Två-och tredimensionell levande cell imaging av svar DNA-skador Proteiner

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Detta protokoll beskriver en metod för att visualisera en DNA-dubbel-strängbrott signalsystem protein aktiveras som svar på DNA-skada samt dess lokalisering vid mitos.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Beckta, J. M., Henderson, S. C., Valerie, K. Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins. J. Vis. Exp. (67), e4251, doi:10.3791/4251 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Dubbelklicka strängbrott (DSB) är den mest skadliga DNA-skador en cell kan stöta på. Om den lämnas oreparerade till DSB hamn stor potential generera mutationer och kromosomavvikelser 1. För att förhindra detta trauma från katalysera genomisk instabilitet, är det viktigt för celler att upptäcka DSB, aktiverar svaret DNA-skada (DDR), och reparera DNA. När stimuleras arbetar DDR för att bevara genomisk integritet genom att utlösa cellcykelstopp för att möjliggöra reparation att äga rum eller tvinga cellen att genomgå apoptos. De dominerande mekanismerna för DSB reparation sker genom icke-homolog slutet gå (NHEJ) och homolog rekombination reparation (HRR) (granskas 2). Det finns många proteiner vars verksamhet måste noggrant iscensatt för DDR att fungera korrekt. Häri beskriver vi en metod för 2 - och 3-dimensionella (D) visualisering av ett av dessa proteiner, 53BP1.

P53-bindande protein 1 (53BP1) lokaliseras till områdenDSB genom att binda till modifierade histoner 3,4 och bildar foci inom 5-15 minuter 5. De histon modifieringar och rekrytering av 53BP1 och andra DDR proteiner till DSB sajter tros underlätta strukturella ombildning av kromatin runt områden av skador och bidra till DNA-reparation 6. Utöver direkta deltagande i reparation, har ytterligare roller beskrivits för 53BP1 i DDR, som reglerar en intra-S Checkpoint, en G2 / M Checkpoint, och aktivera nedströms DDR proteiner 7-9. Nyligen upptäcktes det att 53BP1 inte bildar foci som svar på DNA-skada inducerad under mitos, utan väntar på celler att gå in G1 innan lokalisera till närheten av DSB 6. DDR proteiner såsom 53BP1 har befunnits associera med mitotiska strukturer (såsom kinetochores) under framskridandet genom mitos 10.

I detta protokoll beskriver vi användningen av 2 - och 3-D-levande cell imaging att visualiserabildandet av 53BP1 härdar som svar på DNA-skadande medlet kamptotecin (CPT), liksom 53BP1 beteende under mitos. Kamptotecin är en topoisomeras I hämmare som främst orsakar DSB under DNA-replikation. För att uppnå detta har vi använt en tidigare beskrivna 53BP1-mCherry fluorescerande fusionsprotein bygga bestående av ett 53BP1 proteindomän kan binda DSB 11. Dessutom använde vi en histon H2B-GFP fluorescerande fusionsprotein konstruera kunna övervaka kromatin dynamik i hela cellcykeln, men i synnerhet under mitos 12. Levande cell imaging i flera dimensioner är ett utmärkt verktyg för att fördjupa vår förståelse av funktionen hos DDR proteiner i eukaryota celler.

Protocol

A. cellberedning

  1. Normala humana primära fibroblaster (GM02270) erhölls från Coriell Cell Repository, Camden, New Jersey, och immortaliseras med hTERT 6. Celler odlades och expanderades i CellStar 6-cm skålar i medier (4 ml) bestående av MEM kompletterat med 20% fetalt bovint serum (GIBCO), non-essential/essential aminosyror, vitaminer, natriumpyruvat och penicillin / streptomycin (HyClone ).
  2. Humana embryonala njur 293 (HEK293)-celler erhölls från American Type Culture Collection och odlades och expanderades i CellStar 6-cm skålar. Cellerna hölls i media (4 ml) bestående av DMEM kompletterat med 10% fetalt bovint serum, icke-essentiella aminosyror, L-glutamin och penicillin / streptomycin.
  3. 53BP1-mCherry (N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro, Addgene plasmiden 19.836) och H2B-GFP (pCLNR-H2BG, Addgene plasmid 17.735) fusionsgenen konstruktioner också uttrycker puromycin eller G418 resistensgener respektive transducerades (fibroblam) eller transfekterade (HEK293) med SuperFect (Qiagene) i celler och hålls under narkotika val. Underhåll av fluorescens kontrolleras periodiskt.
  4. 24-48 timmar före bildinhämtning, trypsinerades cellerna i en enda cellsuspension och ympades vid en låg densitet på 3,5-cm FluroDish glasskivor botten.

B. Mikroskop installation och Image Acquisition

Detta protokoll har utvecklats med Zeiss Cell Observer SD spinning skiva konfokalmikroskop utrustad med en AxioObserver Z1 stativ, en dual-channel Yokagawa CSU-X1A 5000 spinning disk enhet, 2 Fotometrik QuantEM 512SC EMCCD kameror, en HXP 120C fiberbaserad belysning, 4 lasrar (en Lasos 100mW flera rader Argon [458, 488, 514 nm], 50 mW 405 nm diod, 40 mW 561 nm diod, och 30 mW 635 nm diod), AOTF, en Pecon XL multiS1 steg inkubering system Zeiss inkubation moduler (O 2 Modul S, CO 2 Modul S TempModule S värmeenhet XL S) och en tidigare motorized XY scenen med en NanoScanZ piezo Z insats. För att minimera sfärisk aberration, medan avbildning levande celler stöds i ett vattenhaltigt medium, en C-Apochromat 63x/1.20 Vatten / Corr objektivlins och Zeiss Immersol W nedsänkning vätska (med ett brytningsindex n = 1,334) användes. För 2 kanals konfokal avbildning, en RQFT 405/488/568/647 dikroisk spegel och BP525/50 (grön) och BP629/62 (röd) var utsläppen filter användes. Systemprogramvaran som användes var Zeiss AxioVision (ver. 4.8.2.0) med AV4 Multi-channel/Z/T, Fast Imaging fysiologi, MosaiX, Mark & ​​Hitta, Dual kamera, Inside 4D, autofokus och 3-D-moduler avfaltning.

  1. Säkerställa att CO 2 gas körs till CO 2 Modul av inkubations-systemet. Om mikroskopet stöds av en vibrationsdämpande luftbord, slå på lufttillförseln (eller N 2-gas) för luften tabellen.
  2. Slå på strömmen till mikroskopstativet, spinning disk enhet, kameror, inkubation moduler HXP belysningsanordning, motoriserat steg, Argonlaser och dator.
  3. Efter 1 min av uppvärmningstid, vrid tändningsnyckeln för Argon laser för att "På".
  4. På Zeiss lasern kontrollpanelen, slå på omkopplarna för laserlinjerna som skall användas.
  5. Växla vippströmbrytare för Lasos Argon laser kontroller från "standby" till "laser kör" och justera ljuset styrenheten till den optimala nivån (dvs. strax under den punkt där den gröna indikatorn blir röd).
  6. Starta AxioVision programvaran Obs:. Användargränssnittet för AxioVision kan anpassas med fönster och rullgardinsmenyer som är specifika för den aktuella mikroskop och komponenter som den styr. Som sådan har varje system en potentiellt unikt gränssnitt. Därför allmänna instruktioner för programvara manipulation som i efterföljande steg, snarare än riktningar för specifika program fönster, flikar och / eller pull-down menyer.
  7. Cirka 1 timme före avbildning, i programvaran, lokalisera kontrollerna för inkubatorn ochslår på värmen för den övre kammaren och scenen plattan. Ställ in temperaturen till 37 ° C. Slå på CO 2-styrning och sätta nivån på 5%.
  8. Välj objektivlins för avbildning. I denna studie har en 63x/1.20 NA C-Apochromat Vatten / Corr objektiv som används Anmärkning:. För denna lins är en nedsänkning medium med ett brytningsindex som liknar vatten (Zeiss Immersol W nedsänkning vätska) behövs.
  9. Om flera separata positioner som skall provas under en lång tid, vara säker på att tillämpa en tillräcklig mängd av nedsänkning mediet för att säkerställa att det sker från ett läge till ett annat.
  10. Placera skålen på scenen och få objektiv upp i kontakt med botten.
  11. Att använda antingen mikroskop kontroller eller programvaran, rikta det emitterade ljuset till okularen och välj lämplig Widefield filtret in för fluorescenssignalen av intresse (för denna studie, "Röd"-filter in för 53BP1 och en "GFP"-filter in för H2B ). </ Li>
  12. Se igenom okulära linser, fokusera bilden och leta upp en lämplig fält av celler.
  13. Antingen med programvara eller kontrollerna mikroskop, rikta det emitterade ljuset från okularen till hamnen med den konfokala roterande skiva enhet.
  14. I programmet, slå på lämplig laser (för denna studie 561 nm laser för 53BP1 och 488 nm linje Argon laser för H2B).
  15. För varje kanal, justera intensiteten av lasern genom att justera akustooptiskt avstämbart filter (AOTF) styrningen till en lämplig nivå.
  16. Välj lämplig dikroiska spegeln (RQFT 405/488/568/647) och filter utsläpp (BP 629/62 för 53BP1 och BP 525/50 för H2B). Öppna luckan till den roterande skivan enheten.
  17. Välj "Live" fönstret för att visa den aktuella synfältet.
  18. I programmet, öppna "Kamera" kontroll markerar att kameran kan användas (om en dubbel kamera system) och ställa exponeringstiden till cirka 100 ms. Justera% och EM få så nec. diga Obs! 53BP1-mCherry konstruktion verkar något dunkel. Vi fann det bra att öka EM förstärkningen.
  19. I programmet öppnar kontroll för konfokala roterande skiva enhet och justera den roterande skivan hastigheten genom att ange tiden kamerans exponering som var inställt på att ta en lämplig bild (t.ex. ~ 100 ms). Klicka "Set" för att låsa i förändringen.
  20. Öppna "flerdimensionella förvärv". Välj kanal fliken och ladda / välja lämpliga kanaler. För denna studie, vi använda kanaler definierade för dsRed (561 nm laser excitation och BP 629/62 filter för utsläpp) och GFP (488 nm laser linje för excitation och BP525/50 filter för emission).
  21. För att säkerställa bildregistrering, var en vanlig dikroisk spegel (RQFT 405/488/568/647) som används för båda kanalerna. Ställ programvara för att "Autofokus" Anmärkning:. Gå till Verktyg → Settings Editor för att justera MDA inställningarna. Se till att tillräcklig lasereffekt är inställd ("Adekvat lasereffekt" avser en inställning som gör att duatt excitera lämpliga fluoroforen samtidigt minimera fotoblekningsreaktion).
  22. I MDA-fönstret väljer z-stack flik. Välj "Z-stack vid aktuell position". Ange intervallet för ~ 10 um z-stack och välj "optimal" för antalet åtgärder för att säkerställa Nyquist provtagning genom Z. Obs: Den exakta storleken på z-stack beror på höjden av dina celler. Justera.
  23. 23. Klicka på "Start" och analysera det resulterande z-stack bilden för att se till att inställningarna är lämpliga för vad du undersöker (t.ex. i denna studie var det viktigt att bilden hela kärnan).
  24. Välj "T" (tid) på fliken. För vårt experiment med kamptotecin satte vi intervallet mellan imaging tidpunkter till 5 minuter och den totala längden av sessionen för 1 timme för en kontroll (icke-behandlade celler) video Anmärkning:. Minimera fotoblekningsreaktion av cellerna, experimentet bör konfigureras så att AOTF släcker laser mellan imaging tidpunkter.
  25. Feller flera punkter avbildning av flera celler i skålen, i MDA-fönstret väljer position fliken. Se till "Apply" inställningen före / efter tidpunkt "per position" är markerat. Välj "Mark_Find". Använda "Live" vy, flytta skålen runt och välja lämpliga synfält.
  26. Klicka på "Start" i flerdimensionella förvärv menyn för att starta experimentet och spela en kontroll videoklipp (av obehandlade celler).
  27. Efter kontroll videon lägger lämplig behandling (i detta fall, 10 M kamptotecin). Vi spelade in den experimentella (läkemedelsbehandlade celler) video med 5-10 minuters intervall under 2-4 timmar Anmärkning:. En viktig fråga att överväga är den hastighet med vilken en given effekt uppstår efter behandling. Som framgår i videon, 53BP1 foci börjar från ~ 5 minuter efter tillsats av CPT. Även en relativt enkel process, lägga läkemedel till skålen manuellt och åter kalibrera mikroskopet tar tid. Hänsyn måste tas till detta vid utformningen experiment.
  28. För övervakning mitosis, satte vi intervallet till 7,5 min och registrerades under 4-5 h (de specifika inställningar beror på den använda cellinjen och längden av dess cellcykeln). Justeringar kan behöva göras för att förhindra fotoblekningsreaktion under längre inspelningar.

C. Bildbehandling och analys

Detta protokoll har utvecklats med Volocity programvara (PerkinElmer). Den programvara som används för att förvärva dessa uppgifter (AxioVision) har också förmågan att bearbeta och analysera bilder. Användare uppmanas att använda programvaran till förfogande, och rådgöra med lämplig litteratur om deras tillämpning.

  1. Öppna Volocity programvara. Skapa och namnge ett nytt bibliotek och importera dina videofiler.
  2. För att visa filerna, finner vi oftast mest hjälp att använda "Utökad fokus" inställning. Detta överlagrar de z-stack skivor och för detta protokoll, tillåter oss att visualisera 53BP1 fokus i olika delar av kärnan.
  3. Justera video vid behov. Volocity är utrustad med en rad verktyg för att förbättra kvaliteten av förvärvade bilder. Genom att säkerställa inställningarna på mikroskopet var lämpligt kan mycket tid sparas i redigering senare. Ofta är det bra att deconvolve dina bilder och justera ljusstyrka / kontrast. Dina specifika redigering behov kommer att variera beroende på experimentet.
  4. Lägg till en relativ tidsstämpel och skala bar.
  5. Om du vill visa celler i 3-D, byt till "3-D opacitet" inställning. Detta tillåter rotation av de utförda 3-D-celler i rymden, vilket ger flera perspektiv av strukturer av intresse i cellerna Anmärkning:. Det är bra att visualisera celler i olika plan för att avgöra var strukturer av intresse resor. Till exempel, i "Utvidgad fokus" inställning är det svårt att urskilja att 53BP1 gör i själva verket, dissocierar från DNA under mitosen. Detta är dock uppenbart i 3-D.
  6. Filmer och stillbilder kan exporteras till en mängd olika filtyper baserade på användarens preferenser. i>

D. Representativa resultat

Ett exempel på 53BP1 foci-bildning som svar på CPT visas i figur 1. Celler exponerades för CPT formulär foci inom 5-10 minuter, och underhålla dessa härdar under hela inspelningen. Såsom visas i figur 2, 53BP1 dissocierar från kromatin vid uppkomsten av mitos och bildar en tunn dis runt kondenserande kromosomerna. Som telofas inträffar och mitos upphör, 53BP1 återigen aggregat i distinkta fokus. Medan HEK293-celler inte exponerades för CPT, bildade de ändå riklig, spontan 53BP1 reparation fokus genereras av endogent DNA-skada. Denna iakttagelse tillät oss att dra slutsatsen att 53BP1 inte utgör fokus i början av mitos, i linje med en tidigare rapport som visar en liknande effekt efter exponering av celler för joniserande strålning och radiomimetiska droger 5.

ure 1 "src =" / files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg "/>
Figur 1. Kamptotecin (10 iM) orsakar DSB och 53BP1 foci-bildning i cykling fibroblaster inom 30 minuter efter tillsats av läkemedlet till mediet.

Figur 2
Figur 2. 53BP1 inte utgör fokus under mitos fram telophase/G1 i HEK293-celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Underhåll av genomisk integritet är avgörande för cellens överlevnad. Underlåtenhet att bevara genomet resulterar i för tidigt åldrande, cancer eller död 8. Det är intensivt intresse för kräsna hur DDR funktioner, som härrör från dess betydelse för både grundforskning och klinisk forskning. Många tekniker har utvecklats under åren för att hjälpa till vid studiet av hur celler upptäcka och reparera DNA-skador. Traditionella metoder som immuncytokemi och Western blotting har varit hörnstenarna i fältet, men senaste framstegen inom teknik har gjort det möjligt allt mer sofistikerade metoder för att utvecklas. Levande cell imaging, som beskrivs i detta protokoll, tillåter oss att studera egenskaperna hos DDR förbises av mer traditionella metoder.

Centralt för användning av levande cell imaging är skapandet av fluorescensmärkta proteiner. Här beskriver vi användandet av en mCherry-märkt protein som är involverat i DDR, 53BP1, samt en histon H2B-GFP fusion produkt. Fluorescensmärkta proteiner används i stor utsträckning i molekylär-och cellbiologi, men de är inte utan sina begränsningar. Fästa en ny struktur för ett endogent protein skapar den uppenbara risken att ändra naturliga funktion. Dessutom kan vissa konstruktioner och kommer att uttryckas på olika nivåer i olika cellinjer, under olika förhållanden. Vi har observerat olika nivåer av fluorescerande intensitet i samtliga av de genetiskt manipulerade celler som används i denna studie. Den 53BP1 konstruera används i detta protokoll saknar mest funktionella domäner, men behåller förmågan att binda till ställen för DNA-skador som inte tycks påverka cellen 2.

Dessutom, är det viktigt att beakta metoden för genleverans. I detta protokoll har vi använt två metoder: Lentiviral transduktion och stabil transfektion. Våra lentivirus infekterade celler stabilt transducerade med det fluorescerande konstruktionen;Därför kommer de att fortsätta att uttrycka dessa proteiner på obestämd tid. Emellertid är denna metod något mer arbetsintensiv jämfört med transfektion och styrs av vilken typ av celler blir måltavla, vissa celler inte mottagliga för effektiv transfektion. Å andra sidan, lentivirus kan komma in flesta celler, inklusive mänskliga. Utredarna uppmuntras att väga för-och nackdelar för varje metod när det gäller deras egna experiment. Som ett möjligt sätt att kringgå problemen i fluorescensmärkta proteiner har användningen av cell-permeabla fluorescensmärkta prober nyligen rapporterats för levande celler experiment 10. Emellertid har denna teknik ännu inte fullt utvecklade.

En primär fördel med levande cell imaging är förmågan att studera Spatiotemporal relationer DDR och DSB reparation. I själva verket var Dimitrova et al. (2008) kunna observera fluorescensmärkta levande celler och avslöja roman iformation om 53BP1 bindning till telomerer och hur det påverkar kromatin dynamik. Denna analys skulle vara betydligt mer utmanande, men inte omöjligt, med andra metoder. Att ha förmågan att övervaka DDR både tid och rum ger oss möjlighet att urskilja funktioner och relationer som vi annars skulle förbise.

Sammanfattningsvis, med levande cell imaging ger forskarna att övervaka kinetiken för DSB-bildning och upplösning i realtid, och tillåter kvantitativ analys vid en enda cell nivå. Utöver den teknik som används i denna studie, kan andra tillämpningar av levande cell imaging kan användas, såsom FRET och FRAP 3. Tekniken för att observera celler i realtid kommer att fortsätta att förbättras och används för att studera en mängd olika cellulära processer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Stöds delvis av R01NS064593 och R21ES016636 (KV). Mikroskopi utfördes vid OAV - Institutionen för neurobiologi & anatomi Mikroskopi Facility, som stöds delvis med finansiering från NIH-NINDS Center kärna bidrag 5P30NS047463. Den roterande skiva konfokalmikroskop köptes med en NIH-NCRR utmärkelse (1S10RR027957).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CellStar culture dishes Greiner Bio-one
FluroDish glass bottom dishes World Precision Instruments, Inc.
MEM media GIBCO
Non-essential amino acids GIBCO
Amino acids GIBCO
Vitamins GIBCO
Sodium Pyruvate Invitrogen
Penicillin/Streptomycin HyClone
Fetal Bovine Serum GIBCO
N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro;
plasmid 19836
Addgene
pCLNR-H2BG; plasmid 17735 Addgene
SuperFect Qiagen
Zeiss Cell Observer SD Imaging system Zeiss
AxioVision (release 4.8.2) Zeiss
Zeiss Immersol W Oil Zeiss
Volocity software (version 6.0) PerkinElmer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair. Cell. 127, 1361-1373 (2006).
  2. Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
  3. Feuerhahn, S., Egly, J. M. Tools to study DNA repair: what's in the box. Trends Genet. 24, 467-474 (2008).
  4. Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis. J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).
  5. Giunta, S., Jackson, S. P. Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events. Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).
  6. Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells. Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).
  7. Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks. Nature. 432, 406-411 (2004).
  8. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461, 1071-1078 (2009).
  9. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).
  10. Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes. PLoS One. 5, e10459 (2010).
  11. Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks. DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).
  12. Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).
  13. Valerie, K., Povirk, L. F. Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair. Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).
  14. Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. 53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint. Science. 298, 1435-1438 (2002).
  15. Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX. J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).

Comments

2 Comments

  1. Hi

    I think there is a mistake in the protocol. it should be the plasmid http://www.addgene.org/19835/ mCherry-BP1-2 pLPC-Puro from Titia De Lange lab, isn't it?
    the 19836 is N-Myc tagged and not mCherry.


    Reply
    Posted by: Valentine C.
    June 29, 2015 - 11:11 AM
  2. Ah, yes, you are correct. I apologize for missing that.

    Reply
    Posted by: Jason B.
    August 15, 2015 - 2:35 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics