DNA의 손상 응답 단백질의 2와 3 차원 라이브 셀 이미징

Biology

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Summary

이 프로토콜은 DNA 손상뿐만 아니라 유사 분열 동안의 현지화에 대한 응답으로 활성화 DNA 이중 가닥 브레이크 신호 단백질을 시각화하는 방법을 설명합니다.

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Beckta, J. M., Henderson, S. C., Valerie, K. Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins. J. Vis. Exp. (67), e4251, doi:10.3791/4251 (2012).

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Abstract

두 번 스트랜드 바꿈이 (DSBs) 가장 해로운 DNA 아르 것은 셀 발생할 수 있습니다 병변. unrepaired 왼쪽 경우, DSBs 항구 잠재력은 돌연변이와 염색체 aberrations 하나를 생성합니다. DSBs을 감지하는 세포가 DNA 손상 반응 (DDR)을 활성화하고, DNA를 수리에 대한 게놈 불안정성을 catalyzing에서이 외상을 방지하기 위해, 그것은 매우 중요합니다. 자극하면, DDR 수리가 이루어 또는 apoptosis를 받아야하는 셀을 강제 할 수 있도록 세포주기의 체포를 실행하여 게놈 무결성을 유지하기 위해 노력하고 있습니다. DSB 수리의 주된 메커니즘은 nonhomologous 최종 입사 (NHEJ) 및 동종 재조합 수리 (HRR) (2에서 검토)를 통해 발생합니다. 그의 활동을 정확하게 DDR가 제대로 작동 할 수 있도록 조정해야합니다 많은 단백질이 있습니다. 이러한 단백질 중 하나 53BP1의 3 차원 (D) 시각화 - 여기, 우리는 2에 대한 방법을 설명합니다.

p53의 결합 단백질 1 (53BP1는)의 영역에 localizes5-15분 5에서 foci를 형성, 수정 histones 3,4에 바인딩하여 DSBs. DSB 사이트에 53BP1 및 기타 DDR 단백질의 히스톤 수정 및 채용은 피해 지역 주변 염색질의 구조 다시 정리하기를 촉진하고 DNA 복구 6 기여할 것으로되어 있습니다. 수리에 직접 참여 외에도 추가 역할은 이러한 내부-S 검사 점 (Checkpoint), G2 / M 검문소를 조절하고 하류 DDR 단백질에게 7-9 활성화로 DDR에 53BP1에 대해 설명되어 있습니다. 최근,이 53BP1 대신 DSBs 6 근처에 로컬 라이즈하기 전에 G1를 입력 할 셀을 기다리고, 유사 분열 동안 유도 DNA 손상에 대한 응답으로 foci를 형성하지 않는 것을 발견했습니다. 같은 53BP1 등의 DDR 단백질은 세포의 유사 분열부터 10까지 진행하는 동안 mitotic 구조 (예 : kinetochores 등)과 연관이 발견되었습니다.

이 프로토콜에서 우리는 (2)의 사용을 설명 - 3-D 라이브 세포 이미징은 시각화하는DNA 손상 대리인 camptothecin (CPT)뿐만 아니라, 유사 분열 동안 53BP1의 행동에 대응 53BP1 foci의 형성. Camptothecin는 주로​​ DNA 복제 동안 DSBs의 원인이 제가 억제제가 topoisomerase입니다. 이 작업을 수행하기 위해, 우리는 이전에 설명 53BP1 - mCherry 형광 융합 단백질은 DSBs 11 바인딩 할 수 53BP1 단백질 도메인으로 구성을 구성했습니다. 또한, 우리는 히스톤 H2B-GFP 형광 융합 단백질은 세포의 유사 분열 12시 세포주기에 걸쳐 있지만, 특히 염색질 역학을 모니터링 할 수 구성 사용됩니다. 여러 차원에서 라이브 셀 이미징은 진핵 세포의 DDR 단백질의 기능에 대한 우리의 이해를 깊게 할 수있는 훌륭한 도구입니다.

Protocol

A. 셀 준비

  1. 일반 인간의 기본 섬유 아세포 (GM02270)는 Coriell 셀 저장소, 캠든 (Camden), 뉴저지에서 얻은 및 hTERT 6 불후의되었습니다. 셀은 CellStar에서 재배하고 확장 된 20% 태아 소 혈청 (GIBCO), non-essential/essential 아미노산, 비타민, 나트륨 pyruvate, 그리고 페니실린 / 스트렙토 마이신 (HyClone을 보충 가상으로 구성된 미디어 6 cm 요리 (4 ML) ).
  2. 인간 배아 신장 293 (HEK293) 전지는 미국 유형 문화 수집에서 얻은 및 CellStar 6 cm 요리에서 재배하고 확장되었습니다. 세포 10 % 태아 소 혈청, 비 필수 아미노산, L-글루타민과 보충 DMEM, 그리고 페니실린 / 스트렙토 마이신으로 구성된 미디어 (4 ML)에 보관되었다.
  3. 53BP1 - mCherry (N-Myc-53BP1 WT pLPC - Puro, Addgene 플라스미드 19836) 및 H2B-GFP (pCLNR-H2BG, Addgene 플라스미드 17735)이 융합 유전자는 puromycin 또는 G418 저항 유전자를 표현 구조, 각각 (fibrobla transduced되었습니다STS) 또는 transfected (HEK293)는 세포에 SuperFect (Qiagene)을 사용 및 약물 선택에 따라 유지. 형광의 유지 관리가 주기적으로 확인되었습니다.
  4. 24-48 시간 이미지 수집하기 전에 셀은 하나의 셀 정지로 trypsinized되었으며 3.5 cm FluroDish 유리 바닥 판에 낮은 밀도에 놓는.

B. 현미경 설정 및 이미지 수집

이 프로토콜은 AxioObserver Z1 스탠드, 듀얼 채널 Yokagawa CSU-X1A 5,000 회전 디스크 장치, 2 Photometrics QuantEM 512SC emCCD 카메라, HXP 120C 섬유 기반의 조명기, 4이 장착 된 Zeiss 셀 옵저버 SD 회전 디스크 공 촛점 현미경을 사용하여 개발 된 레이저 (Lasos 100mW 여러 줄 아르곤 [458, 488, 514 nm의], 50 MW 405 nm의 다이오드, 40 MW 561 nm의 다이오드, 30 MW 635 nm의 다이오드), AOTF, Pecon XL multiS1 단계의 배양 시스템, Zeiss의 배양 모듈 (O 2 모듈 S, CO 2 모듈 S, TempModule의 S, 난방 단위 XL S) 및 이전 모NanoScanZ 압전 Z 삽입과 torized XY 무대. 영상 라이브 세포가 수성 매체, C-고차 색지움 63x/1.20 물 / Corr 목적 렌즈와 Zeiss Immersol W 침적 액 (굴절률 n은 = 1.334 포함)에서 지원하는 반면 구형 aberrations을 최소화하려면 사용되었습니다. 2 채널 공 촛점 이미징, RQFT 405/488/568/647 이색 성 거울과 BP525/50 (녹색)과 BP629/62를 들어 (빨간색) 방출 필터가 사용되었습니다. 사용 시스템 소프트웨어 AV4 Multi-channel/Z/T, 빠른 이미징, 생리학, MosaiX, 마크 찾기 (& F), 듀얼 카메라, 4D 내부, 자동 초점 및 3-D의 Deconvolution 모듈과 Zeiss Axiovision (ver. 4.8.2.0)였습니다.

  1. 그 CO 2 가스가 부화 시스템의 CO 2 모듈로 실행 중인지 확인하십시오. 현미경은 방진 공기 테이블에서 지원하는 경우, 공기 테이블에 대한 공기 공급 (또는 N 2 가스)를 설정합니다.
  2. 회전 디스크 장치, 카메라, 부화 모듈, HXP 조명기, 동력 무대, 아르곤, 현미경 스탠드의 전원을 켭니다레이저, 컴퓨터.
  3. 워밍업 시간이 1 분 후 "On"으로 아르곤 레이저에 대한 점화 키를 켜십시오.
  4. Zeiss 레이저 제어 패널에서 사용되는 레이저 라인의 스위치를 켜십시오.
  5. "레이저 실행"를 "대기 모드"에서 Lasos 아르곤 레이저 컨트롤러에 대한 토글 스위치를 전환하고 최적의 수준 (아래 녹색 표시기가 빨간색으로 바뀌고 지점)에 빛 컨트롤러를 조정합니다.
  6. AxioVision 소프트웨어를 시작합니다주의 :. AxioVision의 사용자 인터페이스가 제어하는 특정 현미경과 구성 요소에 대한 구체적인 창문과 풀다운 메뉴를 사용자 정의 할 수 있습니다. 따라서, 각 시스템은 잠재적으로 독특한 인터페이스를 갖추고 있습니다. 따라서, 소프트웨어 조작에 대한 일반적인 지침은 오히려 특정 소프트웨어 창, 탭 및 / 또는 풀다운 메뉴에 대한 방향보다 다음 단계로 제공됩니다.
  7. 이미징하기 전에 약 1 시간은 소프트웨어, 보육에 대한 컨트롤을 찾아상부 챔버와 무대 판에 난방을 설정합니다. 37 ° C.에 온도를 설정 CO 2 제어 전원을 켜고 5 % 수준을 설정합니다.
  8. 이미징을위한 목적 렌즈를 선택합니다. 본 연구에서는 63x/1.20 NA C-고차 색지움 물 / Corr 객관적인 렌즈는 사용 된 참고 :.이 렌즈를 들어, 물 (Zeiss Immersol W 침적 액)과 유사한 굴절률과 집중 매체가 필요합니다.
  9. 여러 별도의 위치는 오랜 기간 동안 샘플링 할 경우,이 한 위치에서 다른 실행되도록 집중 매체의 충분한 양을 적용 할 확신 할 수.
  10. 무대에 요리를 놓고 바닥과 접촉 목적 렌즈를 가져.
  11. 현미경 통제 또는 소프트웨어 중 하나를 사용하여 접안 렌즈로 방출되는 광을 직접하고 적절한 widefield 필터가 관심의 형광 신호 (이 연구에 대해 "레드"필터 53BP1와 'GFP "필터 설정 H2B에 대해 설정에 대해 설정을 선택 ). </ 리>
  12. , 안구 렌즈를 통해보기 이미지를 집중하고, 세포의 적절한 필드를 찾습니다.
  13. 소프트웨어 또는 현미경 컨트롤 중 하나를 사용하여 공 촛점 회전 디스크 장치와 포트에 접안 렌즈에서 방출되는 광을 멀리 지시.
  14. 소프트웨어에서 해당 레이저 (이 연구 53BP1에 대한 561 nm의 레이저와 H2B에 대한 아르곤 레이저의 488 nm의 선)을 설정합니다.
  15. 각 채널에 대해 적절한 수준으로 음향 광학 조정할 수있는 필터 (AOTF) 컨트롤을 조정하여 레이저의 강도를 조정합니다.
  16. 해당 이색 성 거울 (RQFT 405/488/568/647) 및 방출 필터를 (H2B에 대한 53BP1 및 BP 50분의 525에 대한 BP 62분의 629)을 선택합니다. 회전 디스크 장치에 셔터를 엽니 다.
  17. 보기의 현재 필드를 표시하려면 "라이브"창을 선택합니다.
  18. 소프트웨어에서 "카메라"제어를 열고 카메라 (듀얼 카메라 시스템 경우) 사용을 선택하고 약 100 밀리로 노출 시간을 설정합니다. %를 조정하고 EM은 얻을 NEC 등. essary 참고 : 53BP1-mCherry의 구조는 다소 희미 나타납니다. 우리는 EM 게인을 증가하는 것이 도움이 발견했습니다.
  19. 소프트웨어에서 공 촛점 회전 디스크 단위 컨트롤을 열고 적절한 이미지를 (예를 들면 ~ 100 밀리 초) 캡처하도록 설정 한 카메라 노출 시간을 입력하여 회전 디스크 속도를 조정합니다. 변화를 잠글 "설정"을 클릭하십시오.
  20. "다차원 인수"를 엽니 다. 채널 탭을 선택하고로드 / 해당 채널을 선택합니다. 본 연구의 경우, 우리는 dsRed (561 nm의 레이저 여기와 BP 629 / 방출에 대한 62 필터)와 GFP (여기와 방출 BP525/50 필터에 대한 488 nm의 레이저 라인)에 대해 정의 채널을 사용하고 있습니다.
  21. 이미지 등록을 보장하기 위해 공통의 이색 성 거울 (RQFT 405/488/568/647)는 두 채널 모두 사용되었다. "자동 초점"로 소프트웨어를 설정합니다. 참고 : MDA 설정을 조정 도구 → 설정 편집기로 이동합니다. 그 적절한 레이저 전원 ( "적절한 레이저 전원이"당신을 수있는 설정을 나타냅니다 설정되어 있는지 확인사진 표백을 최소화하면서) 적절한 형광을 자극 할 수 있습니다.
  22. MDA 창에서 Z-스택 탭을 선택합니다. "Z-스택 현재의 초점 위치에"를 선택하십시오. Z-스택의 정확한 크기는 셀의 높이에 따라 달라집니다 : ~ 10 μm Z-스택과 Z. 참고를 나이 퀴 스트 (Nyquist) 샘플링을 보장하는 단계의 수에 대해 "최적"를 선택의 범위를 설정합니다. 그에 따라 조정합니다.
  23. 23. "시작"과 설정이 조사하는 일에 대한 적절한 보장하기 결과 Z-스택 이미지를 분석을 클릭합니다 (예를 들어 본 연구에서는, 그것은 이미지가 전체 핵을에 중요).
  24. "T"(시간) 탭을 선택합니다. camptothecin과의 실험, 우리는 5 분 및 제어 (비 처리 세포) 동영상에 대한 1 시간의 세션의 전체 기간에 영상 timepoints 사이의 간격을 설정합니다. 참고 : 셀의 사진 표백 최소화하기 위해, 실험 구성해야합니다 이러한 이미징 시간 지점 사이의 AOTF는 공백 레이저를 그.
  25. 에프또는 접시의 여러 세포의 다 지점 영상은 MDA 창에서 위치 탭을 선택합니다. 체크되어 "당 위치의 시간 지점 / 후 전에 설정을 '이 적용". 확인 "Mark_Find"를 선택하십시오. "라이브"보기를 사용하여 주변의 접시를 이동 및보기의 해당 필드를 선택합니다.
  26. 실험을 시작하고 (치료 세포의) 제어 비디오를 녹화 할 수 다차원-인수 메뉴에서 "시작"을 클릭합니다.
  27. 제어 비디오 후 적절한 치료를 (이 경우, 10 μM의 camptothecin)을 추가 할 수 있습니다. 우리 2-4 시간 5-10 분 간격으로 실험 (약물 처리 세포) 동영상을 녹화. 참고 : 고려해야 할 중요한 문제는 주어진 효과가 치료 후 발생하는 속도입니다. 비디오에서 본 바와 같이, 53BP1 foci는 CPT의 추가 후 ~ 5 분부터 시작합니다. 비교적 쉬운 과정은 수​​동으로 요리에 약물을 추가하고 현미경을 다시 보정하는 것은 시간이 걸릴 않지만. 실험을 설계 할 때 고려 사항이에게 부여해야합니다.
  28. m을 모니터링하기위한itosis, 우리는 7.5 분으로 간격을 설정하고 4-5 시간 (특정 설정을 사용 세포주 및 세포주기의 길이에 따라 달라)를 기록했다. 조정은 더 이상 녹음 중 사진 표백을 방지하기 위해 만든해야 할 수 있습니다.

C. 이미지 처리 및 분석

이 프로토콜은 Volocity 소프트웨어 (PerkinElmer)를 사용하여 개발되었습니다. 이 데이터 (AxioVision)를 취득하는 데 사용되는 소프트웨어는 또한 이미지를 처리​​하고 분석 할 수있는 능력이 있습니다. 사용자는 그들에게 사용할 수있는 소프트웨어를 활용하고, 자신의 응용 프로그램에 대한 적절한 자료를 상담하는 것이 좋습니다.

  1. Volocity 소프트웨어를 엽니 다. 작성하고 새 도서관의 이름을 지정하고 비디오 파일을 가져옵니다.
  2. 파일을보기 위해, 우리는 일반적으로 "확장 초점"설정을 사용하는 것이 가장 도움이 찾으십시오. 이 Z-스택 조각 superimposes 있으며,이 프로토콜에 대해 우리가 핵의 다른 영역에서 53BP1 foci를 시각화 할 수 있습니다.
  3. 필요에 따라 동영상을 조정할 수 있습니다. VOlocity는 획득 이미지의 품질을 개선 할 수있는 도구의 범위를 갖추고 있습니다. 현미경의 설정이 적절한 있었다함으로써 많은 시간이 나중에 편집에 저장할 수 있습니다. 종종, 그것은 이미지를 deconvolve하고, 밝기 / 대비를 조정하는 도움이 될 것입니다. 특정 편집 요구는 실험에 따라 달라집니다.
  4. 상대 타임 스탬프와 규모 막대를 추가합니다.
  5. 3-D에서 세포를 보려면 "3-D 불투명도"설정으로 전환합니다. 이 때문에 세포 내 관심 구조의 여러 관점을 제공, 공간의 3-D 렌더링 세포의 회전을 허용. 참고 :이 결정하는 다른 비행기에 세포를 시각화하는 데 도움 곳이자 여행의 구조. 예를 들어, "확장 초점"설정에서의 53BP1이 실제로 유사 분열 동안 DNA에서 해리 않는 분별하기가 어렵습니다. 그러나,이 3-D에 쉽게 명백합니다.
  6. 동영상 및 스틸 이미지는 사용자 환경 설정에 따라 파일 형식의 다양한으로 수출 할 수 있습니다. I>

D. 대표 결과

CPT에 대응 53BP1 foci 형성의 예는 그림 1에 표시됩니다. 셀 5-10 분 이내에 CPT 양식 foci에 노출 및 녹음 기간 내내이 foci를 유지하고 있습니다. 이름으로 응축 염색체 주위에 얇은 연무를 형성 그림 2, 유사 분열의 시작에서 염색질에서 53BP1 dissociates에 표시. telophase가 발생하고 유사 분열이 종료됩니다 바와 같이, 뚜렷한 foci로 53BP1 다시 한번 집계. HEK293 세포 CPT에 노출되지 않은 상태에서, 그들은 그럼에도 불구하고 내생 DNA 손상에 의해 생성 된 풍부한, 자연 53BP1 수리 foci를 형성. 이 관찰은 우리가 53BP1는 이온화 방사선 및 radiomimetic 약 5 셀의 노출 후 비슷한 효과를 보여주는 이전 보고서에 맞추어 초기 유사 분열 동안 foci를 형성하지 않는 결론을 할 수있었습니다.

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그림 1. Camptothecin (10 μM)는 DSBs 및 매체에 약물을 추가 30 분 이내에 섬유 아세포를 자전거에 53BP1 foci 형성이 발생합니다.

그림 2
그림 2. 53BP1는 HEK293 세포에 telophase/G1까지 유사 분열 동안 foci를 형성하지 않습니다.

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Discussion

게놈 무결성의 유지 관리 세포 생존을위한 중요합니다. 조기 노화, 발암 또는 사망 8 게놈 결과를 보존 실패했습니다. 안목에 강렬한 관심이 얼마나 기본 및 임상 모두 연구의 중요성에서 형태소 분석 DDR 기능. 대부분의 기술은 세포가 감지하고 DNA 손상을 복구하는 방법의 연구에 도움이 년 동안 개발되었습니다. 기술의 최근 진보가 점점 더 정교한 방법이 진화 할 수는 않았지만 blotting 등 immunocytochemistry과 서양 등의 전통적인 방법은 필드의 mainstays했습니다. 이 프로토콜에 설명으로, 세포 이미징 라이브, 우리가 더 전통적인 기법으로 간과 DDR의 특성을 연구 할 수 있습니다.

라이브 셀 이미징의 사용에 중심이 휘황이라는 단백질을 만드는 것이다. 여기 우리는 DDR에 참여 mCherry 태그 단백질, 53BP1뿐만 아니라 히스톤 H2B의 사용을 설명- GFP 융합 제품입니다. 휘황 분류 단백질은 분자와 세포 생물학에서 널리 사용되지만, 그들은 그들의 제한없이하지 않습니다. 내생 단백질에 소설 구조를 부착하는 것은 자연 기능을 변경의 명백한 위험을 만듭니다. 또한, 특정 구조는 다양한 조건 하에서 서로 다른 세포 라인의 여러 영역에서 표현 될 것입니다 수 있습니다. 우리는이 연구에 사용 된 유전자 변형 세포의 모든 형광 강도의 발산 수준을 관찰했습니다. 이 프로토콜에 사용되는 구성 53BP1 대부분의 기능 도메인이 부족하지만, 그것은 나쁜 세포 2에 영향을하지 않는 것 같습니다 DNA 손상의 사이트에 바인딩 할 수있는 능력을 보유합니다.

또한이 유전자 전달 방법을 고려하는 것이 중요합니다. lentiviral 도입하고 안정적​​인 transfection :이 프로토콜에서는, 우리는 두 가지 방법을 사용했습니다. 우리 lentivirus에 감염된 세포가 안정적으로 형광 구조와 transduced되며,따라서, 그들은 무기한이 단백질을 표현하는 것입니다. 그러나,이 방법은 transfection에 비해 좀 더 노동 집약적이며, 대상되는 세포의 어떤 종류에 의해 결정됩니다, 일부 세포는 효율적으로 transfection 의무가 없습니다. 한편, lentiviruses는 인간을 포함한 대부분의 세포를 입력 할 수 있습니다. 조사는 그 자신의 실험에있어서 각각의 방법에 장단점을 무게하도록 권장하고 있습니다. 휘황 분류 단백질의 고유 한 문제를 우회하는 수단으로, 세포 투과성의 휘황 표시된 프로브의 사용은 최근 라이브 세포 실험 10보고되었다. 그러나,이 기술은 완전히 개발되지 않았습니다.

라이브 셀 이미징의 주요 이점은 DDR과 DSB 복구의 spatiotemporal 관계를 연구 할 수있는 능력입니다. 사실, Dimitrova 외. (2008)는 휘황이라는 라이브 세포를 관찰하고에 소설을 표시 할 수 있었다telomeres에 53BP1 구속력이 어떻게 염색질 역학에 영향을 미치는에 관한 형성. 이 분석은 다른 방법으로, 불가능하지만, 훨씬 더 많은 도전이 될 것입니다. 공간과 시간 모두에 DDR을 모니터링 할 수있는 능력을 갖는다는 것은 우리가 기능과 우리가 다른 전망을 수도 있다는 관계를 분별 할 수 있습니다.

요약, 라이브 셀 이미징을 사용하여 연구자들이 실시간으로 DSB 형성 및 해상도의 동력학을 모니터링 할 수 있으며, 단일 세포 수준에서 정량 분석​​이 가능합니다. 본 연구에 사용 된 기술뿐만 아니라, 라이브 셀 이미징의 다른 응용 프로그램은 이러한 걱정과 3 FRAP으로 사용하실 수 있습니다. 실시간으로 세포를 관찰의 기술에 따라 개선 및 셀룰러 프로세스의 다양한 연구를 계속 사용합니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgments

R01NS064593 및 R21ES016636 (KV)에 의해 부분적으로 지원. 현미경은 VCU에서 수행 된 - 신경 생물학 및 해부학 현미경 시설의 부, NIH-NINDS 센터 핵심 보조금 5P30NS047463의 자금으로 일부를 지원합니다. 회전 디스크 공 촛점 현미경은 NIH-NCRR 상 (1S10RR027957)를 구입했습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CellStar culture dishes Greiner Bio-one
FluroDish glass bottom dishes World Precision Instruments, Inc.
MEM media GIBCO
Non-essential amino acids GIBCO
Amino acids GIBCO
Vitamins GIBCO
Sodium Pyruvate Invitrogen
Penicillin/Streptomycin HyClone
Fetal Bovine Serum GIBCO
N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro;
plasmid 19836
Addgene
pCLNR-H2BG; plasmid 17735 Addgene
SuperFect Qiagen
Zeiss Cell Observer SD Imaging system Zeiss
AxioVision (release 4.8.2) Zeiss
Zeiss Immersol W Oil Zeiss
Volocity software (version 6.0) PerkinElmer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Comments

2 Comments

  1. Hi

    I think there is a mistake in the protocol. it should be the plasmid http://www.addgene.org/19835/ mCherry-BP1-2 pLPC-Puro from Titia De Lange lab, isn't it?
    the 19836 is N-Myc tagged and not mCherry.


    Reply
    Posted by: Valentine C.
    June 29, 2015 - 11:11 AM
  2. Ah, yes, you are correct. I apologize for missing that.

    Reply
    Posted by: Jason B.
    August 15, 2015 - 2:35 PM

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