الكم النقاط المدمجة لواحدة جزيء التصوير

Published 10/09/2012
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Engineering

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

وصفنا إعداد نقاط الكم الغروية مع حجم مصغر لتصوير الهيدروديناميكية مضان واحدة جزيء. مقارنة نقاط الكم التقليدية، هذه الجسيمات النانوية هي مماثلة في الحجم إلى البروتينات الكروية وهي الأمثل لواحدة جزيء السطوع والاستقرار ضد التحلل الضوئي، ومقاومة غير محددة ملزمة للبروتينات وخلايا.

Cite this Article

Copy Citation

Smith, A. M., Nie, S. Compact Quantum Dots for Single-molecule Imaging. J. Vis. Exp. (68), e4236, doi:10.3791/4236 (2012).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

واحدة جزيء التصوير أداة مهمة لفهم آليات وظيفة الجزيئية البيولوجية والرؤية وعدم التجانس المكاني والزماني من السلوكيات الجزيئي التي تكمن وراء البيولوجيا الخلوية 1-4. الصورة لجزيء الفردية للمصلحة، فمن عادة مترافق إلى علامة فلوري (صباغة، البروتين، وحبة، أو الكم نقطة)، ولاحظ مع epifluorescence أو الكلي المجهر التأمل الداخلي (TIRF) مضان. بينما الأصباغ والبروتينات الفلورية كانت الدعامة الأساسية لمضان التصوير على مدى عقود، من مضان غير مستقر في ظل تدفقات عالية الفوتون اللازمة لمراقبة الجزيئات الفردية، مما أسفر سوى بضع ثوان للمراقبة قبل فقدان كامل للإشارة. حبات الخرز والمطاط صبغ المسمى توفير الاستقرار تحسنت إشارة لكن على حساب حجم أكبر بشكل كبير الهيدروديناميكية التي يمكن أن تغير deleteriously نشر وسلوك جزيء قيد الدراسة

ntent "> نقاط الكم (QDs) توفر التوازن بين هذين النظامين للمشاكل. وتتكون هذه الجسيمات النانوية من المواد أشباه الموصلات ويمكن هندستها مع الحجم الصغير مع المقاومة hydrodynamically استثنائية للتحلل الضوئي 5. وهكذا في السنوات الأخيرة كان لها دور أساسي QDs في تمكين على المدى الطويل مراقبة سلوك الجزيئات المعقدة على مستوى جزيء واحد، ولكن ما زالت هذه الجسيمات تم العثور لعرض ضعف الانتشار في البيئات المزدحمة مثل الجزيئية السيتوبلازم الخلوي ومتشابك الخلايا العصبية الحلقي، حيث لا تزال أحجامها كبيرة جدا 4،6 ، 7.

ونحن مؤخرا المهندسة والنوى والطلاء سطح QDs لحجم مصغر الهيدروديناميكية، في حين تحقيق التوازن بين إزاحة للاستقرار الغروية، صمود للضوء، والسطوع، وملزم غير محددة التي أعاقت فائدة QDs المضغوط في 8،9 الماضية. الهدف من هذه المقالة هو لإثباتتركيب، وتعديل، وتوصيف هذه البلورات النانوية الأمثل، يتكون من قرص مضغوط سبائك الزئبق X 1-X سي الأساسية المغلفة مع الزنك العازلة ذ CD 1-Y قذيفة S، المزيد المغلفة مع يجند البوليمر تعديل متعدد الأسنان مع البولي ايثيلين جلايكول قصيرة ( PEG) سلاسل (الشكل 1). مقارنة مع البلورات النانوية CdSe التقليدية، الزئبق أسطوانة 1-X سبائك سي تتيح قدرا أكبر من عائدات الكم من مضان، مضان في الأطوال الموجية الحمراء وتحت الحمراء القريبة لتعزيز إشارة الضوضاء لفي الخلايا، والإثارة في غير السامة للخلايا موجات مرئية. متعدد الأسنان الطلاء البوليمر ربط سطح النانوية في التشكل مغلقة ومسطحة لتقليل حجم الهيدروديناميكية، وPEG يحيد التهمة سطح ملزمة للحد من غير محدد إلى الخلايا والجزيئات الحيوية. والنتيجة النهائية هي النانوية مع نيون الزاهية الانبعاثات بين 550-800 نانومتر وحجم إجمالي الهيدروديناميكية بالقرب 12 ميل بحري. هذا هو في لياليمجموعة AME حجم والعديد من البروتينات الكروية قابلة للذوبان في الخلايا، وأصغر بكثير من مضاد للفيروسات التقليدية QDs (25-35 نانومتر).

Protocol

الإجراءات التالية تنطوي على تجميع الهواء القياسية خالية من التقنيات واستخدام فراغ / مشعب الغاز الخامل، ويمكن العثور على منهجية مفصلة في المراجع 10 و 11. وينبغي استشارة MSDS لجميع المواد القابلة للاشتعال والسامة قبل الاستخدام، وينبغي أن aliquoted المركبات القابلة للاشتعال جميع و / أو الهواء قابل للتغيير، إلى الحاجز قارورة مختومة في علبة القفازات أو كيس القفازات.

1. توليف سيلينيد الكادميوم الزئبق (Hg أسطوانة 1-X SE) الكم دوت النوى

  1. إعداد الحل M 0،4 من السيلينيوم في trioctylphosphine (TOP). إضافة السيلينيوم (0،316 ز، 4 ملمول) إلى قارورة 50 3 مل العنق، ثم إخلاء وملء مع الأرجون باستخدام خط Schlenk. تحت الهواء خالية من الشروط (النيتروجين الجاف أو جو الأرجون)، إضافة 10 مل TOP والحرارة إلى 100 درجة مئوية مع التحريك لمدة 1 ساعة إلى تسفر عن واضحة، عديم اللون الحل. الحل لتبريد درجة حرارة الغرفة وتعيين قارورة جانبا.
  2. إلى قارورة 250 3 مل العنق، إضافة أكسيد الكادميوم (CDO 0،0770 ز، 0.6 ملمول)، tetradecylphosphonic حمض (TDPA، 0،3674 غرام، 1،32 ملمول)، وoctadecene (ODE، و 27.6 مل)، وإجلاء الحل باستخدام خط Schlenk مع التحريك. زيادة درجة الحرارة إلى 100 درجة مئوية وإجلاء ل15 دقيقة إضافية لإزالة الشوائب نقطة الغليان المنخفضة.
  3. تحت الأرجون أو غاز النيتروجين، تسخين الخليط إلى C ° 300 لل1 ساعة بحل تماما CDO. والحل تغيير من لون ضارب الى الحمرة لواضحة وعديم اللون. الحل لتبريد درجة حرارة الغرفة.
  4. إضافة hexadecylamine (HDA، 7.0 غرام) في حل الكادميوم، والحرارة إلى 70 درجة مئوية، وإجلاء. مرة واحدة أن يتحقق الضغط المستمر، وزيادة درجة الحرارة إلى 100-110 ° C والجزر الحل لمدة 30 دقيقة. تبديل صمام خط Schlenk لغاز خامل وإدراج الحرارية مباشرة إلى الحل.
  5. تحت الهواء خالية من الشروط، إضافة diphenylphosphine (DPP، 100 ميكرولتر) إلى حل وزيادة درجة الحرارة إلى 310 درجة مئوية. إزالة 7،5 مل من الحل 0،4 TOP-SE M(3 السيلينيوم ملمول) في المحاقن البلاستيكية لتعلق على إبرة قياس 16.
  6. مرة واحدة في درجة حرارة C ° equilibrates 310، تعيين تحكم في درجة الحرارة إلى 0 ° C وحقن بسرعة الحل TOP-SE مباشرة في حل الكادميوم. والحل تغيير من عديم اللون إلى اللون البرتقالي والأصفر ودرجة الحرارة ستنخفض بسرعة وزيادة مرة أخرى إلى ~ ° C. 280 بعد 1 دقيقة من رد الفعل، وإزالة قارورة من عباءة التدفئة وتبريد بسرعة مع تيار من الهواء حتى درجة حرارة أقل من 200 درجة مئوية.
  7. عندما تصل درجة الحرارة إلى 40 درجة مئوية ~، مع تخفيف الهكسان مل 30؛ معظم السلائف الكادميوم المتبقية سوف يستقر من الحل. إزالة هذا الراسب بواسطة الطرد المركزي (5،000 x ج، 10 دقيقة).
  8. في كل ستة البولي بروبلين 50 مل أنبوب الطرد المركزي المخروطية، يخفف 12 مل من الحل النانوية الخام مع الأسيتون مل 40، الطرد المركزي (5،000 x ج لمدة 10 دقيقة)، وصب بعناية وتجاهل طاف.
  9. حل nanocrystal الكريات في الهكسان (25 مل الحجم الكلي). استخراج هذا الحل 3 مرات مع حجم مساو من الميثانول، والإبقاء على المرحلة الأعلى. لاستخراج ثالث قد يكون تعديل حجم الميثانول لمل 15 ~ للحصول على حل الهكسان مركزة من QDs CdSe نقية في ما يقرب من 200 ميكرومتر. العائد نموذجية من هذا التفاعل هو 3 ميكرومول من البلورات النانوية التي يبلغ قطرها CdSe قدره 2.3 نانومتر (50-60 العائد رد فعل٪).
  10. تحديد قطرها النانوية والتركيز عن طريق قياس طيف الامتصاص للأشعة فوق البنفسجية فيس والتشاور على الرسم البياني الحجم المناسب من مولفاني وزملاء العمل (12) والارتباطات انقراض Bawendi وزملاء العمل 13. انظر الملحق لمزيد من التفاصيل.
  11. الزئبق تبادل الأيونات الموجبة: قد تكون البلورات النانوية تبادل جزئيا مع الزئبق الأحمر لتحويل الامتصاص والانبعاثات مضان. مزيج التالية معا من أجل قارورة زجاجية في 20 مل مع stirbar (يمكن تحجيم هذا التفاعل على النحو المرغوب فيه): 3 مل هكسان، 2 مل كلوروفورم، 1 مل الكادميوم ميكرومتر 200SE QD حل (200 نانومول) و 15 ميكرولتر oleylamine (OLA)، و 500 ميكرولتر من حل M 0.1 من الزئبق (OT) 2 في الكلوروفورم. قد تكون مستعدة الزئبق octanethioate (HgOT 2) عن طريق تفاعل خلات الزئبق وoctanethiol في الميثانول (انظر الملحق). أثناء سير الموجبة تبادل رد فعل، يمكن رصد مدى التحول الحمراء مع القياس الطيفي امتصاص الأشعة فوق البنفسجية فيس. بعد تحقيق الفرقة امتصاص المطلوب، وقياس امتصاص الحل النانوية في 350 نانومتر، وتحديد معامل الانقراض جديدة، على افتراض أن تركيز النانوية لم تتغير (30.7 ميكرومتر في هذا المثال). إخماد رد فعل عن طريق إزالة الزئبق غير المتفاعل: إضافة 5 مل ديكان، 10 مل هكسان، و 7 مل الميثانول واستخراج الحل، والحفاظ على أعلى مرحلة يحتوي على البلورات النانوية. استخراج أكثر مرتين مع الهكسان والميثانول، وضبط مستوى الصوت من الميثانول ذلك أن المرحلة الأولى هي ~ 7 ملم. إذا كان مراحل بطيئة لفصل، قد يكون الحل بالطرد المركزي (5،000 XG،10 دقيقة). إضافة 100 ميكرولتر TOP، 100 ميكرولتر OLA، و 100 ميكرولتر حمض الأوليك إلى البلورات النانوية تليها الأسيتون 40 مل للحث على هطول الأمطار. جمع البلورات النانوية عن طريق الطرد المركزي وتفريق في الهكسان مل 3. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لإزالة مكونات غير قابلة للذوبان وتحديد تركيز النانوية مرة أخرى، وذلك باستخدام معامل الانقراض جديدة في 350 نانومتر. يسمح الحل النانوية إلى سن لا يقل عن 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة قبل الشروع في الخطوة التالية.

2. نمو كبريتيد الزنك والكادميوم (الكادميوم Y Y الزنك 1-S) شل

  1. إعداد 0،1 السلائف قذيفة حلول M في 50 قوارير 3-العنق مل. الكادميوم السلائف: الكادميوم هيدرات خلات (230.5 ملغ، 1 ملمول) و 10 مل oleylamine (OLA). السلائف الزنك: الزنك خلات (183.5 ملغ، 1 ملمول) و 10 مل مكتب الشؤون القانونية. السلائف الكبريت: الكبريت (32.1 ملغ، 1 ملمول) و 10 مل ODE. تحت فراغ، كل حل لتسخين الجزر لمدة 1 ساعة إلى تسفر عن حلول واضحة، ومن ثم توجيه الاتهام مع الأرجون. يجوز للحل الكبريتيتم تبريده الى درجة حرارة الغرفة، ولكن يتم الاحتفاظ السلائف الكادميوم والزنك في حوالي 50 ° C. ويمكن الاطلاع على حسابات كميات السلائف قذيفة في إشارة 14.
  2. إضافة إلى قارورة 3-العنق: HG أسطوانة 1-X سي QDs (120 نانومول، 2.3 نانومتر قطر)، ODE (2 مل)، وأكسيد trioctylphosphine (TOPO، 250 ملغ). إخلاء قبالة الهكسان في درجة حرارة الغرفة باستخدام سطر Schlenk. زيادة درجة الحرارة إلى C ° 100 و الجزر لمدة 15 دقيقة. تغيير صمام خط Schlenk لالأرجون أو غاز النيتروجين وإدراج الحرارية في حل النانوية.
  3. زيادة درجة الحرارة إلى 120 درجة مئوية، إضافة 0،5 monolayers من حل السلائف الكبريت (140 ميكرولتر)، والسماح للرد فعل على المضي قدما لمدة 15 دقيقة. قد تتم إزالة مأخوذة الصغيرة (<50 ميكرولتر) باستخدام حقنة زجاجية لرصد التقدم المحرز في رد الفعل باستخدام مضان و / أو القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس الاستيعاب. زيادة درجة الحرارة إلى 140 درجة مئوية، إضافة 0،5 monolayers من حل السلائف الكادميوم (140 ميكرولتر)، والسماح للرد فعل على المضي قدما لمدة 15 دقيقة. إضافة 500 ميكرولتر اللامائية OLA إلى محلول التفاعل.
  4. في 160 ° C إضافة 0،5 monolayers من حل السلائف الكبريت (220 ميكرولتر)، يليه كمية متساوية من محلول الزنك السلائف في 170 ° C 15 دقيقة مع بين كل إضافة. ثم في 180 ° C إضافة 0،25 monolayers من حل السلائف الكبريت (150 ميكرولتر) والزنك حل السلائف في فترات 15 دقيقة.
  5. تبريد الحل لدرجة حرارة الغرفة وحساب معامل الانقراض مرة أخرى جديدة لهذه الجزيئات باستخدام الطيف للأشعة فوق البنفسجية فيس، على افتراض أن عدد البلورات النانوية لم يتغير (120 نانومول في 3.8 مل محلول التفاعل). تخزين محلول التفاعل على شكل مزيج النفط الخام في الثلاجة، ويمكن إذابة البلورات النانوية وتنقيته وحسب الحاجة باستخدام نفس الطريقة الموضحة في الأقسام 1.8 و 1.9.
  6. ويمكن وصف البلورات النانوية باستخدام المجهر الإلكتروني، UV-فيس طيف الامتصاص، والتحليل الطيفي مضان. قد يكون العائد الكمتحسب على الاطلاق باستخدام المجال دمج أو نسبيا بالمقارنة مع معيار معروف باستخدام الطرق المرجعية 15.

3. المرحلة نقل

  1. إضافة تنقية الأساسية / شل الزئبق أسطوانة 1-X SE / مؤتمر نزع السلاح Y Y الزنك 1-S QDs (5 مل، 20 ميكرومتر) إلى 50 مل 3 العنق وإزالة قارورة الهكسان تحت فراغ عالية لانتاج فيلم الجافة. ملء القارورة مع الأرجون، إضافة اللامائية بيريدين (3 مل) للفيلم جسيمات متناهية الصغر والحرارة الطين إلى 80 ° C. على مدار ساعة من 1-2 سوف تذوب تماما النانوية.
  2. إضافة 1-thioglycerol (1 مل) في حل ويحرك المزيج لمدة 2 إلى 80 ساعة C °. ثم يبرد المحلول إلى درجة حرارة الغرفة وإضافة الترايثلامين (0.5 مل) إلى deprotonate thioglycerol. يحرك المزيج لمدة 30 دقيقة. الحل قد يصبح غائما بعد إضافة الترايثلامين بسبب ذوبان سوء البلورات النانوية القطبية في هذا الخليط المذيب.
  3. نقل الحل QD إلى 50 مل المخروطية أنبوب الطرد المركزي تابعaining خليط من الهكسان مل 20 و 20 مل الأسيتون، وتخلط جيدا. عزل البلورات النانوية عجلت عن طريق الطرد المركزي (5،000 x ج، 10 دقيقة)، وغسل بيليه مع الأسيتون.
  4. حل بيليه QD في DMSO (5 مل) مع حمام صوتنة، ومن ثم الطرد المركزي (7،000 x ج، 10 دقيقة) لإزالة الركام ممكن. تحديد تركيز جسيمات متناهية الصغر من طيف الامتصاص للأشعة فوق البنفسجية فيس. وينبغي استخدام هذا الحل من QDs النقي بعد 3 ساعة، كما يمكن أكسدة ثيول سطح ببطء في ظل الظروف المحيطة في الهواء.
  5. تمييع الحل QD إلى 10 ميكرومتر أو أقل مع DMSO ونقل إلى قارورة 50 مل. إعداد 5 ملغ / مل حل حامض polyacrylic thiolated (التوليف وصفها في الملحق) في DMSO. إضافة الحل البوليمر (0.15 ملغ البوليمر في QDs نانومول) نقطه نقطه في حل QD مع التحريك وديغا الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  6. تطهير الحل QD / البوليمر مع الأرجون والحرارة إلى 80 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. ثم يبرد المحلول إلى درجة حرارة الغرفة لد البطيئه إضافة حجم مساو من 50 ملي بورات الصوديوم، ودرجة الحموضة 8. يحرك المزيج لمدة 10 دقيقة.
  7. تنقية QDs عبر غسيل الكلى (20 كيلو دالتون قطع) في 50 ملي بورات الصوديوم، ودرجة الحموضة 8، ومن ثم تركيز الجسيمات باستخدام عامل تصفية الطرد المركزي (10 كيلو دالتون قطع). تحديد تركيز من طيف الامتصاص للأشعة فوق البنفسجية فيس.

4. PEG طلاء

  1. في قارورة زجاجية مع 4 مل stirbar، مزيج 1 QDs نانومول في المخزن المؤقت بورات مع الزائدة X 40000 المولي من 750 غليكول البولي إثيلين-monoamino دا (30 ملغ، 40 ميكرومول). إذا وظيفة كيميائية معينة هو أن تضاف إلى البلورات النانوية (مثل هيدرازيد أو maleimide)، قد يتم عرضه من خلال استبدال جزء من PEG-الأمينية مع PEG-الأمينية heterobifunctional (30٪ الكسر الجزيئي يعمل عادة بشكل جيد). تمييع الحل النانوية إلى 1 ميكرومتر مع العازلة بورات. قد يمكن تحجيمها هذا التفاعل على النحو المرغوب فيه.
  2. إعداد الحل DMTMM جديدة من (20 ملغ و 72 ميكرومول) في DMSO (144 ميكرولتر). يمكن هذا الحل لفترة وجيزة ساخنة شالتانجو تيار من دافئ الصنبور أو المغمورة في المياه في حمام sonicator بحل تماما DMTMM. إضافة بسرعة تتجاوز 25000 X المولي هذا محلول 0.5 M DMTMM (50 ميكرولتر) إلى حل QD ويقلب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  3. كرر الخطوة 4،2 أكثر أربع مرات لتشبع السطح النانوية مع PEG. وأخيرا، أضف 200 ميكرولتر العازلة 1 M تريس لإرواء التفاعل وتنقية البلورات النانوية باستخدام غسيل الكلى والفلاتر الطرد المركزي، أو تنبيذ فائق.
  4. ويمكن تحليل البلورات النانوية لmonodispersity، حجم الهيدروديناميكية، وتهمة السطحية باستخدام اللوني السائل، الاغاروز الكهربائي للهلام، والفحص المجهري مضان. لتحديد حجم وتوزيع حجم الهيدروديناميكية باستخدام النظام الآلي اللوني السائل (GE AKTAprime بلس)، استخدم Superose 6 العمود، معدل تدفق قدره 0.5 دقيقة / مل مع شاطف العازلة PBS، وكشف عن امتصاص في 260 أو 280 نانومتر. قارن مرات شطف جسيمات متناهية الصغر مع تلك المعايير الوزن الجزيئي. لelectropho هلام الاغاروزresis، إعداد 0.5٪ الاغاروز هلام في 50 ملي العازلة بورات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 8.5) أو 50 ملي فوسفات الصوديوم العازلة (درجة الحموضة 7.4)، مزيج 1 ميكرومتر مع عينات الجلسرين 10٪ والحمل في الآبار، وتشغيل عند 100 V لمدة 30 دقيقة . صورة البلورات النانوية في هلام باستخدام عصا أو جهة UV UV transilluminator والإثارة لمضان. لصورة البلورات النانوية على المستوى جزيء واحد باستخدام المجهر مضان، يخفف من الجسيمات إلى 0.2 نانومتر في 10 ملي العازلة الفوسفات، بانخفاض نسبته 2.5 ميكرولتر من الحل على ساترة الزجاج، ووضع بعناية ساترة الثاني على أعلى حبة السائل لنشر فيلم بين coverslips. صورة سطح محدد الجزيئات باستخدام الفتحة العددية العالية الهدف (على الأقل من الناحية المثالية 1.40) في أي وضع أو epifluorescence TIRF مع الإثارة في الأطوال الموجية بين 400-580 نانومتر وكاميرا CCD الإلكترون التكرار. سوف تختلف المعلمات التصوير الدقيق بين الإعداد المجهري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يصور الشكل 2 امتصاص الأطياف وممثل عن البلورات النانوية مضان CdSe، الزئبق أسطوانة 1-X البلورات النانوية سي بعد تبادل الأيونات الموجبة، والزئبق أسطوانة 1-X SE / مؤتمر نزع السلاح Y Y الزنك 1-S البلورات النانوية بعد نمو القواقع. والبلورات النانوية CdSe الأساسية لديها العائد الكم من مضان قرب 15٪ (بما في ذلك الانبعاثات العميقة فخ طويلة الطول الموجي) ولكن هذه الكفاءة انخفاض إلى أقل من 1٪ بعد تبادل الزئبق، على الأرجح بسبب تهمة الفخاخ الناقل قدم من خلال تعطيل سطح ذرة 9. إلا أن نمو قشرة رقيقة من مؤتمر نزع السلاح Y Y الزنك 1-S يعزز هذه الكفاءة إلى أكثر من 70٪، الذي يحتفظ إلى حد كبير بعد نقل المياه إلى (50٪ هو نموذجي). في المقابل، البلورات النانوية CdSe / مؤتمر نزع السلاح Y Y الزنك 1-S بدون إدماج الزئبق تفقد جزءا كبيرا من عوائدها نوعية في المياه ما لم يزرع قذيفة سميكة. وبالتالي من خلال دمج الزئبق في nanocrysta الأساسيةيمكن الحفاظ لتر، وصغر حجم النانوية (انظر TEM في الشكل 3) من دون التضحية السطوع. من المهم أن نلاحظ أن السد مع الكادميوم Y Y الزنك 1-S يتحول إلى أطياف الأحمر بسبب تسرب من حاملات الشحنة الإلكترونية في المواد قذيفة، وهذا التحول هو حوالي 20-30 نانومتر لCdSe النوى 16، ويزيد مع زيادة محتوى الزئبق في قلب (إلى 100 نانومتر).

استخدام نقل المرحلة 2-خطوة على المياه أمر حيوي للحصول على السكان متجانسة من البلورات النانوية التي لا تتطلب حجم مزيد من الفرز لإزالة كتل ومجاميع. في الخطوة الأولى، يتم نقل البلورات النانوية لDMSO باستخدام 1-thioglycerol، الذي يزيح oleylamine على سطح النانوية. ثم يتم استبدال Thioglycerol مع البوليمر ومتعدد الأسنان الخطية، مما أدى إلى درجة عالية من الاستقرار الجسيمات مع زيادة طفيفة في حجم الهيدروديناميكية الناتجة عن طلاء العضوية (<4 نانومتر contributiإلى قطر الهيدروديناميكية). وكروماتوغرام الحجم الاستبعاد هو مبين في الشكل 4A يؤكد أن حجم مشابه لتلك التي كونالبومين (75 كيلو دالتون)، وبعد التعديل مع 750 دا PEG-الأمينية، وزيادة الحجم إلى فقط 12 نانومتر، مماثلة لتلك التي من الأجسام المضادة مفتش الحكومة . PEG تعديل يحيد التهمة السطح، كما أكد الكهربائي في هلام الاغاروز التجربة هو مبين في الشكل 4B. نحن نستخدم بشكل روتيني الحجم الاستبعاد اللوني والكهربائي للهلام لتوصيف سريع لحجم وتوزيع حجم، ورسوم السطح. ويمكن أيضا ديناميكية تشتت الضوء وpotentiometry زيتا استخدامها، ولكن تشتت شريحة من هذه الجسيمات صغيرة جدا الصغر، ولقد وجدت أن النتائج من الصكوك التجارية ليست قابلة للتكرار. 5A الشكل يظهر صورة مجهرية من هذه البلورات النانوية epifluorescence المودعة على ساترة الزجاج ومتحمس مع 545 نانومتر الضوء المرئي. هذه البلورات النانوية وس بسهولة. bserved في مستوى واحد جزيء في 30 لقطة في الثانية مع كاميرا CCD الإلكترون تتضاعف 5B يوضح الشكل أن عدد الجسيمات الفلورية لوحظ في كل إطار يتقلب مع مرور الوقت مع الإثارة مستمرة، وهذا يرجع إلى مجموعة من امض والتحلل الضوئي . يهيمن امض لأول 7 دقائق قبل التحلل الضوئي ~ الأكسدة يصبح ببطء واضح.

الشكل 1
تصوير تخطيطي الرقم 1. من جسيمات متناهية الصغر الإجراء التوليف. (أ) الكادميوم والسيلينيوم السلائف الرد على توليد البلورات النانوية CdSe، والتي يتم التعامل مع الزئبق octanethiolate، الأمر الذي أدى جزئية الموجبة الكادميوم الزئبق → تبادل لانتاج الزئبق أسطوانة 1-X سبيكة ثلاثية البلورات النانوية حد ذاتها. ويزرع ثم ​​قذيفة من مؤتمر نزع السلاح Y Y الزنك 1-S على جوهر باستخدام خلات الكادميوم، خلات الزنك، والكبريت. (ب) وsynthesized، والمغلفة هذه البلورات النانوية مع يغاندس العضوية غير القطبية (oleylamine). لإذابة هذه الجزيئات في مخازن مائية، يتم استبدال يغاندس مع يجند البوليمر متعدد الأسنان، والذي يقترن تساهميا إلى PEG-الأمينية.

الشكل 2
الشكل 2. الخصائص البصرية من الزئبق أسطوانة 1-X SE / مؤتمر نزع السلاح Y الزنك البلورات النانوية 1-S ذ. (أ) الامتصاص (السوداء) ومضان الأطياف (أحمر) من CdSe النانوية النوى، الزئبق أسطوانة 1-X النوى سي بعد تبادل الأيونات الموجبة، والزئبق أسطوانة 1-X SE / مؤتمر نزع السلاح Y Y الزنك 1-S البلورات النانوية بعد نمو القواقع . ويقابل أطياف أطياف ل(ب) وضوح الإسفار من الزئبق أسطوانة 1-X SE / مؤتمر نزع السلاح Y Y الزنك 1-S مع كميات مختلفة النسبية التأسيس الزئبق. الطيف الأزرق يصور النوى مع محتوى الزئبق صفر (س = 0، CdSe).

الشكل 3
الشكل 3. نقل الإلكترون صورة مجهرية (أ) وتوزيع حجم الجسيمات (ب) من الزئبق أسطوانة 1-X SE / مؤتمر نزع السلاح Y Y الزنك 1-S البلورات النانوية، والتي تبين قطرها المتوسط ​​± الانحراف المعياري قدره 3.2 ± 0.6 نانومتر.

الشكل 4
الشكل 4. توصيف هيدرودينامي من الزئبق أسطوانة 1-X SE / مؤتمر نزع السلاح Y Y الزنك 1-S QDs في محلول مائي. (أ) حجم كروماتوغرام استبعاد البلورات النانوية المغلفة في يجند البوليمر متعدد الأسنان قبل (أحمر) وبعد (أزرق) لاقتران PEG-الأمينية. يشار إلى معايير الجزيئية البروتين الوزن فوق المؤامرات. (ب) الكهربائي للهلام الاغاروز التجربة من QDs في المخزن المؤقت بورات الصوديوم (درجة الحموضة ~ 8.5) قبل (يسار) وبعد (يمين) لاقتران PEG-الأمينية. تم وضع علامة بشكل جيد مع سهم وأقطاب يشار إلى القطب على الحق، وتبين أن الاقتران قبل أن تهاجر البلورات النانوية والجزيئات والبلورات النانوية أنيوني مضاد للفيروسات محايدة كهربية.

الشكل 5
الشكل 5. الزئبق أسطوانة 1-X SE / مؤتمر نزع السلاح Y Y الزنك 1-S QDs كثف على ساترة الزجاج العازلة الفوسفات في، تصوير المجهري مع epifluorescence. (أ) الحصول على صورة QD في 33 لقطة في الثانية. الصورة هو 15 × 15 ميكرون ميكرون. (ب) عدد QDs الفلورسنت في مجال الرؤية أثناء إضاءة مستمرة لمدة 20 دقيقة مع مصباح قوس الزئبق مع 545 نانومتر (30 نانومتر ممر الموجة) تصفية الإثارة و625 نانومتر (20 نانومتر ممر الموجة) الانبعاثات تصفية والهدف 100X NA 1.4. وبلغ متوسط ​​القياسات من 3 ميادين مشاهدة أكثر من 20 دقيقة إلى 12.5 لقطة في الثانية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مقارنة التقليدية نقاط الكم CdSe، يمكن ضبطها الثلاثي سبائك الزئبق أسطوانة 1-X البلورات النانوية سي في الحجم والطول الموجي مضان بشكل مستقل. يتم تحديد حجم أولا خلال تجميع النوى النانوية CdSe، ويتم اختيار الطول الموجي مضان في خطوة الزئبق الثانوية تبادل الأيونات الموجبة، والتي لا تغير كثيرا من حجم النانوية 9. من المهم أن يسمح للزئبق تنقية أسطوانة 1-X البلورات النانوية لاحتضان سي في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 24 ساعة قبل السد. هذا يسمح بعض الكاتيونات الزئبق كثف ضعيفة لنشر شعرية في النانوية. دون السماح لهذه العملية تحدث، والفرقة الثانية في مضان الأشعة تحت الحمراء القريب ويلاحظ في كثير من الأحيان بسبب التنوي متجانسة من البلورات النانوية من أيونات الزئبق HGS فصلها.

في المثال المعروض في هذا العمل، نحن على استعداد النوى CdSe بحجم 2،3 نانومتر بالقرب، التي يمكن أن تكونضبطها في مضان بين 550-800 نانومتر بعد السد عن طريق تغيير كمية الزئبق إدراجها في شعرية الأساسية. مع قذيفة أحادي الطبقة 2.5، وكان القطر النهائية لهذه QDs بالقرب من 3،2 نانومتر، والتي هي في جوهرها جسيمات متناهية الصغر أصغر حجم نتمكن من إعداد آن معا صامد للضوء ومشرق بما فيه الكفاية بما فيه الكفاية للتصوير واحدة جزيء (معامل الانقراض بالقرب من 350،000 M -1 سم -1 عند 400 نانومتر والعائد الكم قرب 50٪ في الماء). هذه البلورات النانوية هي أكثر إشراقا وأكثر من ذلك بكثير من البلورات النانوية صامد للضوء التي سبق وصفها مقارنة مع أحجام التي تنبعث منها أكثر من هذا النطاق الطيفي (على سبيل المثال تيل كد، إيناس، الشرطة الوطنية العراقية). مثل معظم fluorophores، ومضان من هذه الجسيمات على مستوى جزيء واحد هو متقطعة (الوميض) 5،6.

بالنسبة لبعض التطبيقات، قد يكون من المفيد استخدام البلورات النانوية أكبر إلى حد ما. باستخدام أكبر CdSe النانوية الأساسية، وbandwi مضانالبيوت أضيق بعد تبادل الأيونات الموجبة الزئبق. نموذجية بعرض ذروة التألق لمؤتمر نزع السلاح الزئبق البلورات النانوية X سي 1-X مع الانبعاثات في إطار نانومتر 600-650 نانومتر هي 50-70 نانومتر للالنوى 2.3 و 40-50 نانومتر نانومتر للالنوى 3.2. وبالتالي، تمكين أكبر البلورات النانوية قدرة أكبر لمضاعفة الطيفية. وبالإضافة إلى ذلك، سوف زيادة حجم زيادة امتصاص كذلك عبر قسم من البلورات النانوية. وزيادة سمك طبقة قذيفة CDS المؤقتة أيضا زيادة السطوع، وكذلك إطالة الاستقرار مضان خلال الإثارة. ويمكن زيادة حجم الأساسية CdSe ببساطة عن طريق تمديد مدة التوليف الأساسية CdSe، ورصد حجم فعالة من خلال امتصاص القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس.

لقد وجدنا أن QDs مائي المغلفة مع الأحماض الكربوكسيلية عرضة لامتصاص غير محددة للخلايا وبروتينات، والتي تحييد تهمة سلبية قوية في مخازن الفسيولوجية هو كرitical لتقليل التفاعلات غير محددة 17. في الأمثلة هنا، كنا قصيرة السلسلة PEG لتحييد الشحنة السطحية والحفاظ على الاستقرار في الماء. ويمكن إدخال PEG في العمود الفقري البوليمر سواء قبل المرفق إلى QDs أو بعد الطلاء. كل الإجراءات تؤدي إلى جزيئات محايدة تقريبا، ولكن تلك المغلفة الأولى مع البوليمر الكربوكسيل هي أصغر بكثير، ويفترض بسبب تفاعل متعدد الأسنان أفضل مع السطح. لتحييد كاملة مع سطح PEG، وجدنا أن إضافة المتكرر للحمض الكربوكسيلية وكلاء تفعيل ضروري نظرا لنصف العمر القصير للأنواع رد الفعل. نستخدم DMTMM في مكان أكثر الكواشف carbodiimide المشتركة (مثل EDC) بسبب استقرار تحسين DMTMM في التخزين، ونظرا لكفاءة محسنة في رد فعل المياه 18.

وأخيرا، من المهم أن نلاحظ أن النقاط الكمومية وأنواع أخرى عديدة من البلورات النانوية تحتوي علىالسامة للخلايا العناصر 5. يمكن أيونات الكادميوم والزئبق يؤثر على العمليات العادية للخلايا الحية والكائنات الحية ويمكن أن تكون مسببة للسرطان 19-21. ومع ذلك فقد تم السمسة من CdSe التقليدية / البلورات النانوية درس على نطاق واسع وZnS تم الإبلاغ عن أن البلورات النانوية المغلفة بقوة مع يغاندس العضوية مستقرة لا الحصول على ردود السامة للخلايا بشكل علني مقارنة العناصر المكونة لها، وذلك ببساطة تحتجز بكفاءة عناصرها السامة بعيدا عن العوامل المؤكسدة 5. وعلاوة على ذلك، لتطبيقات التصوير واحدة جزيء، والآثار السامة ومن المقرر المرجح أن تركيزات صغيرة للغاية تستخدم للتصوير (عادة 1 نانومتر أو أقل) التي هي أوامر من حجم أصغر من بداية اكتشاف آثار سامة (50-100 نانومتر). وقد استخدمت معظم التجارب احدة جزيء تنفيذ QDs حتى الآن متاحة تجاريا CdSe / ZnS البلورات النانوية، والتي هي أكبر بكثير من تلك الموصوفة هنا. عن طريق التقليل من نanocrystal الحجم، وانخفاض كبير في إجمالي عدد الذرات في الجزيئات السطحية والعدد الكلي للذرات سامة في الجسيمات، مما يقلل من إمكانية تأثير السمية الإجمالية ل. ومن المتوقع إدراج الزئبق في النانوية لمزيد من خفض محتمل السمية، كما هو معروف الزئبق ثنائي التكافؤ إلى أن تكون أقل سمية من الكادميوم ثنائي التكافؤ في العديد من أنواع الخلايا 19-21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور هونغ يي في جامعة إيموري الأساسية المتكاملة للتصوير المجهري المجهر الإلكتروني. وقد رعت هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح (PN2EY018244، R01 CA108468، U54CA119338، و1K99CA154006 01-).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Selenium Sigma-Aldrich 229865
Tri-n-octylphosphine Strem 15-6655 97% pure, unstable in air
Cadmium oxide Sigma-Aldrich 202894 Highly toxic: use caution
Tetradecylphosphonic acid PCI Synthesis 4671-75-4
Octadecene Alfa Aesar L11004 Technical grade
Hexadecylamine Sigma-Aldrich H7408
Diphenylphosphine Sigma-Aldrich 252964 Pyrophoric
Mercury acetate Sigma-Aldrich 456012 Highly toxic: use caution
1-Octanethiol Sigma-Aldrich 471836 Strong odor
Oleic acid Sigma-Aldrich W281506
Zinc acetate Alfa Aesar 35792
Cadmium acetate hydrate Sigma-Aldrich 229490 Highly toxic: use caution
Oleylamine Fisher Scientific AC12954 Unstable in air
Sulfur Sigma-Aldrich 344621
Trioctylphosphine oxide Strem 15-6661 99%
Pyridine VWR EM-PX2012-6 Anhydrous
Thioglycerol Sigma-Aldrich M1753 Strong odor
Triethylamine Sigma-Aldrich 471283 Anhydrous
Dialysis tubing Spectrum Labs 131342 20 kDa cutoff
Centrifugal filter Millipore UFC801024 10 kDa cutoff
Monoamino-PEG Rapp Polymere 12 750-2 750 Da
DMTMM, 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride hydrate Alfa Aesar H26333
AKTAprime Plus Chromatography System GE HealthCare
Superose 6 10/300 GL chromatography column GE HealthCare 17-5172-01
Agarose, OmniPur VWR EM-2120

Appendix

Synthesis of mercury octanethiolate: Slowly add a methanol solution of mercury acetate (1 eq.) to a stirring solution of 1-octanethiol (3 eq.) and potassium hydroxide (3 eq.) in methanol at room temperature. Isolate the mercury(II) octanethiolate precipitate via filtration, wash two times with methanol and once with ether, and then dry under vacuum.

Synthesis of multidentate polymer: Dissolve polyacrylic acid (1 g, 1,773 Da) in 25 ml dimethylformamide (DMF) in a 150 ml three-necked flask and bubble with argon for 30 min. Add an anhydrous solution of cysteamine (374 mg, 4.87 mmol) in 10 ml DMF. At room temperature with vigorous stirring, slowly add anhydrous diisopropylcarbodiimide (DIC, 736 mg, 5.83 mmol) over 30 min, followed by triethylamine (170 μl, 1.22 mmol), and allow the reaction to proceed for 72 hr at 60 °C. Add mercapt–thanol (501 mg, 6.41 mmol) to quench the reaction, and stir for 2 hr at room temperature. Remove DMF via rotary evaporation and isolate the polymer with the addition of a 2:1 mixture of ice-cold acetone:chloroform, followed by centrifugation. Dissolve the polymer in ~5 ml anhydrous DMF, filter, precipitate again with diethyl ether, and repeat. Dry the product under vacuum and store under argon.

Determination of CdSe core diameter: From the UV-Vis absorption spectrum determine the wavelength of the first exciton peak (λ, in nm), which is the longest-wavelength peak (e.g. roughly 498 nm for CdSe in Figure 2a), and use the sizing curve of Mulvaney and coworkers 12:

Equation 1

Determination of CdSe nanocrystal concentration: From a background-subtracted UV-Vis spectrum of an optically clear solution of CdSe nanocrystals, determine the absorption at 350 nm wavelength. Serial dilutions can be used to determine if the optical absorption is within the linear range of Beer's Law. The nanocrystal concentration (QD, in M) can be determined by plugging in the nanocrystal diameter (D, in nm), the optical absorption value (A3sa), and the cuvette path length (l, in cm) into the following equation from the empirical correlation of Bawendi and coworkers 13:

Equation 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Toprak, E., Selvin, P. R. New fluorescent tools for watching nanometer-scale conformational changes of single molecules. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 349-369 (2007).
  2. Joo, C., Balci, H., Ishitsuka, Y., Buranachai, C., Ha, T. J. Advances in single molecule fluorescence methods for molecular biology. Annu. Rev. Biochem. 77, 51-76 (2008).
  3. Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. Probing cellular events, one quantum dot at a time. Nat. Method. 7, 275-285 (2010).
  4. Smith, A. M., Wen, M. M., Nie, S. M. Imaging dynamic cellular events with quantum dots. Biochemist. 32, 12-17 (2010).
  5. Smith, A. M., Duan, H. W., Mohs, A. M., Nie, S. M. Bioconjugated quantum dots for in vivo molecular and cellular imaging. Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 1226-1240 (2008).
  6. Smith, A. M., Nie, S. M. Next-generation quantum dots. Nature Biotech. 27, 732-733 (2009).
  7. Groc, L., Lafourcade, M., Heine, M., Renner, M., Racine, V., Sibarita, J. -B., Lounis, B., Choquet, D., Cognet, L. Single trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies. J. Neurosci. 27, 12433-12437 (2007).
  8. Smith, A. M., Nie, S. M. Minimizing the hydrodynamic size of quantum dots with multifunctional multidentate polymer ligands. J. Am. Chem. Soc. 130, 11278-11279 (2008).
  9. Smith, A. M., Nie, S. M. Bright and compact alloyed quantum dots with broadly tunable near-infrared absorption and fluorescence spectra through mercury cation exchange. J. Am. Chem. Soc. 133, 24-26 (2011).
  10. Shriver, D. F., Drezdzon, M. A. The Manipulation of Air-Sensitive Compounds. 2nd edn, Wiley-Interscience. (1986).
  11. Errington, R. J. Advanced Practical Inorganic and Metalorganic Chemistry. Blackie. (1997).
  12. Jasieniak, J., Smith, L., van Embden, J., Mulvaney, P., Califano, M. Re-examination of the size-dependent absorption properties of CdSe quantum dots. J. Phys. Chem. C. 113, 19468-19474 (2009).
  13. Leatherdale, C. A., Woo, W. K., Mikulec, F. V., Bawendi, M. G. On the absorption cross section of CdSe nanocrystal quantum dots. J. Phys. Chem. B. 106, 7619-7622 (2002).
  14. Smith, A. M., Mohs, A. M., Nie, S. M. Tuning the optical and electronic properties of colloidal nanocrystals by lattice strain. Nature Nanotech. 4, 56-63 (2009).
  15. Demas, J. N., Crosby, G. A. The measurement of photoluminescence quantum yields. A review. J. Phys. Chem. 75, 991-1024 (1971).
  16. Van Embden, J., Jasieniak, J., Mulvaney, P. Mapping the optical properties of CdSe/CdS heterostructure nanocrystals: the effects of core size and shell thickness. J. Am. Chem. Soc. 131, 14299-14309 (2009).
  17. Smith, A. M., Duan, H. W., Rhyner, M. N., Ruan, G., Nie, S. M. A systematic examination of surface coatings on the optical and chemical properties of semiconductor quantum dots. Phys. Chem. Chem. Phys. 8, 3895-3903 (2006).
  18. Zhang, X., Mohandessi, S., Miller, L. W., Snee, P. T. Efficient functionalization of aqueous CdSe/ZnS nanocrystals using small-molecule chemical activators. Chem. Comm. 47, 3532-3534 (2011).
  19. Bucio, L., Souza, V., Albores, A., Sierra, A., Chavez, E., Carabez, A., Guiterrez-Ruiz, M. C. Cadmium and mercury toxicity in a human fetal hepatic cell line (WRL-68 cells). Toxicol. 102, 285-299 (1995).
  20. Han, S. G., Castranova, V., Vallyathan, V. J. Comparative cytotoxicity of cadmium and mercury in a human bronchial epithelial cell line (BEAS-2B) and its role in oxidative stress and induction of heat shock protein 70. J. Toxicol. Environ. Health Part A. 70, 852-860 (2007).
  21. Strubelt, O., Kremer, J., Tilse, A., Keogh, J., Pentz, R. J. Comparative studies on the toxicity of mercury, cadmium, and copper toward the isolated perfused rat liver. J. Toxicol. Environ. Health Part A. 47, 267-283 (1996).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats