Tek molekül Görüntüleme için kompakt Kuantum Noktaları

Published 10/09/2012
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Engineering

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Biz tek-molekül floresan görüntüleme için minimize hidrodinamik büyüklüğü ile kolloidal Kuantum noktalarının hazırlanması tarif. Konvansiyonel kuantum noktaları ile karşılaştırıldığında, bu nanopartiküller globüler proteinlerin boyut olarak benzer ve tek-molekül parlaklık, fotodegradasyon karşı kararlılık ve proteinleri ve hücreleri nonspesifik bağlanma direnci için optimize edilmiştir.

Cite this Article

Copy Citation

Smith, A. M., Nie, S. Compact Quantum Dots for Single-molecule Imaging. J. Vis. Exp. (68), e4236, doi:10.3791/4236 (2012).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Tek molekül görüntüleme biyomoleküler fonksiyonu mekanizmalarını anlamak için ve hücresel biyoloji 1-4 altında yatan moleküler davranışların mekansal ve zamansal heterojenite görüntülenmesi için önemli bir araçtır. Görüntü ilgi bireyin molekülü için, tipik bir floresan etiketi (boya, protein, boncuk, ya da kuantum nokta) ile konjuge ve Epifloresans veya toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi ile gözlenir. Boyalar ve floresan proteinleri yıllardır floresan görüntüleme dayanak noktası olmuştur ederken, onların floresans sinyalinin tam kaybından önce gözlem sadece birkaç saniye verimli, bireysel moleküllerin gözlemlemek için gerekli yüksek foton akısı altında dengesiz. Lateks boncuk ve boya etiketli boncuk geliştirilmiş sinyal istikrarı sağlamak değil deleteriously çalışma kapsamında molekülünün difüzyon ve davranışını değiştirebilir ölçüde büyük hidrodinamik boyutu pahasına.

ntent "> Kuantum nokta (QDS) bu iki sorunlu rejimler arasında bir denge sunuyor. Bu nanopartiküller yarı iletken malzemelerden oluşur ve fotodegradasyon 5 karşı olağanüstü direnç ile hidrodinamik kompakt boyutu ile tasarlanmış olabilir. Dolayısıyla son yıllarda QDS sağlayan etkili olmuştur Tek molekül düzeyinde karmaşık makromoleküler davranışın uzun vadeli gözlem. Ancak bu parçacıkların hala kendi boyutlarını hala 4,6 çok büyük olan hücresel sitoplazma ve yarık nöronal sinaptik gibi kalabalık moleküler ortamlarda bozulmuş difüzyon sergilemek bulunmuştur , 7.

Kolloidal stabilite, fotostabilite, parlaklık ve geçmişte 8,9 kompakt QDS yararlılığını engellediğini nonspesifik bağlayıcı uzaklıklar dengelerken Son zamanlarda, çekirdek ve minimize hidrodinamik boyutu için QDS yüzey kaplamaları tasarladık. Bu makalenin amacı göstermektiryalıtkan bir Cd y Zn 1-y S kabuğu, kısa polietilen glikol ile modifiye multidentate polimer ligandı ile daha kaplamalı (ile kaplanmış alaşımlı Hg x Cd 1-x Se çekirdeğinden oluşan bu optimize Nanokristallerin sentezi, modifikasyonu ve karakterizasyonu, PEG) zincirleri (Şekil 1). Konvansiyonel CdSe nanokristaller ile karşılaştırıldığında, Hg x Cd 1-x Se alaşımlar geliştirilmiş hücrelerinde sinyal-gürültü ve non-sitotoksik görünür dalga boylarında uyarma için kırmızı ve yakın kızılötesi dalga boylarında floresans, floresans büyük kuantum verimi sunar. Multidentate polimer kaplamalar hidrodinamik boyutunu en aza indirmek için kapalı ve düz yapısındaki nanokristal yüzeyine bağlamak ve PEG hücreleri ve biyomoleküllerin nonspesifik bağlanma azaltmak için yüzey yükü nötralize eder. Sonuç 550-800 nm ve 12 nm civarındaki toplam hidrodinamik boyutu arasındaki emisyon ile parlak floresan nanokristal olduğunu. Bu, s 'deBirçok çözünür globüler hücrelerindeki proteinlerin ve konvansiyonel Pegile QDS (25-35 nm) göre önemli ölçüde daha küçük olarak ame boyut aralığı.

Protocol

Aşağıdaki sentez işlemleri, standart hava serbest teknikleri ve bir vakum / inert gaz manifoldu ile gerçekleştirilebilir; ayrıntılı metodoloji referans 10 ve 11 'de bulunabilir. Tüm potansiyel toksik ve yanıcı maddelerin MSDS kullanmadan önce danışılmalıdır ve tüm yanıcı ve / veya hava-labil bileşikler bir eldiven kutusu veya eldiven çanta septum mühürlü şişeler içine aliquoted edilmelidir.

1. Cıva Kadmiyum selenid sentezi (Hg x Cd 1-x Se) Kuantum Dot Çekirdek

  1. Trioctylphosphine (TOP) selenyum bir 0.4 M çözelti hazırlayın. 50 ml'lik 3-boyunlu bir şişeye selenyum (0.316 g, 4 mmol) eklenir, daha sonra boşaltmak ve argon bir Schlenk çizgi ile doldurun. Hava içermeyen koşullar altında (kuru nitrojen ya da argon atmosfer), 100-10 ml TOP ve ısı ° C ekleyin berrak, renksiz bir çözelti verecek şekilde, 1 saat boyunca karıştırmaya devam. Oda sıcaklığına kadar soğutulur ve çözüm kenara şişeyi ayarlayın.
  2. 250 ml 3 boyunlu bir şişeye, kadmiyum oksit ilave edin (CdO 0,0770 g, 0.6 mmol), tetradecylphosphonic asit (TDpa, 0,3674 g, 1.32 mmol) ve octadecene (ODE, 27.6 ml) eklenmiş ve karıştırma sırasında bir Schlenk hat kullanılarak çözelti tahliye edin. 100 ° C sıcaklık artışı ve düşük kaynama noktasına kirleri çıkarmak için ek bir 15 dakika için tahliye.
  3. Argon veya azot gazı altında, CdO tamamen çözünmesi için, 1 saat boyunca 300 ° C'ye kadar karışım ısıtın. Çözeltisi berrak ve renksiz bir kırmızımsı rengi değişecektir. Oda sıcaklığına çözelti soğutulur.
  4. Kadmiyum çözelti ile hexadecylamine (HDA, 7.0 g) eklenir, sıcaklık 70 ° C, ve tahliye edin. Bir sabit basıncı elde edildiğinde, 100-110 için sıcaklık artış ° C ve 30 dakika için geri akışa çözelti. Inert gaz için Schlenk hattı vanasını kapatın ve çözümü doğrudan termokupl yerleştirin.
  5. Hava içermeyen koşullar altında, çözelti ile difenilfosfin (DPP, 100 ul) eklenir ve 310 ° C 'ye sıcaklık artışı 0.4 M TOP-Se çözelti 7.5 ml kaldırma(3 mmol selenyum) bir 16 gauge iğne takılı bir tek kullanımlık plastik şırınga.
  6. Sıcaklık 310 ° C'de equilibrates sonra, 0 sıcaklık kontrolörü ayarlamak ° C ve hızla kadmiyum çözümü doğrudan TOP-Se enjekte çözüm. Çözüm sarı-turuncu renksiz değişecek ve sıcaklık hızlı bir şekilde düşmesi ve ~ 280 ° C'ye tekrar artacak Sıcaklık az 200 ° C oluncaya kadar tepkime 1 dakika sonra, ısıtma manto şişeye kaldırmak ve bir hava akımı ile hızlı bir şekilde serin
  7. Sıcaklığı ~ 40 ° C'ye ulaşınca, 30 ml heksan ile sulandırarak, çoğu kalan kadmiyum prekürsör çözeltiden çökelir. Santrifüj (5,000 x g, 10 dk) ile bu tortu çıkarıldı.
  8. Altı 50 ml polipropilen konik santrifüj tüpü her birinde, 40 ml aseton, santrifüj (10 dakika için 5000 x g) ile ham nanokristal çözelti, 12 ml seyreltik ve dikkatli bir şekilde süzün ve süpernatan atılır.
  9. Nanocr eritinheksan içinde ystal pelet (25 ml toplam hacim). Üst faz koruyarak, metanol eşit bir hacmi ile bu çözelti 3 kez çıkarın. Üçüncü çıkarma için, metanol hacmine yaklaşık 200 uM saf CdSe QDS konsantre heksan çözelti elde etmek için ~ 15 ml'ye kadar ayarlanabilir. Bu reaksiyon tipik verim 2.3 nm (% 50-60 reaksiyon verim) bir çapa sahip CdSe nanokristaller 3 mmol olup.
  10. UV-Vis absorbsiyon spektrumunu ölçme ve Mulvaney ve arkadaşları, 12 ölçü montaj grafik ve Bawendi ve arkadaşları 13 söndürme korelasyon danışarak nanokristal çap ve konsantrasyon belirlenir. Ayrıntılar için Ek bakın.
  11. Merkür katyon değişim: nanokristaller kısmen absorpsiyon ve floresans emisyon kırmızı kaydırmaya cıva ile takas olabilir. 3 ml heksan, 2 ml kloroform, 1 ml 200 uM Cd: stirbar olan 20 ml bir cam şişe (bu reaksiyon istenen şekilde ölçeklendirilir olabilir) ile sırayla birlikte aşağıdaki karıştırınSe QD çözeltisi (200 nmol), 15 ul oleylamine (OLA), ve solüsyona kloroform içinde Hg (OT) içinde bir 2 0.1 M çözeltiden 500 ul. Cıva octanethioate (HgOT 2) cıva asetat ve metanol içinde octanethiol (bkz. Ek) ​​tepkimeye sokulmasıyla hazırlanabilir. Katyon değişim reaksiyon ilerledikçe, kırmızıya kayma derecesini UV-Vis absorpsiyon spektrofotometresi ile takip edilebilir. İstenilen emme bandı elde edildikten sonra, 350 nm'de nanokristal çözeltinin absorpsiyonu ölçmek ve nanokristal konsantrasyon (bu örnekte, 30.7 uM) değişmemiş olduğunu varsayarak, yeni sönüm katsayısı belirlemek. Reaksiyona girmeyen cıva kaldırarak reaksiyon söndürmek: 5 ml dekan, 10 ml heksan, ve 7 ml metanol ekleyin ve nanokristaller içeren üst faz tutarak, çözelti çıkarmak. Heksan ve metanol ile iki kez daha ekstre edilmesi ve üst faz ~ 7 ml olacak şekilde metanol hacmi ayarlanır. Evreleri ayırmak için yavaşsa, çözüm (5.000 xg, santrifüj edilebilir10 dak.) Çökeltme indüklemek için, 40 ml aseton ve ardından nanokristaller için 100 ul TOP, 100 ul OLA, ve 100 ul oleik asit ekleyin. Santrifüj yoluyla nanokristaller toplayın ve 3 ml hekzan içinde dağılırlar. Çözünmeyen bileşenler kaldırmak ve 350 nm de yeni sönüm katsayısı kullanarak yeniden nanokristal konsantrasyonunu belirlemek için yeniden santrifüjleyin. Bir sonraki adıma geçmeden önce oda sıcaklığında en az 24 saat süreyle yaş nanokristal çözümü bekleyin.

2. Kadmiyum Çinko Sülfür Büyüme (Cd y Zn 1-y S) Shell

  1. 50 ml 3 boyunlu şişeler 0,1 M kabuğu habercisi çözümleri hazırlayın. Kadmiyum asetat hidrat (230.5 mg, 1 mmol) ve 10 ml oleylamine (OLA): haberci kadmiyum. Çinko haberci: çinko asetat (183.5 mg, 1 mmol) ve 10 ml OLA. Kükürt haberci: sülfür (32.1 mg, 1 mmol) ve 10 ml ODE. Vakum altında, net bir çözüm elde etmek için, 1 saat boyunca geri akışa kadar her bir çözelti ısı ve daha sonra argon ile doldurun. Kükürt çözüm olabilir, oda sıcaklığına kadar soğutulması, ancak kadmiyum ve çinko öncüleri yaklaşık olarak 50 ° C'de tutulur Kabuk habercisi miktarlarda Hesaplamalar başvuru 14 bulunabilir.
  2. Bir 3-boyunlu bir şişeye ekleyin: Hg Cd 1 x-x Se QDS (120 nmol, 2.3 nm çapında), ODE (2 mi) çözündürüldü, ve trioctylphosphine oksit (TOPO, 250 mg) eklenmiştir. Schlenk hat kullanılarak oda sıcaklığında heksan kapalı tahliye edin. 100 ° C ve 15 dakika için geri akış sıcaklığında arttırın. Argon veya nitrojen gazı Schlenk hattı vanasını değiştirin ve nanokristal çözüm termokupl yerleştirin.
  3. 120 sıcaklık artışı ° C, kükürt haberci çözeltinin 0.5 mono tabakalar (140 ul) eklenir ve reaksiyon 15 dakika için ilerlemeye olanak tanır. Küçük hacimde (<50 ul) floresan ve / veya UV-Vis emme spektrofotometresi kullanılarak, reaksiyonun ilerlemesini izlemek için bir cam şırınga kullanılarak kaldırılabilir. 140 sıcaklık artışı ° C, kadmiyum haberci çözeltinin 0.5 mono tabakalar eklemek (140 ul) eklendi ve reaksiyon 15 dakika için ilerlemeye olanak tanır. Reaksiyon çözeltisi, OLA 500 ul susuz ekleyin.
  4. 160 ° C de her bir yanı arasında 15 dakika ile 170 çinko çözeltilerden eşit miktarda ardından kükürt haberci çözeltinin 0.5 mono tabakalar (220 ul) eklendi ° C'de ilave edin. Sonra, 180 ° C 'de kükürt öncü çözeltisi (150 ul) eklendi ve 15 dakika ara ile çinko öncü çözeltisi 0.25 mono tabakalar ekleyin.
  5. Oda sıcaklığına soğutulur ve çözelti tekrar nanokristaller sayısı (3.8 ml reaksiyon çözeltisi 120 nmol) değişmez olduğu varsayılarak, bir UV-Vis spektrumu kullanılarak bu parçacıklar için yeni bir sönüm katsayısı hesaplanır. Bir derin dondurucu içinde bir ham karışım olarak reaksiyon çözeltisi saklayın; bölümler 1.8 ve 1.9 'de tarif edilen aynı yöntem kullanılarak gerektiğinde nanokristaller çözülmüş ve saflaştırılabilir.
  6. Nanokristaller elektron mikroskobu, UV-Vis absorpsiyon spektroskopi ve floresans spektroskopisi ile karakterize edilebilir. Kuantum verimi olabilirbir birleşik küre ya da nispeten referans 15 yöntemler kullanılarak bilinen bir standart ile kıyaslandığında kullanılarak tamamen hesaplanmıştır.

3. Faz Transfer

  1. 50 ml'lik 3-boyunlu bir şişeye, 1-x Se çekirdek / kabuk Hg x Cd / Zn Cd y 1-y S QDS (5 ml, 20 uM) saflaştırılmış ekleyin ve kuru film vermek üzere yüksek vakum altında heksan çıkarın. 80 nanopartikül filmin ısı ile bulamaç için susuz piridin (3 mi) eklenir, argon ile şişesi doldurun ° C. 1-2 saat boyunca nanopartiküller tamamen eriyecektir.
  2. Çözeltisine 1-thioglycerol (1 ml) ekleyin ve 80 ° C'de karıştırıldı, 2 saat boyunca. Daha sonra oda sıcaklığına kadar soğutulur ve çözelti thioglycerol deprotonate ile trietilamin (0.5 ml) ekleyin. 30 dakika için karıştırın. Çözelti, bu çözücü karışım içinde polar Nanokristallerin zayıf çözünürlüğü nedeniyle trietilamin ilave edildikten sonra bulanık hale gelebilir.
  3. 50 ml konik santrifüj tüpü içine devam QD çözelti aktarın20 ml hekzan ve 20 ml aseton içindeki bir karışımı aining, ve iyice karıştırın. Santrifüj (5,000 x g, 10 dk) ile çökeltilmiş nanokristaller, yalıtma ve aseton ile pelet yıkayın.
  4. Agregatları uzaklaştırmak için olası QD banyo sonikasyon ile DMSO içinde pelet (5 mi), ve sonra santrifüj (7,000 x g, 10 dk) eritilir. UV-Vis absorpsiyon spektrum nanoparçacık konsantrasyonunu belirleyin. Yüzey tiyoller yavaş yavaş hava içinde ortam koşulları altında oksidize gibi saf QDS Bu çözelti, 3 saat içinde kullanılmalıdır.
  5. DMSO ile 10 uM veya daha az çözelti QD seyreltilir ve 50 ml'lik bir şişeye aktarın. DMSO içinde thiolated poliakrilik asit (Ek olarak açıklanan sentez), 5 mg / ml çözelti hazırlayın. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında çözelti karıştırma ile gazdan arındırmak sırasında QD çözeltisine damla damla polimer solüsyon (nmol QDS başına 0.15 mg polimer) ekleyin.
  6. Argon ve 80 ° C sıcaklık ve 90 dakika boyunca birlikte QD / polimer çözelti temizleyin. Daha sonra, oda sıcaklığına kadar bir çözelti soğumayad damla damla ilave edildi, 50 mM sodyum borat, pH 8 eşit bir hacimde ilave edin. 10 dakika boyunca karıştırın.
  7. 50 mM kadar sodyum borat, pH 8 içinde diyaliz (20 kDa kesme) vasıtasıyla QDS arındırmak ve sonra da bir santrifüj filtre (10 kDa kesme) kullanılarak partikülleri konsantresi. UV-Vis emme spektrumu elde edilen konsantrasyon belirlenir.

4. PEG Kaplama

  1. Stirbar ile 4 ml bir cam şişe içinde, 750 Da monoamino-polietilen glikol (30 mg, 40 mmol) bir 40,000 x molar fazlası ile borat tamponu içinde 1 nmol QDS karıştırın. Belirli bir kimyasal özelliğe nanokristaller (örneğin, hidrazit ya da maleimid) ilave edilecek ise, bir heterobifonksiyonel amino-PEG (% 30 mol oranı tipik olarak iyi çalışmaktadır) amino-PEG bir kısmı ile değiştirerek sokulabilir. Borat tamponu ile 1 uM ile nanokristal çözeltisi ile seyreltilir. Istenildiği gibi Bu reaksiyon ölçeklendirilebilir.
  2. DMSO (144 ul) içinde DMTMM (20 mg, 72 mmol) taze bir çözelti hazırlayın. Bu, çözelti kısa bir süre için ısıtılabilir uçeşme suyu sıcak veya tamamen DMTMM çözmek için bir banyo sonikatör batmış bir dere nder. Çabuk QD çözelti ile bu DMTMM 0.5 M çözelti 25,000 x molar fazlalıktan (50 ul) ekleyin ve 30 dakika için oda sıcaklığında karıştırın.
  3. PEG ile nanokristal yüzeye doyurmak için 4.2 daha dört kez yineleyin. Son olarak, reaksiyon dindirmek için 200 ul 1 M Tris tampon eklemek ve diyaliz, santrifüj filtre veya Ultrasantrifügasyon kullanarak nanokristaller arındırmak.
  4. Nanokristaller monodispersity, hidrodinamik boyutu ve sıvı kromatografi, agaroz jel elektroforezi, ve floresan mikroskobu kullanarak yüzey şarjı için analiz edilebilir. , Otomatik bir sıvı kromatografi sistemi (GE AKTAprime Plus) kullanılarak hidrodinamik boyutu ve boyut dağılımını belirlemek için, 260 ya da 280 nm'de bir Superpoze sütun 6, PBS tamponu ile elüsyon 0.5 ml / dak 'lık bir akış oranı ve emme algılama kullanır. Moleküler ağırlık standartları olanlar ile elüsyon nanoparçacık kez karşılaştırın. Agaroz jel electropho içindirenci, 50 mM sodyum borat tampon maddesi (pH 8.5) ya da 50 mM sodyum fosfat tampon maddesi (pH 7.4) içinde bir% 0.5 agaroz jel hazırlamak kuyu içine,% 10 gliserol ve yük ile 1 uM numuneleri karıştırmak, ve 30 dakika süreyle 100 V'ta çalıştırmak . UV el değnek veya UV transilluminator kullanarak jel ve floresans uyarma için Görüntü nanokristaller. Floresan mikroskobu kullanılarak tek bir molekül seviyesinde görüntü nanokristaller için, 10 mM fosfat tamponu içinde parçacıklar için 0.2 nM seyreltik bir cam lamel üzerinde çözelti 2.5 ul damla ve dikkatli bir şekilde yaymak için sıvı boncuk üstünde ikinci bir lamel yerleştirmek lamelleri arasında bir film. 400-580 nm ve bir elektron-Çarpma CCD kamera arasındaki dalga boylarında uyarma ile ya Epifloresans ya TIRF modunda yüksek sayısal diyafram objektif (ideal en az 1.40) kullanarak görüntü yüzeyinin bağlı parçacıklar. Tam görüntüleme parametreleri mikroskopi kurulum arasında değişir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 2 CdSe nanokristaller, katyon değişim sonrası Hg x Cd 1-x Se nanokristaller ve Hg x Cd 1-x Se / Cd y Zn kabuk büyüme sonrası 1-y S nanokristaller için temsili absorpsiyon ve floresans spektrumları resmediyor. Çekirdek CdSe nanokristaller, kuantum% 15 civarındaki floresans verimi (uzun dalga boylu derin tuzak emisyon dahil) ama bu verimli yüzeye atomu parçalama 9 aracılığıyla tanıtılan taşıyıcı tuzakları şarj olasılığı nedeniyle civa değişiminden sonra% 1'den daha az, düşer var. Ancak Cd y Zn 1-y S ince bir kabuk büyüme büyük ölçüde su (% 50 tipik) transfer sonra korunur% 70 daha fazla, bu verimliliği artırır. Bir kalın kabuk yetiştirilir sürece Bunun aksine, cıva birleşme olmadan CdSe / Cd y Zn 1-y S nanokristaller su içinde kuantum verimi önemli bir kısmını kaybederler. Böylece çekirdek nanocrysta içine dahil ederek cıval, nanokristal küçüklüğü parlaklık ödün vermeden (Şekil 3 TEM bakınız) korunabilir. Bu vardiya CdSe çekirdekler 16 20-30 nm civarındadır ve artışları ile; Bu Cd y Zn 1-y S ile kapatma kabuk malzeme içine elektronik yük taşıyıcılarının sızıntı nedeniyle kırmızı spektrumları geçer unutmayın önemlidir (100 nm) çekirdek cıva içeriği artmaktadır.

Su için 2 adımlı faz transferi kullanımı kümeleri ve agrega kaldırmak için sıralama ileri boyutu gerekmez Nanokristallerin homojen bir nüfus elde etmek için önemlidir. İlk adım olarak, nanokristaller nanokristal yüzeyi üzerinde yerinden oleylamine 1-thioglycerol, kullanan DMSO transfer edilir. Thioglycerol sonra organik tabaka (<4 nm katkının kaynaklanan hidrodinamik boyutunda bir artış ile en az çok sabit partiküllerin ile sonuçlanan, bir doğrusal polimer multidentate ile değiştirilirhidrodinamik çapı için). Şekil 4a'da gösterilen boyut dışlama kromatogram boyut conalbumin (75 kDa) ile benzer olduğunu teyit eder, ve 750 Da amino-PEG tadilat sonra, boyutu sadece 12 nm bir IgG antikoru için benzer arttırılır . PEG modifikasyon Şekil 4b tasvir agaroz jel elektroforez deneyde doğruladı yüzey yükü nötralize eder. Biz rutin pratik boyutu karakterizasyonu, boyut dağılımı ve yüzey yükü için boyut dışlama kromatografisi ve jel elektroforezi kullanın. Dinamik ışık saçılımı ve zeta potansiyometri da ancak saçılma bu ultrasmall parçacıkların kesiti çok küçük olduğunu ve ticari araçlardan kaynaklanan sonuçlar tekrarlanabilir olmadığını bulduk, kullanılabilir. Şekil 5a bu nanokristaller bir Epifloresans mikrografı bir biriken gösterir cam lamel ve 545 nm görünür ışık ile uyarıldı. Bu nanokristaller kolayca o vardır. elektron-Çarpma CCD kamera ile saniyede 30 kare tek-molekül düzeyinde bserved Şekil 5b her çerçeve gözlenen floresan parçacıkların sayısını sürekli uyarma ile zamanla değişiyor gösterir; Bu yanıp sönen ve fotodegradasyon bir kombinasyonu nedeniyle . Oksidatif fotodegradasyon yavaş belirginleşir önce Yanıp sönüyor İlk ~ 7 dakika hakimdir.

Şekil 1
Nanoparçacık sentezi prosedürü Şekil 1. Şematik olarak gösterilmesi. (A) Kadmiyum ve selenyum öncüleri Hg x Cd 1-x Se üçlü alaşım nanokristaller verim kısmi Cd → Hg katyon değişim uyarıp civa octanethiolate ile tedavi edilir CdSe nanokristaller, oluşturmak için tepki. Cd y Zn 1-y S Bir kabuk sonra kadmiyum asetat, çinko asetat, ve kükürt kullanılarak çekirdek yetiştirilir. (B) olduğu gibi synthesized, bu nanokristaller, polar olmayan organik ligandların (oleylamine) ile kaplanır. Sulu tamponlar içinde, bu parçacıklar çözelti haline getirilmeleri için, ligand kovalent amino-PEG bağlanmış olan bir polimer multidentate ligand ile değiştirilir.

Şekil 2,
Şekil 2. 1-x Se Hg x Cd / Cd y Zn 1-y S nanokristaller optik özellikleri. (A) Emme (siyah) ve CdSe nanokristal çekirdek floresans spektrumları (kırmızı), Hg x Cd 1-x Se çekirdek katyon değişimi sonrası, ve Hg x Cd 1-x Se / Cd y Zn kabuk büyüme sonrası 1-y S nanokristaller . Spectra 1-x Se Hg x Cd / Cd y Zn civa kuruluş farklı göreceli miktarları ile 1-y S netlik (b) Floresan spektrumları mahsup edilir. Mavi spektrum sıfır cıva içeriği (x = 0, CdSe) ile çekirdek gösteriyor.

Şekil 3
Şekil 3. Transmisyon elektron mikrografı (a) ve (b) 1-x Se Hg x Cd / Cd y Zn 1-y S Nanokristallerin partikül boyutu dağılımı, ortalama çapı 3.2 ± standart sapma ± 0.6 nm gösteren.

Şekil 4,
Şekil 4,. 1-x Se Hg x Cd / Zn Cd y sulu çözelti içinde 1-y S QDS Hidrodinamik karakterizasyonu. (A) Nanokristallerin Boyut dışlama kromatogram amino-PEG (mavi) konjugasyon önce (kırmızı) ve sonra bir multidentate polimer ligandı ile kaplanmıştır. Moleküler ağırlık standartlarının protein parseller üzerinde gösterilir. Daha önce sodyum borat tamponu içinde QDS (b) Agaroz jel elektroforez deney (pH ~ 8.5) (soldakiAmino-PEG) ve sonra (sağ) konjugasyon. De anyonik parçacıklar ve Pegile nanokristaller elektrostatik nötr gibi konjugasyon önce nanokristaller göç ettiğini gösteren bir ok ve elektrot polariteleri sağdaki belirtilmiştir ile işaretlenmiştir.

Şekil 5,
Şekil 5. Hg x Cd 1-x Se / Cd y Zn 1-y Epifloresans mikroskobu ile görüntülenebilir fosfat tamponunda bir cam lamel üzerinde adsorbe S QDS. (A) QD görüntü saniyede 33 kare elde. Görüntü 15 mikron x 15 mikron. 545 nm (30 nm bandpass) eksitasyon filtresi ile civa ark lambası ile 20 dk ve 625 nm (20 nm bandpass) emisyon filtresi ve 100x 1.4 NA hedefi için sürekli aydınlatma sırasında görüş alanı başına floresan QDS (b) sayısı. Bakış 3 alanlardan Ölçümler saniyede 12.5 kare 20 dakika boyunca ortalaması alınmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Konvansiyonel CdSe kuantum noktaları ile karşılaştırıldığında, üçlü alaşım Hg x Cd 1-x Se nanokristaller boyutu ve bağımsız floresans dalga boyu ayarlanabilir. Boyutu ilk CdSe nanokristal çekirdek sentezi sırasında seçilir ve floresan dalga boyu büyük ölçüde nanokristal boyutu 9 değişmez bir ikincil cıva katyon değişim aşamasının, seçilir. Bu saflaştırılmış Hg Cd 1 x-x Se nanokristaller kapaklama önce en azından 24 saat için oda sıcaklığında inkübe izin vermek için önemlidir. Bu, zayıf bir şekilde adsorbe cıva katyon bazı nanokristal kafes içine nüfuz ederler olanak tanır. Bu işlem, kızıl ötesine yakın olarak, bir ikinci floresan bant meydana gelmesine olanak tanınır olmadan genellikle ayrışmış cıva iyonları arasından HGS Nanokristallerin homojen çekirdekleşme bağlı olarak görülmektedir.

Bu çalışma gösterilen örnekte, olabilir, 2.3 nm civarındaki bir boyut ile CdSe çekirdek hazırlanmışçekirdek kafes dahil civa miktarı değiştirerek örtümü sonra 550-800 nm arasında floresans ayarlanmış. 2.5 Monolayer kabuğu ile bu QDS nihai çapı aslında biz tek-molekül görüntüleme için yeterince photostable ve yeterince aydınlık hem olduğunu hazırlayabileceğiniz küçük boyutu nanoparçacık (350,000 civarındaki sönüm katsayısı M -1 cm olan, 3.2 nm yakın oldu 400 nm ve su içinde% 50 civarında kuantum verimi -1). Bu nanokristaller ölçüde parlak ve bu spektral aralığı (örn. CdTe, InAs, InP) üzerinde yayarlar karşılaştırılabilir boyutlarıyla önce açıklanan nanokristaller daha photostable vardır. Çoğu floroforlar gibi, tek bir molekül düzeyinde bu parçacıklar floresans (yanıp sönen) 5,6 aralıklı.

Bazı uygulamalar için, biraz daha büyük nanokristaller kullanmak yararlı olabilir. Daha büyük bir CdSe nanokristal çekirdek, floresan bandwi kullanılarakDTH civa katyon değişim sonrası dardır. 600-650 nm penceresinde emisyonu ile Hg x Cd 1-x Se nanokristaller için tipik floresan tepe genişlikleri 2.3 nm çekirdek için 50-70 nm ve 3,2 nm çekirdek için 40-50 nm. Bu şekilde, daha büyük bir nanokristaller spektral çoklama için daha büyük bir kapasite sağlar. Buna ek olarak, boyut artan aynı şekilde Nanokristallerin emme çapraz kesit artacaktır. CdS geçici kabuk tabakası kalınlığının artması da parlaklığını artırmak ve daha fazla uyarılma sırasında floresans istikrarı uzatır. CdSe çekirdek büyüklüğü CdSe çekirdek sentezi süresini uzatarak, ve UV-Vis emme spektrofotometrisi vasıtasıyla etkili boyutu izlenerek basitçe artış olabilir.

Biz karboksilik asitler ile kaplı sulu QDS hücreleri ve proteinleri nonspesifik adsorpsiyon eğilimli olduğunu bulmuşlardır, ve fizyolojik tamponlar onların güçlü negatif yük olduğu nötralizasyon cr olduğununonspesifik etkileşimler 17 minimize için itical. Burada örnek olarak, yüzey nötralize ve su içinde denge sağlamak için, kısa zincirli PEG kullanılmıştır. PEG QDS bağlılık önce veya kaplama sonrası ya polimer omurga içine sokulabilir. Prosedürleri hemen hemen nötr partiküller elde edilir ama karboksil-polimer ile kaplanmış olan ilk iki yüzeyi ile geliştirilmiş multidentate etkileşimden dolayı muhtemelen, önemli ölçüde daha küçüktür. PEG ile tam bir yüzey nötrleştirme için, karboksilik asit aktive edici maddeler arasında ayrıca tekrarlanan bağlı olarak reaktif türlerin yarı ömrü kısa için gerekli olduğunu bulmuşlardır. Biz çünkü gelişmiş depolama DMTMM kararlılık ve su 18 gelişmiş reaksiyon verimi nedeniyle daha sık karbodiimid reaktiflerin yerde (örneğin EDC) olarak DMTMM kullanın.

Son olarak, Nanokristallerin kuantum noktaları ve diğer birçok türde içeren dikkat etmek önemlidirSitotoksik elemanları 5. Kadmiyum ve cıva iyonları canlı hücrelerin ve organizmaların normal süreçleri etkileyebilir ve kanserojen 19-21 olabilir. Ancak konvansiyonel CdSe / ZnS Nanokristallerin sitotoksisite yaygın çalışılmış ve onların toksik elementlerin verimli oksidan maddelerden uzak tecrit edilir, çünkü istikrarlı organik ligandlar ile sağlam kaplamalı nanokristaller kendi kurucu unsurları ile karşılaştırıldığında açıkça sitotoksik tepkiler olmadığı bildirilmiştir 5. Ayrıca, tek bir molekül görüntüleme uygulamalarında, toksik etki tespit toksik etkileri (50-100 nm) daha küçük başlangıç ​​büyüklük olarak görüntüleme (tipik olarak 1 nM ya da daha az) için kullanılan son derece düşük konsantrasyonlarda olasılığı nedeniyle vardır. Bugüne kadar QDS uygulayan tek molekül deneyler çoğu piyasada mevcut CdSe / Burada tarif edilenden daha büyüktür ZnS nanokristaller, faydalanmış. N en aza indirerekanocrystal büyüklüğü, parçacık ve parçacık başına toksik atomlarının toplam sayısı başına yüzey atomlarının toplam sayısının esasen bu sayede toksikolojik etki için toplam potansiyelini azaltarak azalır. Nanokristal içine cıva birleşme cıva birçok hücre 19-21 iki değerlikli kadmiyum daha az toksik olduğu bilindiği gibi, potansiyel toksisite daha da azaltmak için tahmin edilmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

Yazarlar elektron mikroskobu görüntüleme için Emory Üniversitesi Entegre Mikroskopi Çekirdek Dr Hong Yi teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma (PN2EY018244, R01 CA108468, U54CA119338 ve 1K99CA154006-01) NIH hibe tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Selenium Sigma-Aldrich 229865
Tri-n-octylphosphine Strem 15-6655 97% pure, unstable in air
Cadmium oxide Sigma-Aldrich 202894 Highly toxic: use caution
Tetradecylphosphonic acid PCI Synthesis 4671-75-4
Octadecene Alfa Aesar L11004 Technical grade
Hexadecylamine Sigma-Aldrich H7408
Diphenylphosphine Sigma-Aldrich 252964 Pyrophoric
Mercury acetate Sigma-Aldrich 456012 Highly toxic: use caution
1-Octanethiol Sigma-Aldrich 471836 Strong odor
Oleic acid Sigma-Aldrich W281506
Zinc acetate Alfa Aesar 35792
Cadmium acetate hydrate Sigma-Aldrich 229490 Highly toxic: use caution
Oleylamine Fisher Scientific AC12954 Unstable in air
Sulfur Sigma-Aldrich 344621
Trioctylphosphine oxide Strem 15-6661 99%
Pyridine VWR EM-PX2012-6 Anhydrous
Thioglycerol Sigma-Aldrich M1753 Strong odor
Triethylamine Sigma-Aldrich 471283 Anhydrous
Dialysis tubing Spectrum Labs 131342 20 kDa cutoff
Centrifugal filter Millipore UFC801024 10 kDa cutoff
Monoamino-PEG Rapp Polymere 12 750-2 750 Da
DMTMM, 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride hydrate Alfa Aesar H26333
AKTAprime Plus Chromatography System GE HealthCare
Superose 6 10/300 GL chromatography column GE HealthCare 17-5172-01
Agarose, OmniPur VWR EM-2120

Appendix

Synthesis of mercury octanethiolate: Slowly add a methanol solution of mercury acetate (1 eq.) to a stirring solution of 1-octanethiol (3 eq.) and potassium hydroxide (3 eq.) in methanol at room temperature. Isolate the mercury(II) octanethiolate precipitate via filtration, wash two times with methanol and once with ether, and then dry under vacuum.

Synthesis of multidentate polymer: Dissolve polyacrylic acid (1 g, 1,773 Da) in 25 ml dimethylformamide (DMF) in a 150 ml three-necked flask and bubble with argon for 30 min. Add an anhydrous solution of cysteamine (374 mg, 4.87 mmol) in 10 ml DMF. At room temperature with vigorous stirring, slowly add anhydrous diisopropylcarbodiimide (DIC, 736 mg, 5.83 mmol) over 30 min, followed by triethylamine (170 μl, 1.22 mmol), and allow the reaction to proceed for 72 hr at 60 °C. Add mercapt–thanol (501 mg, 6.41 mmol) to quench the reaction, and stir for 2 hr at room temperature. Remove DMF via rotary evaporation and isolate the polymer with the addition of a 2:1 mixture of ice-cold acetone:chloroform, followed by centrifugation. Dissolve the polymer in ~5 ml anhydrous DMF, filter, precipitate again with diethyl ether, and repeat. Dry the product under vacuum and store under argon.

Determination of CdSe core diameter: From the UV-Vis absorption spectrum determine the wavelength of the first exciton peak (λ, in nm), which is the longest-wavelength peak (e.g. roughly 498 nm for CdSe in Figure 2a), and use the sizing curve of Mulvaney and coworkers 12:

Equation 1

Determination of CdSe nanocrystal concentration: From a background-subtracted UV-Vis spectrum of an optically clear solution of CdSe nanocrystals, determine the absorption at 350 nm wavelength. Serial dilutions can be used to determine if the optical absorption is within the linear range of Beer's Law. The nanocrystal concentration (QD, in M) can be determined by plugging in the nanocrystal diameter (D, in nm), the optical absorption value (A3sa), and the cuvette path length (l, in cm) into the following equation from the empirical correlation of Bawendi and coworkers 13:

Equation 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Toprak, E., Selvin, P. R. New fluorescent tools for watching nanometer-scale conformational changes of single molecules. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 349-369 (2007).
  2. Joo, C., Balci, H., Ishitsuka, Y., Buranachai, C., Ha, T. J. Advances in single molecule fluorescence methods for molecular biology. Annu. Rev. Biochem. 77, 51-76 (2008).
  3. Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. Probing cellular events, one quantum dot at a time. Nat. Method. 7, 275-285 (2010).
  4. Smith, A. M., Wen, M. M., Nie, S. M. Imaging dynamic cellular events with quantum dots. Biochemist. 32, 12-17 (2010).
  5. Smith, A. M., Duan, H. W., Mohs, A. M., Nie, S. M. Bioconjugated quantum dots for in vivo molecular and cellular imaging. Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 1226-1240 (2008).
  6. Smith, A. M., Nie, S. M. Next-generation quantum dots. Nature Biotech. 27, 732-733 (2009).
  7. Groc, L., Lafourcade, M., Heine, M., Renner, M., Racine, V., Sibarita, J. -B., Lounis, B., Choquet, D., Cognet, L. Single trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies. J. Neurosci. 27, 12433-12437 (2007).
  8. Smith, A. M., Nie, S. M. Minimizing the hydrodynamic size of quantum dots with multifunctional multidentate polymer ligands. J. Am. Chem. Soc. 130, 11278-11279 (2008).
  9. Smith, A. M., Nie, S. M. Bright and compact alloyed quantum dots with broadly tunable near-infrared absorption and fluorescence spectra through mercury cation exchange. J. Am. Chem. Soc. 133, 24-26 (2011).
  10. Shriver, D. F., Drezdzon, M. A. The Manipulation of Air-Sensitive Compounds. 2nd edn, Wiley-Interscience. (1986).
  11. Errington, R. J. Advanced Practical Inorganic and Metalorganic Chemistry. Blackie. (1997).
  12. Jasieniak, J., Smith, L., van Embden, J., Mulvaney, P., Califano, M. Re-examination of the size-dependent absorption properties of CdSe quantum dots. J. Phys. Chem. C. 113, 19468-19474 (2009).
  13. Leatherdale, C. A., Woo, W. K., Mikulec, F. V., Bawendi, M. G. On the absorption cross section of CdSe nanocrystal quantum dots. J. Phys. Chem. B. 106, 7619-7622 (2002).
  14. Smith, A. M., Mohs, A. M., Nie, S. M. Tuning the optical and electronic properties of colloidal nanocrystals by lattice strain. Nature Nanotech. 4, 56-63 (2009).
  15. Demas, J. N., Crosby, G. A. The measurement of photoluminescence quantum yields. A review. J. Phys. Chem. 75, 991-1024 (1971).
  16. Van Embden, J., Jasieniak, J., Mulvaney, P. Mapping the optical properties of CdSe/CdS heterostructure nanocrystals: the effects of core size and shell thickness. J. Am. Chem. Soc. 131, 14299-14309 (2009).
  17. Smith, A. M., Duan, H. W., Rhyner, M. N., Ruan, G., Nie, S. M. A systematic examination of surface coatings on the optical and chemical properties of semiconductor quantum dots. Phys. Chem. Chem. Phys. 8, 3895-3903 (2006).
  18. Zhang, X., Mohandessi, S., Miller, L. W., Snee, P. T. Efficient functionalization of aqueous CdSe/ZnS nanocrystals using small-molecule chemical activators. Chem. Comm. 47, 3532-3534 (2011).
  19. Bucio, L., Souza, V., Albores, A., Sierra, A., Chavez, E., Carabez, A., Guiterrez-Ruiz, M. C. Cadmium and mercury toxicity in a human fetal hepatic cell line (WRL-68 cells). Toxicol. 102, 285-299 (1995).
  20. Han, S. G., Castranova, V., Vallyathan, V. J. Comparative cytotoxicity of cadmium and mercury in a human bronchial epithelial cell line (BEAS-2B) and its role in oxidative stress and induction of heat shock protein 70. J. Toxicol. Environ. Health Part A. 70, 852-860 (2007).
  21. Strubelt, O., Kremer, J., Tilse, A., Keogh, J., Pentz, R. J. Comparative studies on the toxicity of mercury, cadmium, and copper toward the isolated perfused rat liver. J. Toxicol. Environ. Health Part A. 47, 267-283 (1996).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats