम में के विकृतीकरण कदम बेअसर.
  6. 1500 rpm पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. महाप्राण (व्यंजन) और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  7. सेल गोली Resuspend BrdU धुंधला मिश्रण की 75 μl (50 μl 0.5% के बीच 20/1 / BSA पीबीएस% + 20 μl FITC संयुग्मित विरोधी BrdU + 5 μl 10 मिलीग्राम / एमएल RNase) में.
  8. कमरे के तापमान पर प्रकाश से 45 संरक्षित मिनट के लिए सेते हैं.
  9. गोली कोशिकाओं, 1500 rpm पर 5 मिनट के लिए नमूने अपकेंद्रित्र. महाप्राण (व्यंजन) और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  10. पीबीएस 5 μg / एमएल propidium आयोडाइड से युक्त 1 मिलीलीटर में सेल गोली Resuspend.

4. फ्लो

  1. कोशिकाओं का विश्लेषण, एक प्रवाह cytometer एक 488 एनएम लेजर और साथ सुसज्जितउपयुक्त फिल्टर आवश्यक है. CellQuest जैसे विश्लेषण सॉफ्टवेयर करने के लिए नीचे उल्लिखित भूखंडों बनाने के लिए आवश्यक है.
  2. जब प्रवाह cytometer के माध्यम से नमूना चल रहा है, आगे तितर बितर (एसएससी एच) बनाम ओर तितर बितर साजिश (FSC एच) बनाने के लिए कक्षों की उचित आकार वितरण (चित्रा 1 ए) सुनिश्चित. इन दोनों मानकों के एक रेखीय पैमाने पर प्लॉट किए जाते हैं.
  3. इसके साथ ही (पीआई दाग) FL3 एच बनाम FL2 डब्ल्यू (चित्रा 1 बी) के एक भूखंड को देखने. इस भूखंड के लिए (R3) फाटक कि सेल चक्र की सामान्य वितरण पैटर्न के भीतर कोशिकाओं के अंश को अलग करने के लिए बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है. सामान्य में, इस वितरण पैटर्न 2N और 4N PI कोशिका चक्र के G1 और G2 के चरणों, क्रमशः का प्रतिनिधित्व धुंधला के डीएनए सामग्री से कोशिकाओं के दो समूहों द्वारा विशेषता है. इन दो समूहों के बीच स्थित कोशिकाओं की एक स्ट्रिंग चल रही डीएनए प्रतिकृति है कि सेल चक्र के एस चरण में होता है की प्रतिनिधि है.
  4. एक साजिश displayi बनाएँएनजी 4.3 FL1 - एच के साथ, कदम (FITC, लॉग साजिश) से में gated (R3) y-अक्ष और पीआई (रैखिक साजिश) x अक्ष (चित्रा 1C) पर के पर कोशिकाओं. इस साजिश शेष 1.1 में उल्लिखित विभिन्न नियंत्रण, के रूप में के रूप में अच्छी तरह का उपयोग कर विश्लेषण के लिए डेटा एकत्रित करने के लिए पैरामीटर सेट करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
  5. कोशिकामापी पर पीआई केवल दाग नमूना रखें. 200 ~ x-अक्ष पर G1 जगह लाभ को समायोजित करें. यह दाग पीआई के हिस्टोग्राम साजिश में कल्पना करने के लिए आसान हो जाएगा.
  6. एक दूसरे नियंत्रण प्रवाह कोशिकामापी पर केवल एक नमूना BrdU चल शामिल है. लाभ इतना है कि कोशिकाओं के 2 आबादी (BrdU सकारात्मक बनाम BrdU नकारात्मक) भूखंड पर दिखाई देते हैं समायोजित करें. आदर्श रूप में, BrdU नकारात्मक कोशिकाओं -1 10 से नीचे प्रदर्शित करने के लिए तैनात कर रहे हैं.
  7. अंतिम नियंत्रण BrdU / पीआई नकारात्मक नमूना है. इस नकारात्मक नियंत्रण चलाने के लिए सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को ऊपरी या सही हाथ quadrants में से किसी में नहीं दिखाई देते.
  8. एक बार विभिन्न भूखंडों के मापदंडों सेट किया गया है,प्रवाह cytometer calibrated और BrdU और पीआई के दाग कोशिकाओं के प्रसंस्करण के लिए तैयार है. कम से कम 10,000 कोशिकाओं है कि सही पीआई अंश (4.3 कदम को देखें) में gated हैं का एक संग्रह प्रति पढ़ा जाना चाहिए.
  9. एकत्रित किए गए डेटा का विश्लेषण करने के लिए, ऐसे FlowJo या FacsDiva के रूप में सॉफ्टवेयर का उपयोग कर रहे हैं. उपर्युक्त भूखंडों के प्रत्येक इन कार्यक्रमों में recreated किया जा सकता है और मात्रात्मक और सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन किया.
  10. विश्लेषण के endpoint लगातार कई कदम शामिल है. पीआई बनाम FL2 डब्ल्यू साजिश से सकारात्मक PI के रूप में gated कोशिकाओं के साथ FITC बनाम पीआई की एक साजिश बनाने के सायकलिंग जनसंख्या भेद करने के लिए अनुमति देता है. एक दूसरे गेट इस साजिश से अलग BrdU सकारात्मक जनसंख्या के द्वारा बनाई गई है. X-अक्ष पर पीआई के साथ एक हिस्टोग्राम भूखंड पर इस विशिष्ट जनसंख्या व्यक्त कोशिका चक्र प्रगति की समय पाठ्यक्रम को ट्रैक करने के लिए अनुमति देता है. इस G1 के या समय के एक समारोह के रूप में G2 सामग्री के साथ BrdU पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या की साजिश रचने के द्वारा visualized किया जा सकता है.

5. प्रतिनिधि परिणाम

आम तौर पर साइकिल propidium आयोडाइड के साथ दाग कोशिकाओं G1 और G2 में अलग चोटियों, 2N और 4N डीएनए सामग्री युक्त, क्रमशः कोशिकाओं (चित्रा 2) के लिए इसी है. पल्स लेबलिंग BrdU साथ कोशिकाओं है कि सक्रिय रूप से डीएनए (एस यानी चरण) synthesizing के कर रहे हैं की एक उप जनसंख्या के चयनात्मक लेबलिंग के लिए अनुमति देता है. के फौरन बाद BrdU अभिकर्मक को हटाने, सभी लेबल की कोशिकाओं के एस चरण (चित्रा 3) में हैं. एक छोटी नाड़ी लेबलिंग सीमित द्वारा कई समय अंक भर में यह अब अलग कोशिकाओं के उप - जनसंख्या का पालन करने में सक्षम है के रूप में वे सेल चक्र के बाद के चरणों के माध्यम से गुजरती हैं. इस G1 के एक विशिष्ट कमी और G2 चोटियों के रूप में चित्रा 3 में 1 घंटे समय बिंदु पर visualized किया जा सकता है.

अतिरिक्त जानकारी BrdU लेबलिंग कदम से प्राप्त किया जा सकता है. न केवल सक्रिय रूप से विभाजित कोशिकाओं के अनुपात में मापा जा सकता है लेकिन एक स्था.दो नमूनों के बीच सेल चक्र चरण वितरण की imate के रूप में अच्छी तरह से निर्धारित किया जा सकता है. समान रूप से स्थान दिया गया BrdU अभिकर्मक को हटाने के बाद अंतराल पर कोशिकाओं को इकट्ठा करके, कोशिकाओं के रूप में वे चक्र प्रगति, G2 करने के लिए जारी है का पता लगाया जा सकता है और अंत में मूल कोशिकाओं के कोशिका विभाजन के माध्यम से ले जाने के लिए, अंत में BrdU G1 के साथ सकारात्मक बेटी कोशिकाओं के रूप में उभर डीएनए सामग्री (चित्रा 4). सेल चक्र चरण मात्रा का ठहराव और गतिज विश्लेषण का एक उदाहरण चित्रा 5 में प्रदान की जाती है.

चित्रा 1
चित्रा 1 (ए) फॉरवर्ड बनाम एक प्रतिनिधि mcf7 सेल जनसंख्या के साइड स्कैटर प्लॉट तितर बितर. (बी) के एक प्रतिनिधि mcf7 सेल की आबादी का पीआई बनाम चौड़ाई प्लॉट (FL-W). इस gating अंतिम विश्लेषण (R3) में सेल दोहरी बाहर करने के लिए दिखाया गया है. सेल दोहरी अधिक से अधिक एक एकल कोशिका से पल्स चौड़ाई है, के रूप में वे अब लेजर किरण Theref और के माध्यम से पारित करने के लिए ले जाएगाअयस्क विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है. (सी) PI एक प्रतिनिधि mcf7 सेल जनसंख्या की तुलना में FITC प्लॉट (BrdU) के के. Gating के लिए केवल FITC (BrdU) के सकारात्मक कोशिकाओं (R4) को शामिल करने के लिए दिखाया गया है.

चित्रा 2
चित्रा 2 सामान्य रूप से साइकिल कोशिकाओं की कुल आबादी का प्रतिनिधि हिस्टोग्राम साजिश.

चित्रा 3
चित्रा 3 कक्षों BrdU नाड़ी हटाने के बाद किया गया है 1 FITC (BrdU) पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए gating के बाद एकत्र की हिस्टोग्राम साजिश. लेबल के हटाने के बाद BrdU सकारात्मक एक प्रारंभिक timepoint पर कोशिकाओं PI प्रोफाइल है कि डीएनए कोशिकाओं है कि सेल चक्र के एस चरण में हैं, कोशिकाओं के डीएनए संश्लेषण के दौरान केवल सफल लेबलिंग की पुष्टि के साथ संगत सामग्री प्रदर्शित नमूनों के अनुरूप दिखा.

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चित्रा 4 कैंसर कोशिका लाइनों, कोलोरेक्टल कैंसर HT29 (ए) और LS180 (बी), के रूप में अच्छी तरह से स्तन कैंसर mcf7 (सी) के बीच सेल चक्र प्रगति कैनेटीक्स की तुलना. कोशिकाओं 8 घंटे के लिए हर घंटे में एकत्र किए गए BrdU नाड़ी के हटाने के बाद. इस प्रयोग में, हम. कोलोरेक्टल सेल लाइन LS180 में सेल चक्र की G2 चरण के माध्यम से त्वरित सेल चक्र प्रगति का एक स्पष्ट प्रोफ़ाइल मनाया. कोलोरेक्टल कैंसर की कोशिकाओं के दो प्रोफाइल के बीच तुलना कैनेटीक्स, एक G1 चोटी के उद्भव टी = 4 के बाद BrdU LS180 कोशिकाओं में स्पष्ट HT 29-सेल लाइन है जो इस शिखर की कमी के लिए इसी समय बिंदु के साथ तुलना में है,. या तो दो कोलोरेक्टल सेल लाइनों में से एक के साथ तुलना में एक काफी कम दर पर, mcf7 कोशिकाओं साइकिल कर रहे हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

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चित्रा 5 (क) मात्रात्मक BrdU लेबल कैंसर कोशिकाओं के सेल चक्र चरण विश्लेषण. एल्गोरिथ्म डीन / / जेट फॉक्स LS180, HT29, mcf7 के के (हरे रंग में सचित्र) लागू किया गया था. परिणामस्वरूप प्रत्येक नमूने से सेल चक्र चरण वितरण% प्रत्येक चरण के लिए कुल BrdU पॉजिटिव कोशिकाओं के रूप में व्यक्त कर रहे हैं. प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए केवल समय अंक का चयन करें प्रदर्शित कर रहे हैं, के रूप में पहले के समय में से कुछ के लिए विश्लेषण अवैध परिणामों का उत्पादन किया. पहले इन समय अंक में, सभी BrdU पॉजिटिव कोशिकाओं के एस चरण में हैं और इसलिए अलग G1 और G2 चोटियों है जो एल्गोरिथ्म आवेदन के लिए आवश्यक हैं की कमी है. (बी) के कैंसर की कोशिकाओं की Histograms / G2 एम कोशिका चक्र के चरणों के माध्यम से प्रगति की कैनेटीक्स दिखा. G2 / एम चरणों के माध्यम से प्रगति LS180 कोशिकाओं, HT29 और mcf7 द्वारा पीछा के लिए सबसे तेज है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

jpg "alt =" चित्रा "S1 />
चित्रा S1 के प्रवाह cytometry नियंत्रण. mcf7 कोशिकाओं (ए) नकारात्मक नियंत्रण जहां कोशिकाओं न पीआई न ही BrdU दाग के रूप में दिखाया जाता है. (बी) पीआई केवल दाग. (सी) BrdU FITC नमूने लेबल.

S2 चित्रा
चित्रा S2 योजनाबद्ध चित्रण पीआई बनाम FITC (BrdU) के फ्लोरोसेंट उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के बीच संबंधों को दर्शाता है. फ्लोरोसेंट 1 चैनल (FL1, FITC के लिए) और फ्लोरोसेंट 3 चैनल (FL3, PI के लिए) के लिए वर्णक्रमीय संग्रह विंडोज़ इसी बक्से में दिखाया जाता है. FL1 और FL3 पता लगाने के बीच कोई fluorophore स्पेक्ट्रा ओवरलैप है. जाहिर है, प्रतिदीप्ति मुआवजा आवश्यक जब PI और FITC के BrdU से प्रयोगात्मक डेटा लेबल की कोशिकाओं को क्रमशः FL1/FL3 चैनलों में एकत्र कर रहे हैं नहीं है. प्रतिदीप्ति spectrums बी.डी. बायोसाइंसेज वेबसाइट से प्राप्त किया गया:लक्ष्य = "_blank" http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrum_viewer. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

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Discussion

BrdU समावेश के साथ प्रवाह cytometry के संयोजन के द्वारा, हम सेल चक्र कैनेटीक्स का अध्ययन करने के लिए आवश्यक उपकरण हैं. BrdU thymidine एनालॉग के रूप में समारोह के विशिष्ट संपत्ति है क्या एक साइकिल कोशिका के डीएनए सामग्री की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है. सेल चक्र के संश्लेषण चरण के दौरान एक से बढ़ बेटी डीएनए भूग्रस्त में BrdU का समावेश है क्या एक एस चरण में डीएनए की नकल के माध्यम से साइकिल कोशिकाओं के एक subpopulation पालन के G2 में वृद्धि की अवधि के लिए और अंततः कोशिका विभाजन के लिए, की अनुमति देता है . बेटी BrdU पॉजिटिव कोशिकाओं लगातार पीछा कर सकते हैं जब तक समय में जो बिंदु BrdU लेबल कोशिका विभाजन की डिग्री जहां संकेत स्तर पृष्ठभूमि के लिए कम है पतला है.

Propidium आयोडाइड का उपयोग करने के लिए कुल डीएनए सामग्री को निर्धारित है, हम एस → / G2 एम → G1 से कोशिका चक्र प्रगति का पालन करने में सक्षम हैं. कक्षों की साइकिल की दर को ट्रैक करने की क्षमता कई अनुप्रयोगों में महत्वपूर्ण और उपयोगी है, विशेष रूप से के लिएr पूर्व नैदानिक ​​अध्ययन सेल चक्र विशिष्ट डीएनए की क्षति उत्प्रेरण दवाओं या दवा के विकास की प्रक्रिया के दौरान उपन्यास 11 यौगिकों के सेल चक्र चरण संवेदनशीलता का निर्धारण शामिल है. एक चयापचय लेबलिंग तकनीक का उपयोग करने का सबसे स्पष्ट लाभ कोशिकाओं का रासायनिक तुल्यकालन के उन्मूलन है. के रूप में सबसे अधिक रासायनिक उपचार है कि सेल चक्र गिरफ्तारी के लिए प्रेरित कर रहे हैं खुद को genotoxic, इन रसायनों की उपस्थिति में उपन्यास यौगिकों के सेल चक्र संवेदनशीलता प्रभाव के विदारक संभव नहीं हो सकता है.

हम सह धुंधला पीआई के साथ इस BrdU चयापचय लेबलिंग तकनीक की बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शन किया. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया है कि सेल चक्र के चरण / G2 एम के माध्यम से सेल चक्र प्रगति में वृद्धि टेलोमिरेज नकारात्मक मानव कोशिकाओं है कि एंजाइम 10 अभिव्यक्ति के लिए मजबूर किया गया है बदल दिया है में देखा जा सकता है. हालांकि इस पद्धति का यह चक्र अपरोक्ष रूप में सेल के कैनेटीक्स को मापने में शक्तिशाली हैऊ कई चरणों, एक सीमा के संक्रमण के दौरान समय की जानकारी के नुकसान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से G2 और एम चरणों के भीतर है. के रूप में कोशिकाओं G2 के माध्यम से एम करने के लिए आगे बढ़ना है, हम न केवल दो चरणों के भेद करने में असमर्थ हैं, लेकिन यह भी उप - G1 के जनसंख्या, डीएनए की सामग्री पर आधारित है. आवेदन कहाँ इस भेदभाव की आवश्यकता है, यह संभावित सह दाग cyclins या अन्य सेलुलर प्रोटीन अभिव्यक्ति जिसका सेल चक्र 12,13 के वांछित चरण के लिए विशिष्ट हैं के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ BrdU लेबल की कोशिकाओं के लिए संभव है. अतिरिक्त अनुकूलन करने के लिए सुनिश्चित करें कि cyclin एंटीबॉडी BrdU लेबल और इम्युनो धुंधला प्रोटोकॉल के साथ संगत कर रहे हैं की जरूरत होगी. आदर्श रूप में, पर्याप्त रूप से सेल चक्र के विभिन्न चरणों के अंतर करने के लिए, कई cyclin एंटीबॉडी सह लेबल करने के लिए आवश्यक हो सकता है एक नमूना एक साथ. हमारी प्रयोगशाला cyclin बी और phospho histone 3 एंटीबॉडी के साथ BrdU नाड़ी लेबल की कोशिकाओं के बाद लेबलिंग पर काम कर रहा है कोशिकाओं के बीच अंतरकोशिका चक्र के G2 बनाम एम चरण में. Cyclin एंटीबॉडी के साथ PI और FITC - BrdU धुंधला अलावा, सह लेबलिंग काफी हद तक दोनों हार्डवेयर और डेटा विश्लेषण परिप्रेक्ष्य (प्रतिदीप्ति मुआवजा मुद्दों) से प्रवाह cytometry की जटिलता बढ़ जाती है. प्रवाह cytometers की नई पीढ़ी के आगमन के साथ, उनकी क्षमता और कार्यक्षमता में अग्रिम इन तकनीकी चिंताओं को कम करना चाहिए.

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgements

हम UBC पर बायोमेडिकल रिसर्च सेंटर के एंडी जॉनसन FACS विश्लेषण के साथ सहायता के लिए धन्यवाद. कैंसर वाँग प्रयोगशाला में अनुसंधान अनुदान कनाडा के कैंसर सोसायटी अनुसंधान संस्थान (ऑपरेटिंग अनुदान 019,250) और अनुसंधान, औषधि विज्ञान, UBC के संकाय के पुनर्निवेश कोष से प्रदान की जाती है. JMYW कनाडा अनुसंधान अध्यक्षों और स्वास्थ्य अनुसंधान कैरियर विकास कार्यक्रमों के लिए माइकल स्मिथ फाउंडेशन द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
bromodeoxyuridine BD Biosciences 55089
propidium iodide Sigma-Aldrich 287075 1mg/ml stock
FITC anti-BrdU BD Biosciences 347583
sodium tetraborate Fisher Scientific S80172 0.1M, pH 8.5
FACS Caliber BD Biosciences

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References

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