Sıralama Kök Hücre Tahliller ve Akış Primer Beyin Tümörü Doku İşleme

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Beyin tümörü başlatan hücreler (BTICs), heterojen bir tümör sahip kök hücre özellikleri içinde nadir hücrelerinin tanımlanması insan beyin tümörü patogenezinde sağlayan yeni anlayışlar içine. Biz BTICs için zenginleştirmek özgü kültür koşullarının rafine var ve biz rutin daha bu popülasyonların zenginleştirmek için flow sitometri kullanın. Tek hücre RT-PCR ile kendini yenileme analizleri ve transkript analiz sonra bu izole hücreler üzerinde de yapılabilir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Venugopal, C., McFarlane, N. M., Nolte, S., Manoranjan, B., Singh, S. K. Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting. J. Vis. Exp. (67), e4111, doi:10.3791/4111 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Beyin tümörlerinin tipik olarak sinir soy belirteçler, çeşitli ifade morfolojik olarak farklı hücre oluşmaktadır. Stem hücre özellikleri ile tümör hücrelerinin sadece nispeten küçük bir kısmı olarak adlandırıldı, beyin tümörü başlatıcı hücreleri (BTICs), çoklu soyların birlikte ayırmak kendini yenilemek ve in vivo olarak tümör başlatmak için bir yeteneğine sahiptirler. Biz aslında insan beyninin çeşitli tümörlerde normal nöral kök hücreler (NSC'lerde) için kullanılır ve bu kültürü yöntemi özellikle kök benzeri popülasyonları için seçtiği bulundu kültür koşulları uygulanır. Serum serbest orta (MGK) bir farklılaşmamış kök hücre devletin bakım için izin verir, ve bFGF ve EGF ilave çoklu güçlü, kendini sürekli yenileyen yayılması ve genişletilebilir tumorspheres sağlar.

İlave her tümörün BTIC nüfusu karakterize etmek için, flow sitometri ile hücre yüzey belirteçleri değerlendirmek. Biz de daha spesifik karakterize ilgi popülasyonları sıralayabilirsiniztirme. Kendini yenileme deneyleri 96 kuyucuğu ayrılır tek BTICs gerçekleştirilir; 37 inkübasyon sonrasında tumorspheres oluşumu ° C kök veya progenitör hücre varlığını gösterir. Belirli bir nüfus Çoklu hücre sayıları, aynı zamanda kendini yenileme kapasitesini analiz etmek için, seyreltme analizi sınırlandırılması için farklı kuyularda sıralanabilir. Biz de tek hücre RT-PCR kullanarak belirli bir hücre popülasyonu içindeki diferansiyel gen ekspresyonu çalışabiliriz.

Aşağıdaki protokoller BTIC popülasyonları gibi tumorspheres ayrışma için zenginleştirmek için primer insan örnekleri ayrışma ve kültürleme için işlemler açıklanmaktadır. Ayrıca akım sitometri analizi veya sıralama, kendini yenileme deneyleri ve tek hücreli RT-PCR için boyama için protokoller dahildir.

Introduction

Beyin tümörleri insanlarda bilinen en agresif ve heterojen kanserler arasındadır. Onların erken tespiti ve teşhisi, modern nöro-görüntüleme teknolojisi tarafından kolaylaştırılmış olmasına rağmen, biz yine de özellikle diffüz, invaziv olanları veya beyinde derin yerleşimli olanlar için, birçok beyin tümörleri için tedavi edici tedaviler yoksundur.

Beyin tümörleri çok agresif ve çoğu zaman çaresiz doğası nedeniyle çocuklarda kanser ölümlerinin önde gelen nedenlerindendir. Glioblastoma (GBM), erişkinlerde en sık rastlanan primer beyin tümörü olan eşit ölümcül prognozu 1 için korkulan en saldırgan insan kanserleri, biridir. Bu son derece malign astrositik tümör (WHO grade 4) genellikle yetişkinlerin hemisferlerin oluşur ve aynı zamanda küçük çocuklar ve bebeklerde oluşabilir. Onun büyüme hızlı ve infiltratif ve tanı patolojik özellikleri, nükleer pleomorfizm, mikrovasküler proliferasyon ve nekroz 2,3 bulunmaktadır. Adul içints yeni teşhis GBM birlikte ortanca sağkalım nadiren tüm tedavilerin genellikle yoksul cevapları, 12 ay 1 ötesine uzanır. Biz somatik kök hücre ve kanser hücreleri tarafından paylaşılan birçok fonksiyonel ve genetik benzerlikler bulunmaktadır kaydetti ve normal beyin gelişimini düzenleyen moleküler yollar genellikle kanser düzensiz olduğunu. Beyin tümörlerinin çalışma kök hücre biyolojisi paradigmalar uygularken, biz prospektif belirlemek ve proliferasyon, kendini yenileme kök hücre özelliklerini sergiledi insan GBMs bir hücre subpopülasyonu arındırmak için ilk araştırmacılardan olan, ve in vitro 4 ve farklılaşma İn vivo 5. Biz aslında çok pediatrik ve yetişkin beyin tümörleri için in vitro 6,7 normal nöral kök hücreler (NSC'lerde) karakterize etmek için kullanılan kültür koşulları ve testleri uygulanır ve CD133 8 nöral progenitör hücre yüzey işaretleyici için sıralama hücre tarafından bu kök-benzeri hücreler için zenginleştirilmiş ,9. CD133 + beyin tümörü fraksiyonu NOD-SCID fare beyinlerinde 5,10 CD133-fraksiyonu daha tümör gelişimini çok daha yüksek frekanslı vardı hücrelerini içeriyordu. Bu resmen kök hücre özellikleri ile beyin tümör hücrelerinin sadece nadir alt, tümör-başlatıcı adı "beyin tümör hücrelerinin başlatılması" onlara kazanç veya "BTICs" olduklarını belirlediler. BTICs ve roman tanımlama birçok solid tümör için temel olarak kanser kök hücre hipotezi 10-13 için güçlü bir destek vererek, insan beyninin tümörogenez sağlayan yeni anlayışlar içine, ve daha etkin kanser tedavilerinin 14-20 için yeni bir hücresel hedef kurar. Tümör toplu öldürme odaklı tümör büyümeye devam sağlayan nadir kök benzeri fraksiyonu kaçırabileceği Tedaviler. Kanser kök hücre öldürme odaklanan beyin tümörleri olan hastalar için daha iyi tedavi ve prognoz verebileceğini Tedaviler.

BTIC nüfus incelemek için, bizim cultu rafine varÖzellikle kök hücre özelliklerine sahip İnsan beyin tümörleri içinde hücre popülasyonları için seçmek için protokolleri yeniden. Serum serbest, nöral kök orta bir farklılaşmamış kök hücre devletin bakım sağlar, hücre (MGK) ve temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF), epidermal büyüme faktörü (EGF) ve lösemi inhibitör faktör ilavesi (LIF) sağlar çok güçlü, kendini sürekli yenileyen ve genişletilebilir insan tumorspheres yayılması. Burada, birincil beyin tümörleri ve BTIC popülasyonlar için zenginleştirmek MGK orta kültür onları işlemeye dahil yöntemleri açıklanmaktadır. Bizim deneysel model sistemi bu hücreleri sadece minimal kök altında kültüre gerçeğini vurgulamak için "BTIC hasta izolatları" çağrısında bulundular kök hücre popülasyonlarının için seçmek için hücre koşulları. gibi CD133 ve CD15 ve akım sitometri analizi gibi temel kök hücre belirteçleri için BTIC popülasyonlarının sonraki immunolabelling de açıklanmıştır. Biz o zaman sınırlayıcı seyreltme analizini tartışır,Hangi BTICs ve kendini yenileme potansiyeli okuyan yardımcı olur. Nihayet, biz AmpliGrid Slaytlarınıza tek hücre sıralama ve tek hücre RT-PCR yaparak bu nadir hücrelerin gen ekspresyon analizi keşfedebilirsiniz. Bu teknikler ayrıca bu tür medulloblastom, ependimoma, pediatrik gliomları gibi diğer beyin tümörleri için de geçerlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beyin Tümörü Doku Kültürü

  1. 37 ° C su banyosuna 15 yapay BOS ml (aCSF-bkz. Tablo 1) ve yere 200 ul çözülmüş Liberase (Roche Applied Science) ekleyin. Liberase TM ana doku örneklerinin yanı sıra kültür tumorspheres birbirinden ayırmak için kullanılan proteolitik enzim bir karışımıdır. Tripsin-EDTA aksine, Liberase yöntem yüzey antijeni CD133 korur. Yaklaşık 0.5 cm 3 Doku örneği için, biz Liberase 200 ul kullanın. Doku küçük ise, biz 100 ul kullanın.
  2. Oda sıcaklığına amonyum klorür çözeltisi (kök hücre teknolojileri) getirin. Amonyum Klorür çözeltisi yavaşça diğer hücreler üzerinde en az etkisi olan kırmızı kan hücreleri lysis oluşumunu. Bir sabitleştirici içermez.
  3. Steril biyolojik güvenlik kabini içinde, kapalı Pipeti sonra, doku durulama numune kabı, girdap aCSF 5 ml ekleyin. Bu adım, kırmızı kan hücreleri (RBC) kaldırmak için yardımcı olur.
  4. Steril bir 100 mm Petri di beyin tümör dokusu aktarınsh.
  5. Ince makas veya neşter ve forseps kullanma, bulamaç kıvamına doku ayrıştırılacaktır.
  6. Liberase ile önceden ısıtılmış aCSF içeren tüp içine 10 ml normal pipet veya forseps ve transfer parçaları kullanarak örnek toplayın.
  7. Inkübatör-çalkalayıcı (30 rpm) üzerine yerleştirin ve 37 ayarlı ° C, 15 dk.
  8. Bir 50 ml Falcon tüp içine 70 mikron hücre süzgecinden doku lizat filtreleyin.
  9. 5 dakika boyunca 280 xg'de süzüntü aşağı spin.
  10. Dikkatli süpernatantı çıkan hücre pelet boyutu ve rengi değerlendirilmesi: pembe veya kırmızı granül kırmızı kan hücrelerinin artan numaraları gösterir.
  11. 1 ml PBS içinde yeniden süspanse pelet.
  12. Topak boyutunu ve kırmızı hücre kirlenme esas amonyum klorid solüsyonu (4-12 ml), uygun bir miktarda ekleyin (amonyum klorit çözeltisi çok yumuşak olan ve fazla miktarda kırmızı hücre dışındaki hücreler için zararlı değildir).
  13. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  14. Spin hücreleri5 dakika boyunca 280 xg'de aşağı.
  15. Steril PBS içinde 10 ml bir kere yıkayın.
  16. 5 ml MGK tam orta (Tablo 2) ve ultra-düşük bağlama 60 mm doku kültürü plaka (Corning) transfer süspanse edin. Biz hidrofilik ve nötr hücre eki-aracılı farklılaşma en aza indirmek için, ücret vardır kovalent bağlı hidrojel yüzeyler ile ultra-düşük bağlama kültürü tabak kullanın.

Kültüründe ilk gün için, ortamı değiştirmek gerekmez: medya rengi hafif sarı olduğunda kontör sadece gerektiği kadar 1-2 ml medya ile, daha sonra kültür ve değişim ortamı gözlemlemek devam ediyor.

2. Akış sitometrisi için Tumorsphere Ayrışma

  1. Mikroskop altında tumorspheres Değerlendirin: küre boyutu> 100 mikron ise büyük küreler merkezinde nekrotik olabileceğinden, dissosiyasyon tavsiye edilir.
  2. 15 ml konik tüp kültürü aktarın.
  3. 2-3 ml steril P ekleBS iyice plakası durulayın ve konik tüp eklemek.
  4. 5 dakika boyunca 280 xg'de santrifüjleyin.
  5. 1 süpernatant ve tekrar süspansiyon Kaldır - 2 ml steril PBS.
  6. 10 ul Liberase ekleyin.
  7. 3 dakika boyunca 37 ° C su banyosunda inkübe edin. Birden kümeleri görüldü eğer süspansiyon çıkarın ve görsel değerlendirmek, 1.000 ul pipet kullanarak yavaşça çiğnemek.
  8. Topaklanma devam ederse, ek bir 1-2 dakikalık inkübasyonun devam.
  9. 5 ml steril PBS eklenerek ve 5 dakika boyunca 280 x g santrifüj ile hücreler yıkanır.
  10. 500-1000 ul steril PBS +2 mM EDTA süpernatant ve tekrar süspansiyon çıkarın.
  11. Hücre sayısı ve tripan mavisi kullanarak canlılığı değerlendirin.
  12. PBS +2 mM EDTA 1 milyon / ml hücre sayısını ayarlayın.

3. Yüzey Boyama

  1. 12x75 mm akım tüpleri test başına 1x10 6 / ml hücre süspansiyonu 100 ul aktarın.
  2. Antikorların uygun miktarda ekleyin. Eşleştirilmiş İzotip kontrol her biri için kullanılması gerekenantikor (bkz. Tablo 3).
  3. Buz üzerinde 30 dakika süreyle inkübe edin.
  4. Her akış tüpüne 2 ml PBS +2 mM EDTA ekleyin.
  5. 4 dk, süzün ve leke için 200 xg'de santrifüjleyin.
  6. 300 ul PBS +2 mM EDTA süspanse pelet.
  7. Her bir tüpe 10 ul 7AAD canlılığı boya ekleyin ve buz üzerinde en az 15 dakika inkübe edilir.
  8. Flow sitometri ile analiz edin.

4. Akım Sitometri Toplama ve Analizi

Akış veri toplama ve analiz özellikleri aracı bağlıdır. Örnek negatif örnekleri çalıştırın ve cihaz ayarlarını İleri (boyut) ve Side (taneciklik) dağılım için kurulmuştur. Bu dağılım deseni son kullanıcı enkaz dahil, örnekteki tüm hücreleri görüntülemenize olanak sağlar. Bir bölge, genellikle ilgi hücrelerin yaklaşık çizilir. (Şekil 4a) Ayarlar ardından af ilk on yıl içinde olumsuz hücreleri yerleştirmek için gerekli tüm floresans dedektörler için kurulanluorescence yoğunluk arsa. Birden fazla boya veya florokrom kullanıldığında, tek lekeli kontroller renk kompanzasyon değerleri (floresans emisyon müdahale çıkarma) kurmak için çalıştırılması gerekir. Kullanılır ve ölü hücreler (Şekil 4b) dışlamak için çizilmiş bir ikinci bölge - canlı hücreler, örneğin 7-AAD (uyarma 488/emission 655 7-Amino-aktinomisin D) gibi bir canlılığı boya çalışırken. Bu bölgelerin her ikisinde örneklerin herhangi daha fazla analiz için uygulanır.

5. Kendini yenileme Assay

Büyük klonal küre büyüme tarafından kolaylaştırılır anahtarı testi kendini yenileme kapasitesi, sınırlayıcı seyreltme testin in vitro testtir. Tumorspheres disosiye ve kuyu başına tek bir hücreye dilüsyonlarda aşağı dağıtılır, ve kültür 7 gün içinde izleyen kürenin oluşum oranı hesaplanır. 7. gün, her hücre kaplama yoğunluk için küreler (F 0) içermeyen kuyuların yüzdesi hesaplanır ve çizilirkuyu başına hücre (x) sayısına karşılık. Her da en az bir tumorsphere oluşturmak için gereken hücre sayısı çizgi 0.37 seviyesini (C = 0 e-x) kestiği nokta tespit edilir. Hücrelerin bir Poisson dağılımı, bu hesaplama (% 37 kesişir) bütün hücre popülasyonu (Şekil 5) clonogenic kök hücrelerin frekansı yansıtır, böylece kuyu başına bir hücrenin seyreltme ile F = 0 0.37 karşılık gelir.

6. Tek Hücre RT-PCR

Farklı topluluklarda Tek hücreleri AmpliGrid slayt (Beckman Coulter kedi # AG480F) üzerinde tepki sitelerinde Beckman Coulter MoFlo XDP göre sıralanır. Tek hücreli RT-PCR üreticinin spesifikasyonlarına göre AmpliGrid Tek Bir Adım RT-PCR sistemi (Beckman Coulter kedi # OAX04515) kullanılarak yapılır. Kısaca, tek bir hücre, bir kayar AmpliGrid her bir reaksiyon yeri yatırılır, her biri bir tek hücre varlığıReaksiyon sitesi mikroskop ile onaylamıştır. Ters transkripsiyon (RT) ele geçirilmesini örnek önlemek için sıralama hemen sonra gerçekleştirilir. RT master miks kiti talimatlarına (Tablo 4) göre, taze hazırlanır. Bu reaksiyon başına 25 uM rasgele primerlerin (Promega) ve 0.03 ul kullanılır; ana karışımı 1 ul her bir reaksiyon yeri merkezine eklenir. Bu, hemen sızdırmaz çözeltisi (Beckman Coulter, cat # OAX04503) 5 ul ile kaplanır. Bir AmpliSpeed ​​slayt cycler (Beckman Coulter, cat # OAX04101) kullanılarak, slaytlar 25 ° inkübe edilir 10 dakika, 42 ° C'de 10 dakika, ve 55 ° C de 45 dakika süre ile. Ters transkripsiyon, DNase / RNase içermeyen su ile 3 ul her bir reaksiyon yeri ilave edilir ve bütün karışım, bir PCR tüp (1 tüp / sitesi) aktarıldıktan sonra. 8 ul qPCR ana karışımı (5 ul SYBR Yeşil (Quanta), 1 ul su, 10 uM ileri ve ters primerler karışımı 1 ul) ve ayrıca 2 ve: bir PCR plaka, 10 ul bir reaksiyon hacmi kantitatif PCR için kullanılmıştırMu; RT karışımın l. Gerçek-zaman ölçümü için, numuneler aşağıdaki program kullanan bir BioRad döngü cihazı üzerinde çalışır: 60 saniye için 60 saniye, 72 ° C, 30 sn için 95 ° C'de 10 dakika, 95 ° C'de 45 döngü, 60 ° C'de, ardından 72 ile 10 dakika ° C ve erime eğrisi analizi. Ct değerleri, Opticon izleyicisi 3 (BioRad) kullanılarak tayin edilmiştir. Üç genler temizlik gen olarak GAPDH dahil, hücre başına değerlendirilebilir. Gen ekspresyonu 2-ΔCt göre GAPDH ifade normalize edilir. Biyolojik teknik çoğaltır eksikliği telafi etmek için çoğaltır gibi aynı çeşit, aynı nüfusunun en az bir düzine tek bir hücre kullanılabilir.

7. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1 GBM ile temsili bir hastanın Manyetik Rezonans Görüntüleme (MRG) gösterir. Beyin tümörü örnekleri Hamilton Sağlık Bilimleri / McMaster Sağlık S olarak onaylanmış, ameliyattan hemen sonra hasta rıza elde edilirciences Araştırma Etik Kurulu. Her örnek bir kısmı rutin klinik tanı nöropatolog verilir. Şekil 2 'de gösterildiği gibi geri kalan örnek işlenir. Şekil 3 'de gösterildiği gibi bir kere büyüme faktörleri, şekil tumorspheres ile birlikte sinir kök hücre ortamı içinde kaplanmış tümör hücreleri,.

Tümör hücreleri sinir kök hücre yüzey işaretleyicileri CD133 ve CD15 ile işaretlenmiş ve Şekil 4'te gösterildiği gibi akış sitometrisi ile analiz edilmiştir.

Örneğin, CD15 + / CD133 için farklı topluluklarda Tek hücreleri +, CD15 + / CD133-, CD15-/CD133 +, CD15-/CD133- ardından 96 kuyucuğu (Şekil 5a) içine veya AmpliGrid slaytlar (Şekil 6a) halinde sıralanır.

96 plaka, kendini yenileme kapasitesi (örn. CD133 + hücreleri), (Şekil 5b) sahip tek hücreli, incu takiben (Şekil 5c) tumorspheres oluşabilirbation. Bir kendini yenileme grafiği kuyu başına oluşan kürelerin sayısını sayarak (5d Şekil) çizilebilir. Tek hücre Ampligrid slayt (Şekil 6a) reaksiyon yeri ayrılmıştır. Tek hücrelerden çıkartılan RNA ters Advalytix AmpliSpeed ​​(Şekil 6b) kullanılarak transkribe edilebilir. Elde edilen cDNA Gerçek zamanlı RT-PCR (Şekil 6c) gerçekleştirmek için kullanılır.

Şekil 1
Şekil 1. Bir hasta GBM manyetik rezonans görüntüleme (MRG). Başağrısı bir ay uzun bir geçmişi ve kusma, uyuşukluk ve görme bulanıklığı bir haftada geçmişi olan bir 16 yaşındaki kızın beyin MRI taraması. Aksiyel FLAIR sekansı büyük bi-hemisferik ("kelebek") GBM gösterir.

Şekil 2,
Şekil 2. Beyin tümörü işleme. Beyin tümörü örnekleri obta vardırameliyattan hemen sonra hasta rıza dan ined. Bunlar (a) gösterildiği gibi, mekanik olarak ayrılmış olan ve 15 dk (b) için 37 ° C'da bir 30 rpm sallanan kuluçka makinesi içinde inkübe edilerek Liberase ile aCSF daha sonra enzimatik olarak ayrılmış bulunmaktadır.

Şekil 3
Şekil 3,. BTIC nüfus kültür tumorspheres oluştururlar. Büyüme faktörleri ile tam nöral kök hücre medya kaplama Disosiye beyin tümör hücrelerine tumorspheres oluştururlar.

Şekil 4,
Şekil 4. BTIC nüfus flow sitometrik analizi. (A) Vadeli yan dağılım özelliklerini karşılık (b) canlılığı boya 7-AAD ile leke Hücreler analizi hariç tutulur enkaz dahil tüm hücreleri bir görüntü sağlar. (C) istatistiksel kadranın pozisyon (d) Tümör hücre yüzey ma ile boyanmış uygun İzotip kontrol kullanılarak belirlenirrkers CD15-PE ve CD133-APC. (D) Moflo XDP hücre sıralayıcı. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 5,
Şekil 5,. BTICs seyreltme analizi Limit kendi kendini yenileme kapasitesini ortaya koymaktadır. (A) değişik dilüsyonları Hücreleri kuyu başına (b) tek bir hücreye MGK 200 ul içeren 96 kuyu halinde sıralanır. (C) 7 günlük bir kuluçka döneminden sonra, bir tumorsphere oluşur. İkincil tumorspheres morfolojisi primer tumorspheres bu aynıdır. (D) ortalama x-kesim değeri için de en az bir tane tumorsphere oluşturmak için gereken hücrelerin sayısını göstermek için her bir tümör alt tipi için analiz sınırlayıcı seyreltme hesaplanabilir.

Şekil 6
Şekil 6. Tek BTIC hücre gen ekspresyon analizimümkünse tek hücre RT-PCR teknolojisi kullanıyor. (a) BTIC popülasyondan Tek hücreler AmpliGrid Slaytlarınıza sıralanabilir. (B) cDNA sentez Advalytix AmpliSpeed ​​kullanılarak AmpliGrid slaytlar üzerinde tek hücreler üzerinde gerçekleştirilir. (C) Gerçek zaman PCR Kantitatif tek BTIC hücrelerden sentezlenen cDNA üzerinde gerçekleştirilir.

2M NaCl 62 ml
1M KCl 5 ml
1M MgCl2 3.2 mL
155 mM NaHCO 3 169 ml
1M Glikoz 10 mL
108 mM CaCl2 0,9256 ml
Purelab Ultra H 2 0 749,84 mL

Tablo 1 yapay serebrospinal akışkan (aCSF) -. 1.000 ml.

Stok bazal ortam 500 ml
01:01 DMEM: F12 480 ml
N2 takviyesi 5 ml
1M Hepes 5 ml
Glikoz 3.0 g
N-asetilsistein (60 ug / ml) 1 mL
Nöral hayatta kalma faktörü-1 (NSF-1) 10 mL

Tablo 2. Nöral kök hücre ortam.

MGK tam medya (Kullanmadan önce taze yapılmış):
MGK bazal ortam + 20 ng / ml EGF (epidermal büyüme faktörü) + 20 ng / ml bFGF (temel fibroblast büyüme faktörü) + 10 ng / ml LIF (lösemi inhibitör faktör) * + 10 ml / ul antibiyotik-antimikotik

* Lösemi inhibitör faktörü (LIF): Millipore dan Bu reaktif bir interlökin 6 sınıf sitokin, bir pr içerirkök hücre kültürlerinin uzun vadeli bakım teşvik kök hücrelerin spontan farklılaşma bastırır otein.

Antikorlar Tedarikçi / CAT # ul / test (100 ul)
CD133 / 2 APC (293C3) Miltenyi Biotec/130-090-854 5
IgG2b APC (İzotip kontrolü) Miltenyi Biotec/130-092-217 5
CD15PE Beckman Coulter/IM1954U 5
IgG2a PE (İzotip kontrolü) Beckman Coulter/A09141 5
7AAD Beckman Coulter/A07704 10

Tablo 3. Akış antikorlar.

Bileşen Hacim (1 reaksiyon) Hacim (48 reaksiyon)
Tek Hücre RT reaksiyonu Tampon 2x 0.50 ul 30.0 ul
RNaz İnhibitör (10 U / ul) 0.02 ul 1.2 ul
5X Tek Hücre RT artırıcı 0.15 ul 9.00 ul
Tek Hücre RT Enzim Mix 0.04 ul 2.4 ul
Advablue (OAX04227) Ul 0.1 6.00 ul
Nükleaz ücretsiz su 1 ul makyaj 60 ul makyaj

Tablo 4. Tek Hücre RTPCR (kedi # OAX04515) RT master miks bileşimi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Lösemi 21 çalışmasına dayalı kanser kök hücresi hipotezine 10, meme kanseri 11 ve beyin kanseri 4,5, tümör hücrelerinin yalnızca görece küçük bir kısmını adlandırılan kanser kök hücreleri, yoğun çoğalmaya başlar ve kendini bir yeteneğe sahip olduğunu göstermektedir -yenilemek. Tümör hücrelerinin çoğu prolifere ve tümörün fenotipik imzası haline hücrelere farklılaşırlar olarak kendini yenileme yeteneğini kaybeder. Tümör muhafaza edebiliyoruz beyin tümörü nüfusun önemli hücreleri bulma beyin tümörünün mekanizma fikir verecek ve bize kökenli hücreye geri izleme için izin verecektir.

Kök hücreleri fonksiyonel olarak çok soy türev 22-24 gösteren kendi kendini yenileyen hücreler olarak tanımlanır. Birincil beyin tümör dokusu önceden tumorspheres gibi nöral kök hücrelerin izolasyonu için kurulan, kök hücre büyümesi lehine kültür koşullarında yetiştirilen 6,26 kendini sürekli yenileyen ve genişletilebilir kök hücrelerin proliferasyonunu indükler. Ne olursa olsun patolojik alt tipi, primer kültür 24 ila 48 saat içinde, çoğu beyin tümörleri klon elde neurosphere benzeri kümeleri veya tumorspheres içine büyüme gösteren hücrelerin bir azınlık kısmını verir. Böylece hastanın beyin tümörü dokulardan BTIC popülasyonlar için zenginleştirmek için edebiliyoruz.

27 ve monoklonal antikor teknolojisinin 28 sıralama çok parametre floresan aktive hücre gelişi hücre yüzey işaretleyicileri esas kanser kök hücrelerin saflaştırılması mümkün kılmaktadır. Böyle CD133 ve CD15 gibi kök hücre belirteçleri kullanarak, prospektif özgü kök hücre benzeri popülasyonların sıralamak ve sınırlayıcı seyreltme testleri gerçekleştirerek kendi kendini yenileme kapasitesini incelemek mümkün olmuştur. Bir caveakendini yenileme testlerinin t in vitro kendini yenileme zaman fare modellerinde 29 ve tümör oluşumu ile ilişkili olmadığını gösteren yeni bir çalışma tarafından tanıtıldı. Ancak bizim son çalışmalar in vitro kendini yenileme tayinlerde BTIC biyoloji 30 sürekli çalışma için değerli bu ölçümlerin rendering, hasta sağkalım ile korelasyon yok olduğunu göstermiştir.

Birincil insan dokusu ile çalışma bir çok teknik zorluklar sunuyor. Doku işleme izole edilmiş hücrelerin canlılığı korumak için çok yavaşça yapılmalıdır. Kuluçka ikinci Liberase miktarı ve zaman çok önemlidir. Hücrelerin Akış sıralama farklı memeleri ve basınçlar kullanılarak post-sıralama canlılığı artırmak için optimize edilebilir. Bizim hücrelerin kılıf basıncı 30 psi az 100μm nozul yoluyla sıralanabilir tercih olduğunu bulmak. Ampligrid slayt reaktif siteleri üzerine sıralanması oldukça zor olabilir: bu mikroskop ile tevdi hücre varlığını doğrulamak için önemlidir.

31 için devam eden arama çalışmalarına en büyük mücadelelerden biri. Beyin tümörlerinin tipik olarak sinir soy belirteçler, çeşitli ifade morfolojik olarak farklı hücre oluşmaktadır. Geleneksel histopatoloji ile beyin tümörlerinin Çalışması yalnızca tümörün klinik davranışını bilgisi sınırlı bir miktarda vermiştir. Önemli ilerlemeler bazı beyin tümörleri 3,32-34, özellikle medulloblastomlar ve malign gliomlar ve bu tespit değişikliklerin bazıları artık tedaviye rehberlik başlıyor moleküler genetik değişimler anlayışı yapılmış olmasına rağmen, bu net değil tüm tümör olmadığını hücreler tümör büyüme sağlamak için yeteneklerini eşdeğerdir. Beyin tümörü popülasyonlarda sinyal yollarının kilit rol oynayan genlerin analizi beyin tümörü oluşumuna yol açan anormal mekanizmaların anlaşılmasında ilerletmek için önemlidir. Hatta görünüşte homojen olaraknous doku hücreleri potansiyel yeteneklerini benzersiz olduğunu kanıtlamıştır. Tek hücreler içinde transkript ve protein ekspresyon düzeylerinin Analizi dinlenme durumunda ve uyaranlara 35-39 maruz kaldığında iki büyük hücre-hücre varyasyon olduğunu ortaya koymaktadır. Bu yüzden, hücreler bütün nüfus analiz, tek bir hücre davranışı da ortaya çıkaracaktır. qRT-PCR mRNA ölçümü 40-41 için altın standart olarak kabul edilir. Bu çalışmada, biz AmpliGrid slaytlarda farklı toplumlarda bireysel hücrelerin prospektif sıralama göstermektedir. Tek hücre RT-PCR kullanarak, böylece karışık bir nüfus içinde seçilen hücrenin biyolojik önemi değerlendirerek, heterojen nüfus tek bir hücre üzerinde gen ekspresyon analizi gerçekleştirmek için edebiliyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

Bu çalışma Kanser Araştırma Ontario Enstitüsü (OICR), Terry Fox Vakfı ve Nörolojik Cerrahlar Amerikan Derneği tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1:1 DMEM:F12 Invitrogen 11320-082
N2 supplement Invitrogen 17502-048
1M HEPES Wisent Inc. 330-050-EL
Glucose Invitrogen 15023-021
N-acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165-25g
Neural survival factor -1 (NSF-1) Lonza Clonetics CC-4323
Epidermal growth factor (EGF) Sigma-Aldrich E9644
Basic fibroblast growth factor (bFGF) Invitrogen PHG0261
Leukemia inhibitory factor (LIF) EMD Millipore LIF1010
Antibiotic/mycotic Wisent Inc. 450-115-EL
Liberase TM Roche Group 05 401 119 001
Ammonium chloride solution Stem Cell Technologies 07850

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ohgaki, H., Kleihues, P. Epidemiology and etiology of gliomas. Acta Neuropathol. 109, 93 (2005).
  2. Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma. 10, 319 (2010).
  3. Wechsler-Reya, R., Scott, M. P. The developmental biology of brain tumors. Annu. Rev. Neurosci. 24, 385 (2001).
  4. Singh, S. K. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Res. 63, 5821 (2003).
  5. Singh, S. K. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396 (2004).
  6. Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev. Biol. 175, 1 (1996).
  7. Tropepe, V. Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev. Biol. 208, 166 (1999).
  8. Yin, A. H. AC133, a novel marker for human hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 90, 5002 (1997).
  9. Yu, Y., Flint, A., Dvorin, E. L., Bischoff, J. AC133-2, a novel isoform of human AC133 stem cell antigen. J. Biol. Chem. 277, 20711 (2002).
  10. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414, 105 (2001).
  11. Al-Hajj, M. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 3983 (2003).
  12. Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat. Med. 3, 730 (1997).
  13. Matsui, W. Characterization of clonogenic multiple myeloma cells. Blood. 103, 2332 (2004).
  14. Bao, S. Targeting cancer stem cells through L1CAM suppresses glioma growth. Cancer Res. 68, 6043 (2008).
  15. Bao, S. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444, 756 (2006).
  16. Bao, S. Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor. Cancer Res. 66, 7843 (2006).
  17. Beier, D. Temozolomide preferentially depletes cancer stem cells in glioblastoma. Cancer Res. 68, 5706 (2008).
  18. Piccirillo, S. G. Distinct pools of cancer stem-like cells coexist within human glioblastomas and display different tumorigenicity and independent genomic evolution. Oncogene. 28, 1807 (2009).
  19. Piccirillo, S. G. morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature. 444, 761 (2006).
  20. Rich, J. N., Bao, S. Chemotherapy and cancer stem cells. Cell Stem Cell. 1, 353 (2007).
  21. Lapidot, T. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367, 645 (1994).
  22. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414, 105 (2001).
  23. Fuchs, E., Segre, J. A. Stem cells: a new lease on life. Cell. 100, 143 (2000).
  24. Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157 (2000).
  25. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707 (1992).
  26. Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes. J. Neurosci. 12, 4565 (1992).
  27. Hulett, H. R., Bonner, W. A., Barrett, J., Herzenberg, L. A. Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence. Science. 166, 747 (1969).
  28. Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495 (1975).
  29. Barrett, L. E. Self-renewal does not predict tumor growth potential in mouse models of high-grade glioma. Cancer Cell. 21, 11 (2012).
  30. Venugopal, C. Bmi1 marks intermediate precursors during differentiation of human brain tumor initiating cells. Stem Cell Res. 8, 141 (2012).
  31. Gerlinger, M. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883 (2012).
  32. Gilbertson, R. J. Medulloblastoma: signalling a change in treatment. Lancet. Oncol. 5, 209 (2004).
  33. Zhu, Y., Parada, L. F. The molecular and genetic basis of neurological tumours. Nat. Rev. Cancer. 2, 616 (2002).
  34. Maher, E. A. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15, 1311 (2001).
  35. Blake, W. J., KAErn, M., Cantor, C. R., Collins, J. J. Noise in eukaryotic gene expression. Nature. 422, 633 (2003).
  36. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297, 1183 (2002).
  37. Maheshri, N., O'Shea, E. K. Living with noisy genes: how cells function reliably with inherent variability in gene expression. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 413 (2007).
  38. Raj, A. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4, e309 (2006).
  39. Ross, I. L., Browne, C. M., Hume, D. A. Transcription of individual genes in eukaryotic cells occurs randomly and infrequently. Immunol. Cell Biol. 72, 177 (1994).
  40. Kubista, M. The real-time polymerase chain reaction. Mol. Aspects Med. 27, 95 (2006).
  41. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat. Protoc. 1, 1559 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics