عزل تدفق Cytometric من نوع خلايا الفئران الابتدائية السنخية II طلائي للدراسات الوظيفية والجزيئية

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

وصفنا عزل الخلايا الأولية السريع للنوع الثاني الفئران السنخية الظهارية (وادي) عن طريق الانتقاء السلبي تدفق cytometric. هذه تظهر قابلية عالية وادي والنقاء ومناسبة لمجموعة واسعة من الدراسات الفنية والجزيئية بشأن دورها في أمراض الجهاز التنفسي مثل أمراض المناعة الذاتية أو المعدية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gereke, M., Autengruber, A., Gröbe, L., Jeron, A., Bruder, D., Stegemann-Koniszewski, S. Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies. J. Vis. Exp. (70), e4322, doi:10.3791/4322 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

على مر السنين الماضية، مساهمة الخلايا السنخية نوع II الظهارية (وادي) لمختلف جوانب تنظيم المناعة في الرئة باعتراف متزايد. وقد ثبت للمشاركة في وادي إنتاج السيتوكينات في القصبات الهوائية الملتهبة والعمل حتى مع مستضد تقديم الخلايا في كل من العدوى والمناعة الذاتية خلايا T بوساطة 1-8. ولذلك، فهي مثيرة للاهتمام لا سيما أيضا في سياقات السريرية مثل التفاعل المفرط لمجرى الهواء والأجنبية المستضدات الذاتية وكذلك الإصابات التي تستهدف مباشرة أو غير مباشرة وادي. ومع ذلك، فإن فهمنا لوظائف المناعية مفصلة خدم وفقا لنوع الخلايا السنخية II الظهارية في رئة سليمة وكذلك في التهاب يبقى مجزأ. يتم تنفيذ العديد من الدراسات المتعلقة باستخدام الماوس وادي ظيفة أو السنخية الإنسان خطوط الخلايا الظهارية 9-12. العمل مع خطوط الخلايا يوفر بالتأكيد مجموعة من المزايا، مثل توافر أعداد كبيرة سو خلايا لتحاليل واسعة النطاق. ومع ذلك، فإننا نعتقد أن استخدام الفئران وادي الابتدائية يسمح فهم أفضل لدور هذه نوع من الخلايا في العمليات المعقدة مثل العدوى أو التهاب المناعة الذاتية. يمكن عزل وادي الفئران الأولية مباشرة من الحيوانات تعاني من أمراض الجهاز التنفسي مثل هذه، وهذا يعني أنها كانت تخضع لعوامل خارجي إضافية عن لعب دور في الإعداد تحليلها. وعلى سبيل المثال، يمكن عزل وادي قابلة للحياة من الفئران المصابة بفيروس A الأنف الأنفلونزا، الذي يستهدف في المقام الأول هذه الخلايا للنسخ المتماثل 13. الأهم من ذلك، من خلال عدوى فيفو السابقين من وادي معزولة عن الفئران السليمة، ويمكن للدراسات التي شنت على الاستجابات الخلوية العدوى مزيد الموسعة.

ويستند لدينا بروتوكول لعزل وادي الفئران في المقام الأول على الهضم الأنزيمي في الرئة الماوس تليها وصفها لتعليق الخلية الناتج مع الاجسام المضادة المحددة لCD11c، CD11b، F4/80،CD19، CD45 وCD16/CD32. ثم يتم تحديد وادي حبيبي ومبعثر وغير المسماة sideward عالية (SSC عالية) السكان الخلية والخلية تكون مفصولة المنشط مضان الفرز 3.

بالمقارنة مع طرق بديلة لعزل الخلايا الظهارية الأولية من الرئتين الماوس، لدينا لعزل بروتوكول تدفق cytometric من وادي ينتج عن طريق الانتقاء السلبي لم يمسها، وادي قابلة للحياة عالية ونقية في وقت قصير نسبيا. بالإضافة إلى ذلك، وعلى النقيض من الاساليب التقليدية في العزلة من قبل بالغسل واستنزاف الخلايا الليمفاوية عن طريق ربط الأجسام المضادة من جانب الخرز المغناطيسي 14 و 15، وتدفق الخلايا cytometric الفرز يسمح التمييز عن طريق حجم الخلية ومستوى. بالنظر إلى أن الأجهزة للفرز تدفق خلية cytometric متاح، يمكن تطبيق الإجراءات الموصوفة بتكاليف منخفضة نسبيا. بجوار الأجسام المضادة والأنزيمات القياسية للتفكك الرئة، لا الكواشف إضافية مثل المغناطيسيةويلزم الخرز. الخلايا المعزولة هي مناسبة لمجموعة واسعة من الدراسات الفنية والجزيئية، والتي تشمل المختبر في الثقافة والمقايسات تحفيز خلايا T وكذلك transcriptome، بروتيوم أو تحليلات secretome 3 و 4.

Protocol

وترد التفاصيل المتعلقة الكواشف والمواد المطلوبة في الجدول في نهاية البروتوكول أدناه. قبل البدء في العمل، وإعداد أنابيب مل 15 (واحد في الماوس) تحتوي على 4 مل من dispase وقبل الدافئ لهم إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. في كتلة التدفئة، تدفئة قريبا مأخوذة صغيرة من 1٪ منخفضة تذوب الاغاروز (في الماء) إلى 95 ° C حتى المسال وبارد في وقت لاحق إلى C ° 45 حتى الاستخدام.

1. إعداد الرئة ماوس

  1. التضحية الماوس خنقا 2 CO. ملاحظة: لا تنفيذ خلع عنق الرحم حيث سيؤدي ذلك إلى إصابة القصبة الهوائية بحيث بعد خطوات من البروتوكول، مثل تركيب الرئة مع السائل، لا يمكن أن يؤديها بنجاح. ضمان فقدان ردود الفعل nociceptive.
  2. رش الفأر مع الايثانول وجعل قطع طويلة على طول خط الوسط بطني من الجسم. سحب الفراء والجلد البطني وبالتالي أيضا خفض بعناية وإزالة الغشاء البريتوني.
  3. ويستنزفالماوس عن طريق قطع الوريد الوداجي الأيمن والأيسر (الوريد الوداجي) وكذلك الشريان الكلوي (الشريان الكلوي). إزالة الأنسجة مع تدفق الدم.
  4. ثقب بعناية ثم قم بإزالة الحجاب الحاجز لفضح القلب والرئة عن طريق خفض بعيدا الأضلاع. عناية خاصة حتى لا أصيب في الرئة.
  5. مع قنية 26G وحقنة 10 مل مليئة الفوسفات مخزنة المالحة الباردة (PBS)، ثقب البطين الأيمن من القلب والرئة يروي مع PBS حتى خالية من الدم.
  6. قص وإزالة الغدد اللعابية لفضح القصبة الهوائية. كما قطعت بعناية العضلات المحيطة القصبة الهوائية.
  7. إدراج قنية الساكن 22G إلى القصبة الهوائية، وإزالة الإبرة ودفع القسطرة البلاستيكية نحو الرئة. إصلاح القسطرة عن طريق ربط قطعة صغيرة من خيوط حول القصبة الهوائية والقسطرة.

2. الأنزيمية الهضم في أنسجة الرئة

إذا رغبت، يمكن لعينة السائل غسل القصبات تكونالتي أعدتها بيغ الرئتين عن طريق القسطرة إدراجها في القصبة الهوائية مع PBS أو المتوسطة قبل الخطوة التالية.

  1. باستخدام حقنة مل 2، وبلغ حجم التداول بعناية غرس القصوى من 2 مل من dispase (من قسامة مل 4) في الرئة عن طريق القسطرة بحيث يتم توسيع بالكامل جميع الفصوص. تبادل المحاقن مع حقنة 1 مل تحتوي على 0.5 مل من الاغاروز المسال وغرس أيضا في الرئة.
  2. ترك الحقنة على القسطرة لمنع عودة التدفق من الاغاروز وتغطية مباشرة في الرئة مع المناديل الورقية المختبر والجليد. السماح للهلام الاغاروز لبضع دقائق.
  3. إزالة الأنسجة الورق، والجليد، وحقنة القسطرة، وقطع القصبة الهوائية والرئة استئصال والقلب والغدة الصعترية من الصدر. ثم شطف الرئة في طبق مع PBS وإزالة القلب والغدة الصعترية والقصبة الهوائية المتبقية.
  4. وضع الرئة في 2 مل المتبقية من dispase واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.

3. إعداد الرئةالخلية تعليق

  1. إزالة الرئة من dispase وتحويلها إلى الطبق يحتوي على 7 مل من anti-CD16/32 الأجسام المضادة (1 ميكروغرام / مل تركيز النهائي) في DMEM المتوسطة و 100 ميكرولتر الدناز.
  2. باستخدام ملقط، تتفكك تماما أنسجة الرئة عن طريق سحب إربا واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في حين تعصف بلطف على تعيين الروك إلى 200 دورة في الدقيقة. إذا رغبت، يمكن عندئذ وقف الخلية يتم تخزينها في C ° 4 حتى الخطوة التالية.
  3. تصفية التعليق الخلية من خلال تنسجم النايلون الأول مع 100 ميكرون وميكرون مع في وقت لاحق 70، 48 و 30 ميكرومتر ميكرومتر المسام. الحرص على شطف كل شبكة، فضلا عن أنابيب وأطباق تماما مع DMEM لتقليل الخسائر في الخلايا وزيادة العائد. إذا كنت تجميع عينات، لا يمكن تحقيق هذا عن طريق تمرير هنا في وقت لاحق من الفئران خلايا تعليق من مجموعة واحدة من خلال تصفية نفسه. تجديد التصفية في حالة انسداد.
  4. اعتمادا على حجم، نقل الترشيح على واحد أو أكثر أنابيب مل 50 وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 160 XG ° C. و 4 إزالة طاف.
  5. إعادة تعليق بيليه الخلية في 2 مل العازلة تحلل كرات الدم الحمراء (0.15 M NH 4 الكلورين، 0.01 M KHCO 0.1 مم EDTA، ودرجة الحموضة 7.2) وإنهاء تحلل بسرعة بإضافة من 13 مل من DMEM المتوسطة. الحل لنقل أنبوب 15 مل والطرد المركزي لمدة 12 دقيقة في 160 XG ° C. و 4

4. تلوين الأجسام المضادة للCytometric تدفق سيل الفرز

  1. إعادة تعليق الخلايا في 3 مل كوكتيل الأجسام المضادة الأولية، أعدت في DMEM المتوسطة في التخفيفات مناسبة لقياس التدفق الخلوي. (ومعاير من قبل الأجسام المضادة لعمل التخفيفات الأمثل من تلطيخ 1 × 10 6 splenocytes في مجلد من 100 ميكرولتر. استخدام 3 مل من مزيج الأجسام المضادة الأولية التي تحتوي على تركيزات الأمثل لكل من الأجسام المضادة المستخدمة للخلايا المجمعة من ما يصل الى خمسة الفئران. إذا يتم تجميع أكثر الفئران لعينة واحدة، ضبط مستوى الصوت).
  2. لتلطيخ، احتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة في الظلامعند 4 ° C.
  3. غسل الخلايا عن طريق ملء أنبوب 15 مل مع DMEM المتوسطة والطرد المركزي لمدة 12 دقيقة في 160 XG و 4 ° C.
  4. في حال كانت تستخدم الأجسام المضادة فكت أو المعقدة البيروكسيديز في 4.1: إزالة طاف و resuspend الخلايا في 2 - 3 مل كوكتيل الأجسام المضادة الثانوية. وصمة عار لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في الظلام.
  5. غسل الخلايا من خلال ملء الأنبوب مع DMEM والطرد المركزي لمدة 12 دقيقة في 160 XG ° C. و 4
  6. إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من DMEM وقبل فلتر من خلال تصفية 50 ميكرومتر في أنبوب للفرز الخلايا. اختياري: عد الخلايا للحصول على عدد الخلايا الكلي في الرئة تعليق الخلية.

5. الخلية الفرز

  1. خلط الخلايا عن طريق vortexing قبل الفرز. استخدام فوهة ميكرومتر 100 لفرز الخلايا من وادي. غمد ضغط السائل وكذلك الليزر وموجات الانبعاثات الاكتشاف تعتمد على الأداة المستخدمة لcytometric تدفق الفرز الخلية وكذلك fluorochromes المستخدمة في antibody تلطيخ الداخلي.
  2. بوابة على الخلايا التي هي عالية SSC سلبية على fluorochromes تستخدم لتلوين ونوع في أنبوب يحتوي على DMEM. استخدام قدما ارتفاع مبعثر (FSC-H) مقابل منطقة (FSC-A) وارتفاع sideward مبعثر (SSC-H) مقابل منطقة (SSC-A) ويندوز لاستبعاد أي الحلل أو المجاميع الخلية (انظر تفاصيل الاستراتيجية النابضة في الشكل 1 أ).
  3. من أجل جمع أجهزة الطرد المركزي الخلايا مصنفة لمدة 20 دقيقة في 280 XG و 4 ° C.
  4. إعادة تعليق الخلايا في الثقافة المتوسطة أو المخزن المؤقت على النحو المطلوب للتحليل لاحقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

عندما يكون الترتيب تعليق خلية الرئة معزولة عن الفئران السليمة، وبوابة وادي تمثل عادة لحوالي 42 ± 10٪ من كافة الأحداث. وهذا يمكن أن يكون أقل بشكل ملحوظ نسبة عند استخدام الفئران مع أمراض الجهاز التنفسي مثل التهاب فيروسي، ووقف الخلية الأولي سوف تحتوي على نسبة أعلى بكثير من الخلايا الليمفاوية والخلايا المناعية الأخرى لتجنيد الشعب الهوائية. لوادي معزولة عن الرئتين IAV المصابة في اليوم 3 بعد الإصابة لاحظنا انخفاض وتيرة الخلايا في وادي بوابة بنحو 50٪.

ويصور نوع A النموذجية فضلا عن إعادة تحليل الخلايا فرزها في الشكلين 1 ب و ج 1. كما هو مبين، ونقاء من الخلايا المعزولة يمثل تقريبا 92 ± 5٪. في الشكل 2A، وتبين لنا يمكن تأكيد أن الانفصال الناجح للسكان الخلية نقية من تلطيخ لبالسطح-C البروتينات، وهو ما يعبر عنه حصرياوادي 16 و 17.

وقد لاحظنا أن عدد معزولة في وادي حيوان واحد يعتمد بقوة على سلالة الماوس المستخدمة. في حين BALB / ج الفئران تسفر عادة 1 × 10 6 وادي / الماوس، سلالة C57BL / 6 غلة فقط 1 حتي 3 X 10 5 وادي / الماوس. عدد من الفئران المستخدمة في التجربة يعتمد ذلك على سلالة الفأر فضلا عن نوع من التحليلات اللاحقة التي يتعين القيام بها.

بشأن الجدوى من وادي استرجاع، نجد عادة معدلات بقاء حوالي 90٪ بعد فرز cytometric تدفق الخلايا. هذه نسبة عالية من خلايا قابلة للحياة وظيفية ثم يسمح تحليلات مباشرة وكذلك على المدى القصير ثقافة معزولة وادي الفئران الأولية.

الشكل 1
الشكل 1. نظرة عامة على سالنسخة الاستراتيجية المستخدمة لعزل النابضة تدفق cytometric من وادي الفئران عن طريق الانتقاء الأولية سلبية. (A) نظرة عامة على استراتيجية تخطيطي النابضة. (B) قطع ممثل تعليق نوع الرئة ذي الخلية. (C) نتيجة الممثل لتحليل إعادة الخلايا فرزها. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 2
الشكل 2. توصيف وتحليل الجزيئي للوادي مصنفة الفئران الأولية. (A) كانت ملطخة Cytospins من وادي مصنفة لبالسطح C بروتين (SPC). مقارنة المجهر النقيض من المرحلة، تم العثور على ما يقرب من 100٪ من الخلايا لتكون SPC إيجابية. (B) الملف RNA ممثل وادي مصنفة الفئران الأولية بعد RNA والعزل. قمم محددة ل18S 28S RNA الريباسي وجنبا إلى جنب مع عامل RIN محسوبة تمثل الحمض النووي الريبي ط ntegrity والجودة لRNA معزولة سليمة من وادي.

الشكل 3
الشكل 3. مخزنة تحليل الأنفلونزا الناجمة عن الفيروس البروتين النووي (NP) في وادي التعبير الفئران المعزولة من الفئران الأولية المصابة. C57BL / كانت تدار الأنف 6 الفئران الفوسفات المالحة أو الأنفلونزا الناجمة عن الفيروس PR8/A/34 في أيام 1 أو 2 أو 3 قبل وادي العزلة . (A) قطع ممثل تعليق خلية الرئة من غير مصاب، فضلا عن ثلاثة ايام الماوس C57BL / 6 المصابة الملون للفرز. (B) تم تحليل الأنفلونزا A التعبير NP الفيروس في وادي مصنفة من خلال تلطيخ الخلايا مع أجسام مضادة محددة وNP-اللاحقة تحليل تدفق cytometric. (C) ويبين الجدول كثافة مضان يعني (MFI) من تلطيخ NP.

S "> الشكل 4
الشكل 4. تحليل إنفلونزا A فيروس البروتين النووي (NP) في الجسم الحي التعبير السابقين إصابة الفئران وادي الأولية. (A) الممثل تدفق cytometric تحليل خارج الجسم فيروس الأنفلونزا PR8/A/34 وادي المصابين تلطيخ الخلايا لفيروس الانفلونزا NP 6 ساعة بعد العدوى. (B) ملخص النتائج ممثل عن تلطيخ-NP السابقين فيفو الأنفلونزا الناجمة عن الفيروس المصابين وادي آخر H 6 عدوى الفيروس مع التخفيفات مختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بروتوكول لدينا لعزل وادي الفئران بواسطة التدفق الخلوي يوفر وسيلة سريعة للوصول الخلايا الأولية من الرئة الماوس لمجموعة كاملة من الدراسات الفنية والجزيئية. وصف الإجراء ينتج السكان للغاية وقابلة للحياة نقية من وادي التي هي كافية في عدد لاحق لتحاليل مباشرة، مثل العزلة RNA (انظر الشكل 2B) والدراسات transcriptome. للتطبيقات وظيفية، فمن الممكن أيضا أن الخلايا المعزولة الثقافة، مما يسمح على سبيل المثال توليد المتوسطة وادي مكيفة أو شارك في التجارب الثقافة. بوصفه استحقاقا خاصة لهذه الدراسات الفنية، وعزل الخلايا الأولية عن طريق الانتقاء السلبي كما هو موضح هنا ينتج الخلايا التي لم يمسها خضعت لروابط الأجسام المضادة. ومع ذلك، على الرغم من المزايا من الدراسات في وادي الأولية على تلك التي تؤدى في خطوط خلايا، وهناك قيود عملية لاستخدام هذه الخلايا الأولية. إلى جانب الحد من مجرد أرقام في، والتي قد لا تفي بمتطلبات الفحص تتطلب دراسات واسعة النطاق، وادي الابتدائي البقاء على قيد الحياة في الثقافة فقط لفترة محدودة الذي لاحظناه في المتوسط ​​حوالي 48 ساعة. في هذه التجارب الثقافة على المدى القصير، ونستند اختيار ثقافة المتوسط ​​على طبيعة المقايسات لاحقة تم استخدام المتوسط ​​وادي مكيفة في وحققت نتائج مرضية مع IMDM (IMDM Glutamax، Gibco القط. رقم 31980) تستكمل مع 10٪ FCS والمضادات الحيوية القياسية وβ-0.25 ملم المركابتويثانول.

بروتوكول الموصوفة هنا يعرض طريقة سهلة وسريعة نسبيا لعزل قابلة للحياة ونقية وادي الفئران الأولية بأعداد جيدة. نقاء الخلايا التي تنتج بعد انفصال يعتمد بشكل حاسم على إجراءات الفرز الخلية. A تلطيخ واضحة وقوية للسكان الخلية التي سيتم استبعادها لا يقل أهمية عن النابضة صارمة على الأحداث SSC عالية، بحيث التلوث مع الخلايا اللمفاوية كنوع جيدايتم تصغير I الخلايا الظهارية. فيما يتعلق العائد من الخلايا فصل، لاحظنا أن يتم تكبير هذا عن طريق تنظيف واسعة من الأنابيب، لوحات تنسجم تصفية وخلال إعداد تعليق خلية الخام فضلا عن تفكك كامل للأنسجة بعد الهضم الأنزيمي. واحد الميزة الرئيسية للعمل مع وادي الأساسي هو أن يمكن عزلها مباشرة من المضيفين الذين يعانون من أمراض الجهاز التنفسي. وسيكون قد تم وادي عرضة لمثل هذه العوامل موجودة في كل بيئة الطبيعية الصغيرة، وبالتالي تعكس الوضع جيدا في الجسم الحي. خلافا لوادي البشرية 18 و 19، يمكن تمديد هذه لمجموعة واسعة من النظم التجريبية عند العمل في نماذج الفئران. لقد تم الاستفادة من هذه الدراسات في المناعة الذاتية التهاب بشأن وكذلك العدوى الفيروسية في الرئة. وجدت أن وادي بالتالي نحن من الفئران التي تعاني من CD4 + T الخلية بوساطة التهاب الجهاز التنفسي التعبير عن مجموعة واسعة من inflammatORY الجينات والذي يدل على قدرتها على تنظيم الاستجابات المناعية الرئة 3. وعلاوة على ذلك، فإننا لا يمكن أن تظهر شاشة وادي الذاتي مستضدات التوافق النسيجي من خلال جزيئات معقدة فئة-II الرئيسية مما يؤدي إلى تفعيل الفنية للCD4 + الخلايا السيارات رد الفعل T. في نفس الوقت الحفاظ على وادي التسامح الرئة بسبب عوامل تعزيز إفراز تحريض الخلايا التنظيمية Foxp3 + T 4.

فيما يتعلق عدوى فيروسية في الرئة، وقد نجحنا في عزل وادي الأولية من الفئران المصابة بفيروس أنفلونزا A. كما ذكر أعلاه، لحساب وادي هنا أصغر نسبة من التعليق الرئة ذي الخلية بأكملها، كما يتم تجنيد أعداد كبيرة من الخلايا المناعية إلى الرئتين استجابة للعدوى (انظر الشكل 3A). تلطيخ الخلايا من إنفلونزا A فيروس البروتين النووي (NP) داخل خلايا معزولة يظهر التعبير زيادة من البروتين الفيروسي على مدار الساعة كما هو مبين في ز> أرقام 3B و 3C. هذه وادي، الناجمة عن الفيروس في الجسم الحي، وعرض أداة قيمة للدراسات فيما يتعلق النمط الظاهري الجزيئية والوظيفية للظهارة الهوائية خلال العدوى الفيروسية في الجهاز التنفسي وكذلك خلال الانتعاش. لكن، وكما هي وادي الهدف الرئيسي من فيروس الأنفلونزا A، وهناك دمار كبير من بطانة الظهارية، فإن معدل الخلايا المصابة من الفئران أسفرت عن انخفاض على مدى ومع شدة الإصابة. أيضا، ذلك أن الفيروس يعيد مرارا وتكرارا ويصيب خلايا جديدة، ومعزولة وادي لم تخضع للإصابة في نقطة واحدة محددة في الوقت المناسب. ومن ثم لا يمكن، وتستكمل هذه الدراسات من الناحية المثالية التجارب المجراة باستخدام السابقين إصابة الفئران وادي الأولية من الفئران صحية حيث تتم مزامنة أفضل العدوى والتي، وفقا لتقييم الخلايا تلطيخ NP الفيروسي هو مبين في الأرقام 4A و 4B، تسفر عن ارتفاع معدلات الإصابة اعتمادا على جرعة الفيروسية المستخدمة.

jove_content "> وصف تدفق اختيار السلبية cytometric كما أخذت معا، وهنا يعرض وسيلة سريعة لعزل نقية وقابلة للحياة وادي الفئران الأولية. هذه الخلايا هي مناسبة لمجموعة واسعة من التحليلات وهي أداة قيمة لتوسيع معرفتنا لدور وادي في التنظيم المناعي في الجهاز التنفسي في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نود أن نشكر M. Höxter للمساعدة التقنية في وادي الفرز الأولية من عينات الفئران السلامة الأحيائية المستوى 2.

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة البحوث الألمانية (DFG) لDB (SFB587، B12 TP وBR2221/1-1) وراتبا من البحوث الطبية الحيوية هانوفر مدرسة (DFG GSC 108) إلى AA. ويدعم DB من مبادرة الرئيس الخاصة وصندوق شبكة من مؤسسة هيلمهولتس لمراكز الأبحاث الألمانية (HGF) تحت W2/W3-029 عدد العقد.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
indwelling cannula Introcan 22G Braun REF 4252098B
Dispase, 100 ml(5000 caseinolytic units) BD Biosciences 354235 aliquot to 4 ml in 15 ml tubes, store at -20 °C
Biozym Plaque Agarose Biozym 840101 1% w/v in H2O
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, 2000 Kunitz units/vial Sigma-Aldrich D4263 freshly dissolve content of 1 vial in 300 μl DMEM
DMEM Gibco 22320-022 used as provided by manufacturer (Low Glucose, Pyruvate, HEPES)
cell strainers (100 μm, 75 μm) BD Falcon 352360, 352350
nylon mesh(48 μm, 30 μm) Bückmann GmbH 03-48/26-1020, 03-30/18-108
CellTrics 50 μm filter PARTEC 04-0042-2317
anti-mouse CD16/CD32 BioLegend 101302 clone 93; purified
anti-mouse F4/80 BioLegend 123116 clone BM8; APC coupled
anti-mouse CD11b BioLegend 101208 clone M1/70; PE coupled
anti-mouse CD11c BioLegend 117310 clone N418; APC coupled
anti-mouse CD45 BioLegend 103102 clone 30-F11; purified
anti-mouse CD19 eBioscience 12-0193-83 eBio 1D3; PE coupled
polyclonal goat anti-rat IgG BD Pharmingen 550767 polyclonal, PE coupled

Antibodies coupled to alternative fluorochromes can be used, depending on the flow cytometer and lasers available.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited. Respir. Res. 2, 33-46 (2001).
  2. Folkerts, G., Nijkamp, F. P. Airway epithelium: more than just a barrier. Trends Pharmacol. Sci. 19, 334-341 (1998).
  3. Gereke, M., et al. Phenotypic alterations in type II alveolar epithelial cells in CD4+ T cell mediated lung inflammation. Respir. Res. 8, 47 (2007).
  4. Gereke, M., Jung, S., Buer, J., Bruder, D. Alveolar type II epithelial cells present antigen to CD4(+) T cells and induce Foxp3(+) regulatory T cells. Am. J. Respir. Crit Care Med. 179, 344-355 (2009).
  5. Gribar, S. C., Richardson, W. M., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. No longer an innocent bystander: epithelial toll-like receptor signaling in the development of mucosal inflammation. Mol. Med. 14, 645-659 (2008).
  6. Herold, S., et al. Alveolar epithelial cells direct monocyte transepithelial migration upon influenza virus infection: impact of chemokines and adhesion molecules. J. Immunol. 177, 1817-1824 (2006).
  7. Knight, D. A., Holgate, S. T. The airway epithelium: structural and functional properties in health and disease. Respirology. 8, 432-446 (2003).
  8. Schmiedl, A., Kerber-Momot, T., Munder, A., Pabst, R., Tschernig, T. Bacterial distribution in lung parenchyma early after pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa. Cell Tissue Res. 342, 67-73 (2010).
  9. Loveday, E. K., Svinti, V., Diederich, S., Pasick, J., Jean, F. Temporal- and Strain-Specific Host MicroRNA Molecular Signatures Associated with Swine-Origin H1N1 and Avian-Origin H7N7 Influenza A Virus Infection. J. Virol. 86, 6109-6122 (2012).
  10. Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infect. Immun. 80, 1140-1149 (2012).
  11. Mata, M., Morcillo, E., Gimeno, C., Cortijo, J. N-acetyl-L-cysteine (NAC) inhibit mucin synthesis and pro-inflammatory mediators in alveolar type II epithelial cells infected with influenza virus A and B and with respiratory syncytial virus (RSV). Biochem. Pharmacol. 82, 548-555 (2011).
  12. Zarbock, R., et al. The surfactant protein C mutation A116D alters cellular processing, stress tolerance, surfactant lipid composition, and immune cell activation. BMC. Pulm. Med. 12, 15 (2012).
  13. Taubenberger, J. K., Morens, D. M. The pathology of influenza virus infections. Annu. Rev. Pathol. 3, 499-522 (2008).
  14. Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar type II cells. Am. J. Physiol. 258, L134-L147 (1990).
  15. Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 309-315 (1996).
  16. Beers, M. F., Kim, C. Y., Dodia, C., Fisher, A. B. Localization, synthesis, and processing of surfactant protein SP-C in rat lung analyzed by epitope-specific antipeptide antibodies. J. Biol. Chem. 269, 20318-20328 (1994).
  17. Phelps, D. S., Floros, J. Localization of pulmonary surfactant proteins using immunohistochemistry and tissue in situ hybridization. Exp. Lung Res. 17, 985-995 (1991).
  18. Wang, J., et al. Differentiated human alveolar type II cells secrete antiviral IL-29 (IFN-lambda 1) in response to influenza A infection. J. Immunol. 182, 1296-1304 (2009).
  19. Wang, J., et al. Innate immune response to influenza A virus in differentiated human alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 582-591 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics