Инженерные Приверженец бактерии путем создания единого синтетического Curli Operon

JoVE Journal
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Дизайн синтетических кодирования оперона как секреторный аппарат и структурные мономеры curli волокон описаны. Перепроизводство этих амилоиды и приверженцем полимеров позволяет измеримые усиления приверженности

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Drogue, B., Thomas, P., Balvay, L., Prigent-Combaret, C., Dorel, C. Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon. J. Vis. Exp. (69), e4176, doi:10.3791/4176 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Метод, описанный здесь состоит в реорганизации E. палочки соблюдение свойств сборки минимальное число генов curli под контролем сильных и металлом overinducible промоутер, и в визуализации и количественной оценки результате усиления бактериальной адгезии. Этот метод применяется соответствующих инженерных принципов абстракции и стандартизации синтетической биологии, и в результате BBa_K540000 Biobrick (Best новое устройство Biobrick, инженерии, ИГЕМ 2011).

Первый шаг состоит в разработке синтетических оперона посвящена перепроизводства curli в ответ на металл, и, следовательно, в повышении приверженности способности штамма дикого типа. Оригинальный curli оперона была изменена в кремнии с целью оптимизации транскрипции и трансляции сигналов и избежать "естественный" регулирование curli. Такой подход позволил проверить с успехом наших сегодняшних представлений о производстве curli. Moreoveг, упрощение регулирования curli путем переключения эндогенный промотор комплекса (более 10 транскрипционных регуляторов определены) к простой металл-регулируемого промотора делает соблюдение гораздо легче контролировать.

Второй этап включает в себя качественную и количественную оценку соблюдения способностей путем внедрения простых методов. Эти методы применимы для широкого спектра приверженцем бактерий независимо от биологических структур, вовлеченных в формирование биопленок. Соблюдение испытания в 24-луночные планшеты из полистирола обеспечивает быструю предварительную визуализацию бактериальной биопленки после окрашивания кристаллическим фиолетовым. Этот качественный тест может быть заточена под количественная доля приверженности. Такой метод очень прост, но более точный, чем только кристалл фиолетового окрашивания, как описано ранее 1 с обеих хорошую повторяемость и воспроизводимость. Визуализация GFP с метками бактерии на предметных стеклах с помощью флуоресцентной или лазерного конфOCAL микроскопия позволяет усилить результаты, полученные с 24-луночный планшет теста путем непосредственного наблюдения этого явления.

Introduction

Бактериальные присоединение к абиотическим поддержка играет важную роль в клетках биоремедиации, биокатализа или микробных топлива. Биологическая очистка процессы используют потенциал микроорганизмов разрушать органические вещества, или изменить распределение металла (иммобилизация, испарение) или видообразования. Эти полезной деятельности наблюдается в водных и наземных экосистем, но и в искусственных системах, разработанных для лечения загрязненных вод промышленных и бытовых отходов. Интенсивность и качество микробную активность зависит от физико-химических факторов, но и от образа жизни микроорганизмов (свободно плавающий или встроенный в биопленку). Образование биопленки связано с метаболизмом содействие устойчивости к биоцидов разнообразными механизмами. Это явление, следовательно, необходимо поощрять в большинстве процессов биоремедиации. Кроме того, инженерные клетки кишечной палочки контролировать образование биопленки была успешно применена дляиммобилизации целых клеток датчиков на биочипов 2-3.

Адаптация микроорганизмов к высокой концентрации металлов происходит посредством различных механизмов, таких как адсорбция компонентов внеклеточного матрикса, активация оттока насоса или конкретных носителей в состоянии сконцентрироваться металла в клетке. Повышение этих бактериальных деятельности путем генной инженерии позволяет эффективно и дешево обработки металла загрязнения в лабораторном масштабе, особенно в случае высоко токсичных металлов в слабом количестве, как описано Raghu и соавт. 2008 4. Бактериальное восстановление в данном случае представляет конкурентоспособной и экономия метода по сравнению с классическими химическими процессами использованием ионообменных смол. Авторы описали E. палочки шасси генной инженерии для кобальта поглощения и удержания сначала выбив истечения насоса гена, кодирующего RCNA, а затем путем преобразования с несколькими копии плазмиды позволяет перепроизводстватранспортер с льготным поглощение кобальта. Такая деформация выступает в качестве эффективной альтернативы ионообменных смол для лечения радиоактивных стоков, но ключевым нерешенным вопросом является восстановление загрязненных бактериями в конце процесса 4. Целью нашей работы было, следовательно, инженер специально разработанных деформации в состоянии придерживаться абиотических опор, таких как стекло или пластик.

Среди всего множества адгезины и приверженцем фимбрий, определенных в Грам-бактерии, мы решили разработать систему, позволяющую curli производства. Curli тонкие (2-5 нм в диаметре) и очень агрегатного амилоидные волокна, которые выступают из E. палочка и сальмонелла поверхности, как некристаллических и нерастворимых матрицы 5-7. Curli также принимают участие в колонизации абиотических поверхностях и развития биопленок 8. Curli было недавно показано связывать ионы ртути 9. Амилоиды действительно как известно, обладают высокойсродство ионов металлов, таких как Cu 2 +, Zn 2 + и Fe 3 + 10. Это свойство может дальнейшему совершенствованию дезактивации металла загрязненных сточных вод. РГС кластер отвечает за производство волокон curli и составили из двух разных направлениях транскрипции оперона (рис. 1). CsgB, csgA и csgC гены составляют смысл оперона, кодирующего двух curli подразделений, CsgA и CsgB. CsgC, кажется, участвует в окислительно-восстановительной деятельности в рамках системы биогенеза curli и повлиять на CsgG пор поведение 11. Тем не менее, отсутствие csgC в большинстве curli бактерий, продуцирующих указывает, что соответствующий белок обеспечивает только вторичное уровень контроля над биогенеза curli. Для упрощения системы, мы были выбраны, чтобы работать с минимальным количеством генов.

CsgDEFG operonencodes белков, необходимых в регулировании и транспортировкииз CsgA и CsgB к поверхности клетки. CsgD является транскрипционный активатор csgBAC оперона и играет ключевую роль в управлении образования биопленки, контролируя производство curli фимбрий и другие компоненты биопленки, такие как целлюлоза 12 и путем ингибирования жгутик производства 13. CsgE, CsgF и CsgG представляют собой curli конкретных секреторный аппарат в наружной мембраны, через которую основных субъединицы белка curli CsgA выделяется в виде растворимого белка. Полимеризации CsgA зависит в естественных условиях на мембраносвязанных белков зародышей CsgB (обзор в 14). Комплекс регуляторных путей с участием нескольких двухкомпонентных систем было показано, что контроль curli экспрессии гена 15-16. Эти сложные правила позволяют бактерии образуют биопленки толстой через производство curli в ответ на экологические реплики, но трудно контролировать для промышленного применения. Для облегчения восстановления встретилисьаль-фаршированные бактерий во время производственного процесса, бактериальной фиксации на твердом носителе действительно должна находиться под контролем и определен параметр (ы). Приверженцем свойства curli связаны с их 17 природы амилоида и могут быть использованы для улучшения процессов биоремедиации, но более простой и легко управляемое устройство должно быть создано.

Среди них 7 генов 18, набор из 5 абсолютно необходимы гены curli синтеза (csgB и csgA мономеров кодирования волокна) и экспорта (csgE csgF и csgG, кодирующий комплекс curli секреции) были выбраны для построения синтетического оперона. Чтобы спастись от "естественных" регулирование curli, синтетический оперона, содержащие эти 5 генов РГС под контролем сильных и кобальт-overinducible промотора (рис. 2) был разработан и синтезирован. Шаг за шагом анализа curli кодирования региона и методика расчета для функционального синсинтетических оперона описаны. Два метода для визуализации и количественной оценки бактериальной адгезии к полистирола и стекла объяснил.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Biobrick дизайн и синтез Curli Operon

  1. Определение генетической организации и локализации эндогенных транскрипции и трансляции сигналов генов curli. Эти информации собрались в специализированных базах данных, таких как RegulonDB или EcoGene б и завершена внимательного прочтения соответствующих публикаций. Управление данными и в preanalysis кремний проводились с Клон менеджер программного обеспечения с.
  2. Выберите соответствующие кодирующие последовательности. Набор из пяти абсолютно необходимы гены curli синтеза (csgB и csgA мономеров кодирования волокна) и экспорта (csgE csgF и csgG, кодирующий комплекс Керлин секреции) были выбраны для построения синтетического оперона. Извлечение выбранных последовательностей из базы данных в формате FASTA.
    Как кластера csgGFE является антисмысловой в E. генома палочки, преобразовать эту последовательность в своем обратном counterp дополненияискусство с помощью клонов средства диспетчера операций> Процесс молекулу> Invert молекулы. Вставить csgEFG последовательности за csgBA с помощью функции "перевязывать" (Clone> перевязывать).
  3. Добавить соответствующим промотором. При размещении пяти выбранных генов curli под контролем промотора P RCN, curli, по прогнозам, будет более-производятся в присутствии кобальта и никеля. RCN локус кодирует истечения насосов ответственность за Ni и Co детоксикации (RCNA) и его родственные металло-регулятора (rcnR). RcnR контролирует экспрессию RCNA и собственных генов в ответ на Ni и Co 19. RCN последовательности, содержащей rcnR CDS, весь RCN межгенные региона, а также 41 первых нуклеотидов RCNA был placedin перед csgBAEFG химерических последовательности (рис. 1, последовательность вся конструкция предоставляется как дополнительная данных).
  4. Оптимизация транскрипционнойсигналы. Идеальный сайт связывания рибосомы (или совершенное RBS = AAGGAGGTATATA) был добавлен в передней части первого ATG последовательности ДНК csgBA. Второй совершенной RBS был добавлен в передней части csgEFG последовательности. Эндогенные RBS за csgB и csgF и csgG гены сохраняются.
  5. Для установки ИГЕМ стандартов, устройство должно быть в окружении стандартного префикса и суффикса BioBrick, содержащие сайты рестрикции для Eco RI, Pst I (префикс) и Spe I и Xba I (суффикс). Вставьте соответствующие последовательности на каждом конце устройства D.
  6. Ликвидация любых Eco RI, Pst I, Spe I и Xba я признании сайт в устройстве. Для облегчения дальнейшего процесса сборки, часть BioBrick само по себе не может содержать любое из этих сайтов рестрикции. В кремнии ограничение анализ выявил одну устройства Pst I место в последовательности csgA, один Pst I место в последовательности rcnRи один Eco RI сайт в csgE ген. Эти участки расположены соответственно в позиции 80 (Mut1), 1340 (Mut2) и 1830 (Mut3) устройства последовательность (дополнительные данные), а также были изменены следующим по молчащие мутации.
    Mut1 Pst я сайте CTGCAG изменилось в CGTCTG
    Mut2 Pst я сайте CTGCAG изменилось в CAGCAG
    Mut3 Eco GAATTC сайте RI изменилось в GAATT
  7. Запуск через перевод моделирования с использованием программного обеспечения клонов Manager (Operation> Процесс молекул> Перевести молекул). Используйте программу выравнивания последовательности взрыв, чтобы проверить, идеально гомологии между дикого типа curli белки и белки, кодируемые синтетических оперона.
  8. Закажите синтетических оперона. Коммерческие услуги синтез генов, имеются многочисленные компании по всему миру, наш партнер был Genecust (Люксембург). 4 мкг искусственного оперона (3165 б.п.) были получены несколько недель спустя и вставляют в pUC57 (pIG2).

2. Визуализация и количественно Приверженец бактерий на полистирол

  1. Заполните каждую лунку 24-луночных полистирола пластины с 2 мл M63 минимальной среды (глюкоза 0,2%) и прививать каждую лунку с 106 клетками ночной культуры. Рост бактерий при 30 ° С в течение 18 до 48 часов без встряхивания. Каждый столбец (4 скважины) представляет собой модальности. Добавить необходимое количество кобальта (25 до 100 мм) и антибиотики (ампициллин 100 мкг -1) при необходимости. 3 первых рядах 24-луночный планшет используется для количественной оценки приверженцем бактерий путем усреднения 3 повторений, последний левый ряд используется для визуализации биопленки.
  2. За 3 первых рядах 24-луночный планшет: для каждой скважины, восстановление супернатант, содержащий планктонных клеток.
  3. Тщательно промыть каждую лунку по 1 мл M63 и бассейн 1 мл мыть с начальной супернатанта, полученного в 2,2). Этот бассейн называется бассейном клеток (= S).
  4. Восстановление биопленки в 1 мл ОF M63, очищая и пипетки вверх и вниз (= B). Vortex 15 сек. Оценить количество поверхностно-прилагается и плавание бактерий из оптической плотности при 600 нм (OD 600), чтобы дать соблюдения процентах, соответствующие каждой модальности.
  5. Процент соблюдения рассчитывается по формуле: BX100 / (3xs + B).
  6. Только за последнюю строку в 24-луночный планшет: отказаться от планктонных клеток.
  7. Промыть 1 мл M63 биопленки, которая сложилась на дне тарелки.
  8. Сухие пластины открыты в течение 1 часа при 80 ° C.
  9. Добавить 100 мкл 20% кристаллического фиолетового в течение 2 мин в каждую лунку следуют обширные промывки водой для визуализации поверхности подключенных бактерий.
    Три независимые анализы (пластины) должны быть выполнены, чтобы обеспечить воспроизводимость.

3. Визуализируйте Приверженец бактерий на стекле с помощью микроскопа

  1. Получить флуоресцентные шасси. E. палочки SCC1 электронной штамм, который constitutivelУ выражает зеленого флуоресцентного белка (GFP) без заметных отличия от родительского штамма MG1655 20 является подходящим хозяином для плазмиды подшипник синтетических curli оперона.
  2. Преобразование SCC1 с pIG2 плазмиды (= синтетических curli оперона вставляется в Eco RI / Pst я сайте pUC57 плазмиды), чтобы получить S23 напряжения. Преобразование SCC1 с контрольной плазмиды (pUC18) для получения контрольного штамма S24 21.
  3. Расти ночь precultures из S23 и управления (S24) штаммов при 30 ° C в М63 среде с глюкозой (0,2%) и ампициллин (100 мкг -1).
  4. Инокулировать 15 мл той же среды в чашках Петри с 100 мкл precultures. Добавить соответствующей концентрации кобальта (т.е. 25 мкм) и не забывать отрицательный контроль без кобальта. Ввести 3 прямоугольных покровного стекла в каждой чашке Петри. Выдержите в течение ночи при 30 ° C без встряхивания.
  5. Удалить покровное сюдам чашку Петри и тщательно осушить его. Тщательно очистите нижнюю часть лица с небольшой материал хлопка пропитана 70 ° этанола вытирая каждый бактериальных остатков. Для конфокальной наблюдения, очистить и верхние концы на несколько миллиметров для дальнейшей фиксации покровное.
  6. Приверженец бактерии могут быть визуализированы напрямую, но быстро под флуоресцентным микроскопом, но тщательно избегать сушки образца.
  7. Для конфокальной наблюдения, хранение покровное на предметное стекло с верхней поверхности покрыты биопленки лицевой стороной вверх. Биопленки затем покрывается большим покровным, который крепится к стеклу лаком. Инверсия установки, так что биопленки теперь будет на нижней части лица.
  8. Место установки под конфокальный лазерный микроскоп. Право Axioplan2 LSM510 (Zeiss) конфокальный лазерный микроскоп был использован на платформе F Platim.
  9. Установка. Excite GFP при 488 нм, и собирать бактериальные флуоресценции в диапазоне от 500 до 600 нм . Используйте 40x цель погружения нефти для получения изображений в лазерной сканирующей конфокальной режиме. Сканирование общей трехмерной структуры биопленки с твердой поверхностью к интерфейсу с ростом средней, используя шагом 1 мкм.
  10. Выполните трехмерной проекции с Imaris программного обеспечения (Bitplane, Цюрих, Швейцария). Определение толщины биопленки на основе анализа среднего значения г по статистическим продольные срезы. Количественное biovolumes биопленки могут быть извлечены из конфокальной Z-стеки, как описано в другом месте 22.

RegulonDB предоставляет информацию о механистической оперона организации и их разложение на единицы транскрипции, промоутеров и их сигма типа, гены и их сайты связывания рибосом, терминаторы, сайты связывания транскрипционных регуляторов конкретной, а также их организация в нормативных фраз.ET = "_blank"> http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp

б EcoGene база данных содержит обновленную информацию о E. соН К-12 генома и протеома последовательностей, в том числе обширную библиографию ген. Одним из основных направлений EcoGene была переоценка сайтов начала трансляции. http://ecogene.org/

С http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm

г http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix

электронной дар Чун Чау Цзе, Nan Yang технический университет, Сингапур.

F Platim микроскопических платформы UMS3444 BioSciences Gerland - Lyon Sud.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В кремнии аннотации дикой последовательности РГС типа E. палочки K12, связанные с оптимизацией транскрипции и трансляции сигналов позволило разработать единый синтетический curli оперона P RCN-CSG показано на рисунке 3 (полная последовательность в дополнительных данных). Протокол 2 и 3 протокола были использованы для визуализации и количественной оценки соблюдения связанных с производством curli. Использование кристаллического фиолетового окрашивания на 24-луночных планшетах полистирола (Protocole 2) образование биопленки на дне каждой лунки можно быстро визуализировать и кажется, что штамм дикого типа меньше, чем приверженцем инженерных деформации, как показано различие в интенсивности цвета фиолетовый (рис. 4а). Это качественный подход подкрепляется количественного измерения, которая показывает, что процент соблюдения в 1,5 раза выше в инженерии штамм (рис. 4В). Кроме того, точность количественного TIVE подход позволяет измерять значительное усиление приверженности в присутствии возрастающих концентраций кобальта. Действительно, в средствах массовой информации с кобальтом концентрации 0 мкм, 25 мкм и 50 мкм, проценты прилипшие клетки достигают 25%, 30% и 40% соответственно (рис. 4В). Соблюдение способности также могут быть сравнены с использованием микроскопии с GFP с метками бактерий, выращенных на стеклах. Эпифлуоресцентной наблюдения микроскопии (зеленые бактерии на черном фоне) показывает, что инженерные штамм образует несколько слоев большой совокупности рассматриваются как биопленки, в то время как штамм дикого типа образует только микро-колонии (рис. 5). Конфокальной микроскопии анализ обеспечивает общее представление о биопленки трехмерной структурой и подтверждает, что инженерные штамм прочнее, образуя плотные и толще биопленки (рис. 6).

4176fig1.jpg "ALT =" Рисунок 1 "/>
Рисунок 1. Curli дикого типа системы. Curli состоят из двух мономеров, кодируемый csgB и csgA генов. Благодаря их сигнального пептида, CsgA и CsgB curli мономеров перемещаются через цитоплазматические мембраны через систему гл. Конкретный механизм состоит из 3 основных компонентов, а именно CsgE, CsgF и CsgG позволяет перемещение мономеров curli через внешнюю мембрану.

Рисунок 2
Рисунок 2. Сильным и кобальта индуцибельной-промотора (BBa_K540001). Промоутера P RCNA контролируется транскрипционный репрессор RcnR. Ген транскрибируется rcnR от его эндогенного промотора P rcnR, в разных направлениях от P RCNA. Наличие гена rcnR обеспечивает правильное соотношение репрессора копий по сравнению с P RCNA нормативныхрегиона. В отсутствие кобальта, RcnR связывается с RcnR окно на ДНК и препятствует полному транскрипционной активации генов вниз по течению. Если внутриклеточной концентрации кобальта растет, обязательные кобальта в RcnR белков препятствует фиксации репрессор с промотором и транскрипционной активности увеличивается PrcnA 19.

Рисунок 3
Рисунок 3. Синтетических оперона curli. Curli гены находятся под контролем P RCNA. Ген rcnR выразил от своего промоутера должны обеспечить достаточно репрессор контролировать экспрессию генов в curli кобальта зависимым образом. Чтобы избежать периплазматического пробке из-за перепроизводства curli мономера (CsgB и CsgA), компоненты curli конкретного аппарата секреции (CsgE, CsgF и CsgG) должны быть перепроизводство тоже. Добавлено traductional сигналов в dicated в сером (RBS = Идеальный RBS). E = Eco RI X = Xba I S = Sph I P = Pst I. Этот синтетический часть называется Bba_K540000 позволяет инженерии штамм, чтобы стать приверженцем стекла, песка или пластмассы через перепроизводства curli.

Рисунок 4
Рисунок 4. Визуализации и количественной оценки приверженцем бактерий на 24-луночных полистирола пластины. А. Кристаллический фиолетовый окрашенных биопленки образуются от прикосновения бактерий на полистирол. B. Процент соблюдения на полистирол дикого типа и инженерных штаммов с различными концентрациями кобальта. Статистические различия между процедурами обозначены строчными буквами (дисперсионного анализа и младшего Фишера разница, р <0,05).

76/4176fig5.jpg "ALT =" Рисунок 5 "/>
Рисунок 5. Эпифлуоресцентной изображений микроскопии приверженцем GFP с метками бактерии на стеклах. Бактерии зеленого на черный фон. Стрелки указывают на микроколоний.

Рисунок 6
Рисунок 6. Конфокальная microscropy помощь трехмерной реконструкции структуры биопленки на стеклах: А. Вид сверху реконструкций Б. реконструкций вид сбоку.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Критические шаги

Наиболее важным шагом в этом синтетический подход биологии гена дизайна. Синтетический геном дизайн должен быть тщательно для обеспечения эффективной производственной системы. Два гена, кодирующие волокна мономеров и трех генов, кодирующих белки, участвующие в их секреторной системы были собраны с сильным и металл-индуцируемый промотор, чтобы создать новый функциональный блок для романа применения: био-деконтаминации ядерных стоков. Как и было запланировано, и предсказал, это устройство приводит к усилению продукции высокого curli, которое усиливается за счет увеличения количества кобальта в среде. Такой успех обусловлен наличием двух соответствующих транскрипционных сигналов в выбранном промотора (P RCNA), а также эффективное поступательное сигналам добавляется перед каждым набором генов curli (csgBA и csgEFG) (см. Рисунок 3). Кроме того, при работе с мультикопийного плазмиды, внимание должно быть уделено число копий регулятор (ы) участвуют в промоутер управления. Здесь, multicopies из главных RcnR регулятор использовали промотор (P RCNA) были предоставлены из той же плазмиды (рис. 3).

Ограничения, возможны изменения

Для обеспечения идеальной воспроизводимости, соблюдение теста всегда должен быть выполнен в той же марки пенополистирольных плит (см. таблицу). Люминесцентной микроскопии легче с флуоресцентными метками штаммов, но это требование может быть преодолено с помощью флуоресцентных красителей, таких как Syto, или плазмиды, несущей Lac-GFP слитых 23. Прикрепление бактерий к абиотическим поверхностей, таких как полистирол и стекла зависит от ионной силы или осмолярности среды. Наилучшие результаты обычно получаются в минимальной среде или разбавленный LB 22, 24.

Будущие приложения или направления после овладения этой техникой

Содержание "> Метод, описанный здесь, чтобы количественно бактериальной адгезии является быстрым и дешевым. Тем не менее, чтобы охарактеризовать большое число штаммов или условий культивирования, и / или получить подробную структурную характеристику биопленки, высокая пропускная способность метода на основе конфокальной лазерной сканирующей микроскопии в сочетании с использованием 96-луночных микротитровальных должен быть рассмотрен 25.

MBEC система скрининга, ранее Калгари Biofilm устройство 26 может быть также использован. Эта система основана на использовании планшет со съемной крышкой, которые держат 96 колышков субстрате позволяет микроскопические наблюдения структуры биопленки 27, или количественного клеток в биопленки после разрушения ультразвуком на ультразвукового вод (MBEC высокой пропускной способностью ( HTP) анализа, Innovotech, Эдмонтон, Канада). Другая система, тест Biofilm кольца, контролирует как инертный бисером парамагнитного включены в культуральной среде закреплены в процессе формированияиз биопленки 28, и может быть использована для количественного формирование биопленок. MBEC и биопленки кольцо Тест требуют специальных материалов, которые являются более дорогостоящими, чем основные расходные материалы, используемые в этом исследовании.

Значение техники по отношению к существующим методам

Для создания единого независимого curli оперона, мы попытались двумя способами одновременно: синтетический подход, описанный здесь, и классический метод с участием мутагенеза, чтобы удалить внутренние Eco RI и Pst сайтов, которые я ограничением, и ПЦР шаги следует перевязку. Оба подхода были начаты в то же время, но последовательность анализа оперона получен классическим методом выявлено нежелательных мутаций. Таким образом, синтез устройства была более эффективной и более быстрый, чем классические клонирования и мутагенеза процедур.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Мы благодарим других членов Лион INSA-ENS ИГЕМ команды (Viviane Chansavang, Матильда Дюмон, Александра Дюпре, Мелани Жеффруа, Клеманс Gonthier, Margaux Jaulin, Орели Haag, Goki Ли, Томас Пуансо, берилл Royer-Бертран, Джули Soula, Майкл Vonzy Пьер Ив Зунделя, Soufiane Bouhmadi, Оливье Brette, Гаэль Chambonnier, Лаура Izard, Aurianne Кройс, Филипп Лежен, Аньес Rodrigue, Арно Ронделе, Сильви Reverchon и Валери Desjardin), нашим спонсорам за финансовую поддержку (bioMérieux, Assystem, EDF, Fondation INSA, ENS-Lyon и Департамент биологических наук INSA-Lyon), Ф. Вишневский-краситель для критического чтения этой рукописи и д-р CC Зи для штамма подарок. B. Drogue получает степень доктора философии стипендии от региона Рона-Альпы.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pIG2 pUC57(pMB1 ori, 2710 bp) with a 3165 bp EcoRI/PstI fragment containing the synthetic Prcn-csgBAEFG operon ; Ampr
pUC18 Multicopy plasmid (pMB1 ori, 2686 bp), Ampr
S23 SSC1 (= GFP-tagged MG1655, gift of C.C. Sze)/pIG2
S24 SSC1/pUC18
CoCl2 Sigma 0,1M stock solution kept at Room Temperature
M63 29
24-well plate Nunc 55429 Polystyrene 24-well plates

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).
  2. Melamed, S., Elad, T., Belkin, S. Microbial sensor cell arrays. Curr. Opin. Biotechnol. (2011).
  3. Melamed, S. A printed nanolitre-scale bacterial sensor array. Lab Chip. 11, 139-146 (2011).
  4. Raghu, G., Balaji, V., Venkateswaran, G., Rodrigue, A., Maruthi Mohan, P. Bioremediation of trace cobalt from simulated spent decontamination solutions of nuclear power reactors using E. coli expressing NiCoT genes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 81, 571-578 (2008).
  5. Olsen, A., Jonsson, A., Normark, S. Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli. Nature. 338, 652-655 (1989).
  6. Prigent-Combaret, C., et al. Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid. Environ. Microbiol. 2, 450-464 (2000).
  7. Chapman, M. R., et al. Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation. Science. 295, 851-855 (2002).
  8. Vidal, O. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).
  9. Hidalgo, G., Chen, X., Hay, A. G., Lion, L. W. Curli produced by Escherichia coli PHL628 provide protection from Hg(II). Appl. Environ. Microbiol. 76, 6939-6941 (2010).
  10. Garzon-Rodriguez, W., Yatsimirsky, A. K., Glabe, C. G. Binding of Zn(II), Cu(II), and Fe(II) ions to Alzheimer's A beta peptide studied by fluorescence. Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2243-2248 (1999).
  11. Taylor, J. D., et al. Atomic resolution insights into curli fiber biogenesis. Structure. 19, 1307-1316 (2011).
  12. Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J., Landini, P. The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli. Microbiology. 149, 2847-2857 (2003).
  13. Pesavento, C., et al. Inverse regulatory coordination of motility and curli-mediated adhesion in Escherichia coli. Genes Dev. 22, 2434-2446 (2008).
  14. Dueholm, M. S., et al. Fibrillation of the major curli subunit CsgA under a wide range of conditions implies a robust design of aggregation. Biochemistry. 50, 8281-8290 (2011).
  15. Jubelin, G., et al. CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity in Escherichia coli. J. Bacteriol. 187, 2038-2049 (2005).
  16. Ogasawara, H., Yamamoto, K., Ishihama, A. Role of the biofilm master regulator CsgD in cross-regulation between biofilm formation and flagellar synthesis. J. Bacteriol. 193, 2587-2597 (2011).
  17. Mostaert, A. S., Higgins, M. J., Fukuma, T., Rindi, F., Jarvis, S. P. Nanoscale mechanical characterisation of amyloid fibrils discovered in a natural adhesive. J. Biol. Phys. 32, 393-401 (2006).
  18. Hammar, M., Arnqvist, A., Bian, Z., Olsen, A., Normark, S. Expression of two csg operons is required for production of fibronectin- and congo red-binding curli polymers in Escherichia coli K-12. Mol. Microbiol. 18, 661-670 (1995).
  19. Blaha, D. The Escherichia coli metallo-regulator RcnR represses rcnA and rcnR transcription through binding on a shared operator site: Insights into regulatory specificity towards nickel and cobalt. Biochimie. 93, 434-439 (2011).
  20. Miao, H., Ratnasingam, S., Pu, C. S., Desai, M. M., Sze, C. C. Dual fluorescence system for flow cytometric analysis of Escherichia coli transcriptional response in multi-species context. J. Microbiol. Methods. 76, 109-119 (2009).
  21. Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175 (1989).
  22. Perrin, C. Nickel promotes biofilm formation by Escherichia coli K-12 strains that produce curli. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1723-1733 (2009).
  23. Bloemberg, G. V., Wijfjes, A. H., Lamers, G. E., Stuurman, N., Lugtenberg, B. J. Simultaneous imaging of Pseudomonas fluorescens WCS365 populations expressing three different autofluorescent proteins in the rhizosphere: new perspectives for studying microbial communities. Mol. Plant Microbe Interact. 13, 1170-1176 (2000).
  24. Landini, P., Jubelin, G., Dorel, C. Biological Adhesives. Callow,, J., Smith, A. M. Springer-Verlag. (2006).
  25. Bridier, A., Dubois-Brissonnet, F., Boubetra, A., Thomas, V., Briandet, R. The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method. J. Microbiol. Methods. 82, 64-70 (2010).
  26. Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
  27. Harrison, J. J., et al. The use of microscopy and three-dimensional visualization to evaluate the structure of microbial biofilms cultivated in the Calgary Biofilm Device. Biol. Proced. Online. 8, 194-215 (2006).
  28. Chavant, P., Gaillard-Martinie, B., Talon, R., Hebraud, M., Bernardi, T. A new device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria. J. Microbiol. Methods. 68, 605-612 (2007).
  29. Miller, J. E. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.Y. (1972).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics