दो और तीन आयामी डीएनए क्षति प्रतिक्रिया प्रोटीन की लाइव सेल इमेजिंग

Biology

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Summary

इस प्रोटोकॉल एक डीएनए डबल कतरा तोड़ संकेतन प्रोटीन डीएनए के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पिंजरे का बँटवारा दौरान अपने स्थानीयकरण क्षति प्रतिक्रिया में सक्रिय visualizing के लिए एक विधि का वर्णन है.

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Beckta, J. M., Henderson, S. C., Valerie, K. Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins. J. Vis. Exp. (67), e4251, doi:10.3791/4251 (2012).

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Abstract

Protocol

ए सेल तैयारी

  1. सामान्य मानव प्राथमिक fibroblasts (GM02270) Coriell सेल भंडार, Camden, न्यू जर्सी, से प्राप्त किया गया और 6 hTERT साथ अमर. कोशिकाओं बड़े हो रहे थे और मीडिया में Cellstar में विस्तार 6 सेमी व्यंजन (4 मिलीलीटर) 20% भ्रूण गोजातीय (GIBCO) सीरम, non-essential/essential अमीनो एसिड, विटामिन, सोडियम पाइरूवेट, और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (HyClone के साथ पूरक सदस्य शामिल ).
  2. मानव भ्रूण गुर्दे 293 कोशिकाओं (HEK293) अमेरिकी प्रकार संस्कृति संग्रह से प्राप्त किया गया और हो गई है और 6 सेमी Cellstar व्यंजन में विस्तार. कोशिकाओं मीडिया (4 मिलीलीटर) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, गैर आवश्यक अमीनो एसिड, एल glutamine के साथ पूरक DMEM, और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन से मिलकर में रखा गया था.
  3. (N-Myc - 53BP1 pLPC Puro WT, Addgene प्लाज्मिड 19,836) 53BP1 mCherry और H2B GFP (pCLNR - H2BG, Addgene प्लाज्मिड 17,735) संलयन जीन भी puromycin या G418 प्रतिरोध जीनों व्यक्त constructs, क्रमशः, (fibrobla transduced रहे थे) अनुसूचित जनजातियों या ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं (HEK293) में SuperFect (Qiagene) का उपयोग कर और नशीली दवाओं के चयन के तहत बनाए रखा. प्रतिदीप्ति का रखरखाव समय - समय पर जाँच की थी.
  4. छवि के अधिग्रहण से पहले 24-48 घंटा, कोशिकाओं को एक एकल कोशिका निलंबन में trypsinized किया गया और 3.5 सेमी FluroDish गिलास नीचे प्लेटों पर एक कम घनत्व पर वरीयता प्राप्त है.

बी माइक्रोस्कोप सेटअप और छवि अधिग्रहण

इस प्रोटोकॉल Zeiss सेल प्रेक्षक एसडी कताई डिस्क confocal एक AxioObserver Z1 स्टैंड, दोहरे चैनल Yokagawa CSU X1A 5000 कताई डिस्क इकाई, 2 Photometrics QuantEM 512SC EMCCD कैमरों, एक HXP 120C प्रकाशक फाइबर आधारित, 4 के साथ लैस माइक्रोस्कोप का उपयोग कर विकसित किया गया था लेसरों (एक Lasos 100mW आर्गन बहु - रेखा [458, 488, 514 एनएम], 50 मेगावाट 405 एनएम डायोड, 40 मेगावाट 561 एनएम डायोड, और 30 मेगावाट 635 एनएम डायोड), AOTF, एक Pecon एक्स्ट्रा लार्ज multiS1 मंच ऊष्मायन प्रणाली, Zeiss ऊष्मायन (हे 2 मॉड्यूल एस, सीओ 2 मॉड्यूल एस, की एस, TempModule ताप यूनिट एक्स्ट्रा लार्ज एस) मॉड्यूल और एक पूर्व मोएक NanoScanZ piezo Z डालने के साथ torized XY मंच. गोलाकार aberrations कम से कम समय इमेजिंग जीवित कोशिकाओं एक जलीय माध्यम, एक सी APOCHROMAT 63x/1.20 जल / Corr उद्देश्य लेंस और Zeiss Immersol डब्ल्यू विसर्जन के द्रव (अपवर्तक सूचकांक n = 1.334) में समर्थित इस्तेमाल किया गया. 2 चैनल confocal इमेजिंग, एक RQFT 405/488/568/647 dichroic दर्पण और BP525/50 (हरी) और BP629/62 (लाल) उत्सर्जन फिल्टर का इस्तेमाल किया गया. प्रणाली का इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर Multi-channel/Z/T AV4, फास्ट इमेजिंग, फिजियोलॉजी, MosaiX, मार्क और पता लगाएं, दोहरी कैमरा, 4D अंदर, Autofocus और 3-D deconvolution मॉड्यूल के साथ Zeiss AxioVision (4.8.2.0 ver.) था.

  1. सुनिश्चित करें कि सीओ 2 गैस ऊष्मायन प्रणाली के सीओ 2 मॉड्यूल के लिए चल रहा है. यदि खुर्दबीन एक हवा विरोधी कंपन तालिका द्वारा समर्थित है, हवा तालिका के लिए हवा की आपूर्ति (या एन 2 गैस) पर बारी.
  2. खुर्दबीन स्टैंड के लिए सत्ता पर बारी, कताई डिस्क इकाई, कैमरे, ऊष्मायन मॉड्यूल, HXP प्रकाशक, motorized मंच, आर्गनलेजर, और कंप्यूटर.
  3. वार्म अप समय के 1 मिनट के बाद, आर्गन लेजर के लिए "पर" इग्निशन कुंजी बारी.
  4. Zeiss लेजर नियंत्रण कक्ष पर, लेजर के लिए इस्तेमाल किया जा लाइनों के लिए स्विच पर बारी.
  5. "लेजर रन" "अतिरिक्त" से Lasos आर्गन लेजर नियंत्रक के लिए टॉगल स्विच और प्रकाश नियंत्रक को समायोजित इष्टतम स्तर (बस के नीचे यानी इस मुद्दे पर जहां हरी संकेतक लाल हो जाता है).
  6. AxioVision सॉफ्टवेयर शुरू नोट: AxioVision लिए उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस खिड़कियों और पुल से नीचे मेनू कि विशेष माइक्रोस्कोप और घटक है कि यह नियंत्रण के लिए विशिष्ट हैं के साथ अनुकूलित किया जा सकता है. जैसे, प्रत्येक प्रणाली एक संभावित अद्वितीय इंटरफ़ेस है. इसलिए, सॉफ्टवेयर हेरफेर के लिए सामान्य निर्देश के बाद के चरणों में प्रदान की जाती हैं विशेष सॉफ्टवेयर खिड़कियां, टैब और / या पुल से नीचे मेनू के लिए निर्देशों के बजाय,.
  7. लगभग 1 घंटा पहले इमेजिंग, सॉफ्टवेयर में, मशीन के लिए नियंत्रण का पता लगाने औरऊपरी सदन और मंच की थाली के लिए हीटिंग पर बारी. 37 डिग्री सेल्सियस तापमान सेट सीओ 2 के नियंत्रण पर मुड़ें और 5% से कम स्तर सेट.
  8. इमेजिंग के लिए ऑब्जेक्टिव लेंस का चयन करें. इस अध्ययन में, एक 63x/1.20 NA सी / जल Corr APOCHROMAT उद्देश्य लेंस का इस्तेमाल किया गया था नोट: इस लेंस के लिए, पानी (Zeiss Immersol डब्ल्यू विसर्जन के तरल पदार्थ) के लिए इसी तरह की एक अपवर्तक सूचकांक के साथ एक विसर्जन मध्यम जरूरत है.
  9. यदि एक से अधिक अलग - अलग पदों के लिए समय की एक लंबी अवधि में जांचा जा रहे हैं, विसर्जन माध्यम के लिए पर्याप्त मात्रा में लागू करने के लिए यह सुनिश्चित करना है कि यह एक स्थान से दूसरे करने के लिए किया जाता है कुछ हो.
  10. मंच पर पकवान प्लेस और उद्देश्य लेंस के नीचे के साथ संपर्क में लाना.
  11. या तो माइक्रोस्कोप नियंत्रण या सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, eyepieces उत्सर्जित प्रकाश प्रत्यक्ष और चुनें उपयुक्त widefield फिल्टर ब्याज की फ्लोरोसेंट संकेत (इस अध्ययन के लिए, "लाल" फिल्टर 53BP1 और एक "GFP" फिल्टर के लिए सेट H2B के लिए सेट के लिए सेट )./ Li>
  12. नेत्र लेंस के माध्यम से देखें, छवि ध्यान देते हैं, और कोशिकाओं के एक उपयुक्त क्षेत्र का पता लगाने.
  13. या तो सॉफ्टवेयर या खुर्दबीन नियंत्रण का उपयोग, confocal कताई डिस्क यूनिट के साथ बंदरगाह eyepieces से उत्सर्जित प्रकाश दूर प्रत्यक्ष.
  14. सॉफ्टवेयर में, उपयुक्त लेजर (इस अध्ययन में, 561 एनएम लेजर 53BP1 के लिए और 488 H2B लिए Argon लेजर की लाइन एनएम के लिए) पर बारी.
  15. प्रत्येक चैनल के लिए एक उचित स्तर पर acousto ऑप्टिक tunable फ़िल्टर नियंत्रण (AOTF) का समायोजन करके लेजर की तीव्रता को समायोजित.
  16. उपयुक्त dichroic दर्पण (RQFT 405/488/568/647) और उत्सर्जन फिल्टर (53BP1 और 50/525 बीपी 629/62 H2B के लिए बीपी) का चयन करें. कताई डिस्क इकाई शटर खुला.
  17. देखने के वर्तमान क्षेत्र प्रदर्शित करने के लिए "लाइव" खिड़की का चयन करें.
  18. सॉफ्टवेयर में "कैमरा" नियंत्रण खुला, कैमरे का इस्तेमाल किया जा (यदि एक दोहरी कैमरा प्रणाली) का चयन करें और लगभग 100 एमएस के लिए जोखिम समय निर्धारित किया है. % समायोजित और EM हासिल परिषद के रूप में. essary नोट: का निर्माण 53BP1 mCherry कुछ धुंधला दिखाई देता है. हम यह EM लाभ को बढ़ाने के लिए उपयोगी पाया.
  19. सॉफ्टवेयर, confocal कताई डिस्क इकाई के लिए नियंत्रण को खोलने के लिए और कैमरे के जोखिम समय है कि एक उपयुक्त छवि (उदाहरण के लिए एमएस ~ 100) पर कब्जा करने के लिए स्थापित किया गया था दर्ज करके कताई डिस्क की गति को समायोजित. बदलने में बंद करने के लिए "सेट" क्लिक करें.
  20. "बहु - आयामी अधिग्रहण" खोलें. चैनल टैब का चयन करें और लोड / उपयुक्त चैनलों का चयन. इस अध्ययन के लिए, हम (561 एनएम लेजर उत्तेजना और बीपी 629 / उत्सर्जन के लिए 62 फिल्टर) dsRed और GFP (उत्तेजना और उत्सर्जन के लिए BP525/50 फिल्टर के लिए 488 एनएम लेजर लाइन) के लिए परिभाषित चैनलों का उपयोग कर रहे हैं.
  21. छवि पंजीकरण सुनिश्चित करने के लिए, एक आम dichroic दर्पण (RQFT 405/488/568/647) दोनों चैनलों के लिए इस्तेमाल किया गया था. Autofocus "सॉफ्टवेयर सेट नोट: एमडीए सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए उपकरण → सेटिंग्स संपादक पर जाएँ. सुनिश्चित करें कि पर्याप्त लेजर शक्ति ("पर्याप्त लेजर शक्ति" एक सेटिंग है जो आपको करने के लिए संदर्भित करता है सेट कर दिया जाता हैउचित fluorophore उत्तेजित जबकि तस्वीर विरंजन कम से कम).
  22. एमडीए विंडो में, z ढेर टैब का चयन करें. "वर्तमान ध्यान केंद्रित करने की स्थिति में Z-ढेर" चुनें. Z ढेर का सही आकार अपने कोशिकाओं की ऊंचाई पर निर्भर करेगा: ~ 10 Z-ढेर Nyquist नमूना जेड नोट के माध्यम से सुनिश्चित करने के लिए कदम की संख्या के लिए "इष्टतम" चुनें सुक्ष्ममापी के लिए सीमा निर्धारित करें. तदनुसार समायोजित करें.
  23. 23. क्लिक करें "आरंभ" और परिणामस्वरूप z ढेर छवि का विश्लेषण करने के लिए सुनिश्चित सेटिंग्स तुम क्या छानबीन कर रहे हैं के लिए उपयुक्त हैं (इस अध्ययन में जैसे यह पूरे नाभिक छवि के लिए महत्वपूर्ण था).
  24. "टी" (समय) टैब का चयन करें. कोशिकाओं की तस्वीर विरंजन कम से कम करने के लिए, प्रयोग: camptothecin साथ हमारे प्रयोग के लिए, हम 5 मिनट और एक नियंत्रण (गैर इलाज कोशिकाओं) वीडियो के लिए 1 घंटे के लिए सत्र की कुल अवधि के लिए इमेजिंग timepoints के बीच अंतराल नोट निर्धारित किया है. करने के लिए कॉन्फ़िगर किया जाना चाहिए जैसे कि इमेजिंग समय बिंदुओं के बीच AOTF लेजर कारतूस.
  25. एफइमेजिंग या पकवान में कई कोशिकाओं की बहु बिंदु, एमडीए खिड़की में, स्थिति टैब का चयन करें. सुनिश्चित करें की जाँच की है "प्रति स्थिति / के बाद समय की बात से पहले सेटिंग 'लागू करें". "Mark_Find" का चयन करें. "लाइव" दृश्य का उपयोग कर, पकवान घूमने और देखने के उपयुक्त क्षेत्र का चयन करें.
  26. बहु - आयामी अधिग्रहण मेनू पर "प्रारंभ" करने के लिए प्रयोग शुरू करने के लिए और एक नियंत्रण वीडियो रिकॉर्ड (अनुपचारित कोशिकाओं) पर क्लिक करें.
  27. नियंत्रण वीडियो के बाद, उचित उपचार (इस मामले में, 10 सुक्ष्ममापी camptothecin में) जोड़ने. हम 2-4 घंटे के लिए प्रयोगात्मक (कोशिकाओं दवा इलाज) 5-10 मिनट के अंतराल पर वीडियो रिकॉर्ड नोट: एक महत्वपूर्ण मुद्दे पर विचार करने के लिए जिस गति के साथ एक दिया प्रभाव उपचार के बाद होता है. के रूप में वीडियो में देखा, 53BP1 foci ~ CPT के अलावा के बाद 5 मिनट से शुरू करते हैं. हालांकि एक अपेक्षाकृत आसान प्रक्रिया, डिश के लिए दवा मैन्युअल रूप से जोड़ने और माइक्रोस्कोप फिर से औजार समय लगेगा. विचार यह करने के लिए दिया जाना चाहिए जब प्रयोगों डिजाइन.
  28. मीटर की निगरानी के लिएitosis, हम 7.5 मिनट के लिए अंतराल सेट और 4-5 घंटे (विशिष्ट सेटिंग्स सेल लाइन और अपने सेल चक्र की लंबाई पर निर्भर करता है) के लिए दर्ज की गई. समायोजन करने के लिए अब रिकॉर्डिंग के दौरान तस्वीर विरंजन को रोकने के लिए किए जाने की जरूरत हो सकता है.

सी. इमेज प्रोसेसिंग और विश्लेषण

इस प्रोटोकॉल Volocity सॉफ्टवेयर (PerkinElmer) का उपयोग कर विकसित किया गया था. सॉफ्टवेयर लिए इस डेटा (AxioVision) का अधिग्रहण किया भी करने के लिए प्रक्रिया और छवियों का विश्लेषण करने की क्षमता है. उपयोगकर्ता उन्हें उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए, और उनके आवेदन के संबंध में उपयुक्त साहित्य से परामर्श करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है.

  1. Volocity सॉफ्टवेयर खोलें. बनाएँ और एक नए पुस्तकालय का नाम, और अपने वीडियो फ़ाइलों को आयात.
  2. फ़ाइलों को देखने के लिए, हम आम तौर पर यह सबसे "विस्तारित फोकस" सेटिंग का उपयोग करने के लिए मददगार मिल. यह z ढेर स्लाइस superimposes और, इस प्रोटोकॉल के लिए, हमें नाभिक के विभिन्न क्षेत्रों में 53BP1 foci कल्पना करने के लिए अनुमति देता है.
  3. आवश्यक के रूप में वीडियो को समायोजित करें. Volocity अधिग्रहीत छवियों की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए उपकरणों की एक श्रृंखला के साथ सुसज्जित है. सुनिश्चित करना है खुर्दबीन पर सेटिंग्स उपयुक्त थे, पर बाद में संपादन में ज्यादा समय बचाया जा सकता है. अक्सर, यह उपयोगी है आपकी छवियों और चमक / विपरीत समायोजित deconvolve. अपने विशिष्ट संपादन की जरूरत के प्रयोग के आधार पर अलग अलग होंगे.
  4. एक रिश्तेदार समय स्टाम्प और बड़े पैमाने बार जोड़ें.
  5. 3-D में कोशिकाओं को देखने के लिए, "अपारदर्शिता 3-D" स्थापित करने के लिए स्विच. यह अंतरिक्ष में 3-D गाया कोशिकाओं के रोटेशन की अनुमति देता है, इस प्रकार की कोशिकाओं के भीतर ब्याज की संरचनाओं के एकाधिक दृष्टिकोण प्रदान नोट: यह उपयोगी है विभिन्न विमानों में कोशिकाओं कल्पना करने के लिए निर्धारित जहां ब्याज यात्रा के संरचनाओं. उदाहरण के लिए, "विस्तारित फोकस" सेटिंग में यह करने के लिए विचार करना मुश्किल है कि वास्तव में 53BP1, करता है, पिंजरे का बँटवारा दौरान डीएनए से अलग कर देना. हालांकि, इस 3-D में आसानी से स्पष्ट है.
  6. सिनेमा और अभी भी छवियों उपयोगकर्ता वरीयता के आधार पर फ़ाइल प्रकार की एक किस्म में निर्यात किया जा सकता है. i>

प्रतिनिधि डी. परिणाम

CPT के लिए प्रतिक्रिया में 53BP1 foci के गठन के एक उदाहरण चित्रा 1 में दिखाया गया है. कोशिकाओं को 5-10 मिनट के भीतर CPT फार्म का foci उजागर, और रिकॉर्डिंग की अवधि के दौरान इन foci बनाए रखें. चित्रा 2, पिंजरे का बँटवारा की शुरुआत में 53BP1 chromatin से dissociates में दिखाया है, संघनक गुणसूत्रों के चारों ओर एक पतली धुन्ध के गठन. जैसा कि telophase होता है और पिंजरे का बँटवारा एक को समाप्त करने के लिए आता है, एक बार फिर अलग foci में 53BP1 समुच्चय. जबकि HEK293 कोशिकाओं CPT संपर्क में नहीं थे, वे फिर भी प्रचुर मात्रा में है, सहज 53BP1 मरम्मत अंतर्जात डीएनए की क्षति के द्वारा उत्पन्न foci का गठन किया था. इस अवलोकन हमें समाप्त करने के लिए है कि जल्दी पिंजरे का बँटवारा दौरान 53BP1 foci फार्म नहीं करता पिछले एक विकिरण और radiomimetic दवाओं 5 कोशिकाओं के प्रदर्शन के बाद एक समान प्रभाव दिखाने वाली रिपोर्ट के साथ लाइन में, की अनुमति दी.

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चित्रा 1. Camptothecin (10 सुक्ष्ममापी) DSBs और मध्यम करने के लिए दवा जोड़ने के 30 मिनट के भीतर fibroblasts साइकिल चालन में 53BP1 foci गठन का कारण बनता है.

चित्रा 2
चित्रा 2 53BP1 foci HEK293 कोशिकाओं में telophase/G1 तक फार्म नहीं पिंजरे का बँटवारा दौरान.

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Discussion

जीनोमिक अखंडता के रखरखाव सेल अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है. समय से पहले बूढ़ा, carcinogenesis, या 8 मौत में जीनोम परिणाम के संरक्षण में विफलता. समझदार में गहन रुचि है कैसे DDR कार्यों, दोनों बुनियादी और नैदानिक ​​अनुसंधान के लिए इसके महत्व से stemming. कैसे कोशिकाओं का पता लगाने और डीएनए क्षति की मरम्मत के अध्ययन में सहायता करने के लिए कई तकनीकों वर्षों में विकसित किया गया है. सोख्ता ऐसे immunocytochemistry और पश्चिमी के रूप में पारंपरिक तरीकों क्षेत्र के mainstays किया गया है, हालांकि प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में हाल के अग्रिमों तेजी से परिष्कृत तरीके विकसित करने के लिए अनुमति दी है. सेल इमेजिंग जीते, इस प्रोटोकॉल के रूप में विस्तृत है, हमें अधिक परंपरागत तकनीकों द्वारा अनदेखी DDR की विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है.

जीना सेल इमेजिंग के उपयोग करने के लिए केन्द्रीय fluorescently लेबल प्रोटीन की रचना है. यहाँ हम एक mCherry टैग DDR में शामिल प्रोटीन, 53BP1, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक histone H2B के उपयोग का वर्णनसंलयन उत्पाद GFP. Fluorescently लेबल प्रोटीन सेलुलर और आणविक जीव विज्ञान में बड़े पैमाने पर उपयोग किया जाता है, लेकिन वे अपनी सीमाओं के बिना नहीं कर रहे हैं. एक अंतर्जात प्रोटीन के लिए एक उपन्यास संरचना संलग्न प्राकृतिक समारोह में फेरबदल की स्पष्ट खतरा पैदा करता है. इसके अतिरिक्त, कुछ constructs कर सकते हैं और विभिन्न सेल लाइनों में विभिन्न स्तरों पर विभिन्न शर्तों के तहत, व्यक्त की है. हम अनुवांशिक इंजीनियर इस अध्ययन में इस्तेमाल कोशिकाओं के सभी में फ्लोरोसेंट तीव्रता की विविधतावादी स्तर मनाया गया है. का निर्माण 53BP1 इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल सबसे कार्यात्मक डोमेन का अभाव है, लेकिन यह डीएनए की क्षति के साइटों जो प्रतिकूल 2 सेल प्रभावित नहीं लगता करने के लिए बाध्य करने की क्षमता रखता है.

इसके अतिरिक्त, यह जीन वितरण की विधि पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है. Lentiviral पारगमन और स्थिर अभिकर्मक: इस प्रोटोकॉल में, हम दो तरीकों का इस्तेमाल किया. हमारी lentivirus संक्रमित कोशिकाओं stably फ्लोरोसेंट निर्माण के साथ transduced कर रहे हैं;इसलिए वे इन प्रोटीनों को अनिश्चित काल को व्यक्त करने के लिए जारी रहेगा. हालांकि, इस विधि अभिकर्मक की तुलना में कुछ अधिक श्रम गहन है और कोशिकाओं की तरह है जिसके द्वारा निशाना बनाया जा रहा है तय करती है, कुछ कोशिकाओं कुशल अभिकर्मक करने के लिए उत्तरदायी नहीं हैं. दूसरी ओर, lentiviruses मानव सहित सबसे कोशिकाओं में प्रवेश करने में सक्षम हैं. जांचकर्ताओं प्रत्येक विधि पेशेवरों और विपक्ष तौलना जब यह अपने खुद के प्रयोगों के लिए आता है के लिए प्रोत्साहित किया जाता है. Fluorescently लेबल प्रोटीन में निहित समस्याओं circumventing के एक संभव साधन के रूप में, हाल ही में सेल पारगम्य fluorescently लेबल जांच के उपयोग जीवित कोशिका के प्रयोगों के लिए 10 में सूचित किया गया. हालांकि, इस तकनीक अभी तक पूरी तरह विकसित किया जाना है.

जीना सेल इमेजिंग के एक प्राथमिक लाभ DDR और DSB मरम्मत के spatiotemporal संबंधों का अध्ययन करने की क्षमता है. दरअसल, Dimitrova एट अल (2008). Fluorescently लेबल जीवित कोशिकाओं का पालन करने के लिए और उपन्यास में प्रकट करने के लिए करने में सक्षम थे53BP1 telomeres के लिए बाध्य है और कैसे यह chromatin गतिशीलता को प्रभावित करता है के बारे में गठन. इस विश्लेषण काफी अधिक चुनौतीपूर्ण हालांकि असंभव नहीं है, अन्य तरीकों के साथ होगा. करने के लिए समय और स्थान दोनों में DDR की निगरानी करने की क्षमता होने के लिए हमें काम करता है और रिश्तों कि हम अन्यथा की अनदेखी हो सकता है विचार करने के लिए अनुमति देता है.

सारांश में, जीना सेल इमेजिंग का उपयोग कर शोधकर्ताओं ने DSB और वास्तविक समय में गठन के संकल्प के कैनेटीक्स पर नजर रखने के लिए सक्षम बनाता है, और एक एकल कोशिका के स्तर पर मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है. इस अध्ययन में इस्तेमाल तकनीक के अलावा, जीना सेल इमेजिंग के अन्य अनुप्रयोगों झल्लाहट और 3 FRAP में इस्तेमाल किया जा सकता है. वास्तविक समय में कोशिकाओं की नमाज़ की तकनीक पर सुधार किया और सेलुलर प्रक्रियाओं की एक किस्म का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल जारी रहेगा.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

R01NS064593 और R21ES016636 (केवी) के हिस्से में समर्थन. माइक्रोस्कोपी VCU पर प्रदर्शन किया गया था - तंत्रिका जीव विज्ञान और एनाटॉमी माइक्रोस्कोपी सुविधा का विभाग, NIH NINDS केंद्र कोर अनुदान 5P30NS047463 से धन के साथ भाग में, समर्थित. कताई डिस्क confocal खुर्दबीन एक पुरस्कार NIH-NCRR साथ (1S10RR027957) खरीदा गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CellStar culture dishes Greiner Bio-one
FluroDish glass bottom dishes World Precision Instruments, Inc.
MEM media GIBCO
Non-essential amino acids GIBCO
Amino acids GIBCO
Vitamins GIBCO
Sodium Pyruvate Invitrogen
Penicillin/Streptomycin HyClone
Fetal Bovine Serum GIBCO
N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro;
plasmid 19836
Addgene
pCLNR-H2BG; plasmid 17735 Addgene
SuperFect Qiagen
Zeiss Cell Observer SD Imaging system Zeiss
AxioVision (release 4.8.2) Zeiss
Zeiss Immersol W Oil Zeiss
Volocity software (version 6.0) PerkinElmer

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References

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Comments

2 Comments

  1. Hi

    I think there is a mistake in the protocol. it should be the plasmid http://www.addgene.org/19835/ mCherry-BP1-2 pLPC-Puro from Titia De Lange lab, isn't it?
    the 19836 is N-Myc tagged and not mCherry.


    Reply
    Posted by: Valentine C.
    June 29, 2015 - 11:11 AM
  2. Ah, yes, you are correct. I apologize for missing that.

    Reply
    Posted by: Jason B.
    August 15, 2015 - 2:35 PM

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