प्रवाह कार्यात्मक और आण्विक अध्ययन के लिए प्राथमिक murine प्रकार द्वितीय वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं के cytometric अलगाव

Immunology and Infection

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Summary

हम प्रवाह cytometric नकारात्मक चयन द्वारा प्राथमिक murine प्रकार द्वितीय वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं (AECII) के तेजी से अलगाव का वर्णन करता है. इन AECII उच्च व्यवहार्यता और शुद्धता दिखाने के लिए और कार्यात्मक और आणविक autoimmune या संक्रामक रोगों के रूप में सांस की परिस्थितियों में उनकी भूमिका के बारे में अध्ययन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त हैं.

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Gereke, M., Autengruber, A., Gröbe, L., Jeron, A., Bruder, D., Stegemann-Koniszewski, S. Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies. J. Vis. Exp. (70), e4322, doi:10.3791/4322 (2012).

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Abstract

Protocol

नीचे प्रोटोकॉल के अंत में आवश्यक अभिकर्मकों और सामग्री के बारे में विवरण तालिका में सूचीबद्ध हैं. काम शुरू करने से पहले, 15 मिलीलीटर ट्यूब (प्रति एक माउस) dispase के 4 मिलीग्राम और पूर्व गर्म उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस एक पानी में स्नान युक्त तैयार करते हैं. एक हीटिंग ब्लॉक में शीघ्र ही 95 के लिए 1% कम पिघल agarose (पानी में) के छोटे aliquots गर्मी ° C तरलीकृत जब तक और बाद में जब तक उपयोग के 45 डिग्री सेल्सियस के लिए शांत है.

1. माउस फेफड़े की तैयारी

  1. सीओ 2 asphyxiation माउस बलिदान. नोट: प्रदर्शन के रूप में इस ट्रेकिआ चोट पहुंचाना इतना है कि प्रोटोकॉल के इस कदम के बाद, तरल के साथ फेफड़ों की स्थापना के रूप में नहीं किया जा सकता सफलतापूर्वक गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था नहीं है. Nociceptive सजगता की हानि सुनिश्चित करें.
  2. इथेनॉल के साथ माउस स्प्रे और शरीर के उदर midline के साथ एक लंबी कटौती. उदर फर और त्वचा खींचो और बाद में यह भी ध्यान में कटौती और peritoneum हटा.
  3. रक्तहीन करनाबाएँ और दाएँ कंठ का (रग jugularis) नस काटने के रूप में के रूप में अच्छी तरह से गुर्दे धमनी (श्वासनली renalis) द्वारा माउस. ऊतक के साथ खून बह निकालें.
  4. ध्यान से पंचर और फिर दूर पसलियों में कटौती करके दिल और फेफड़ों का पर्दाफाश डायाफ्राम हटा दें. विशेष ध्यान रखना फेफड़ों घायल नहीं.
  5. एक 26G प्रवेशनी और एक 10 मिलीलीटर सिरिंज ठंड फॉस्फेट से भरा खारा (पीबीएस), दिल की सही वेंट्रिकल पंचर buffered और रक्त के मुक्त जब तक पीबीएस के साथ फेफड़ों छिड़कना.
  6. कट और लार के लिए ट्रेकिआ बेनकाब ग्रंथियों निकालें. भी ध्यान ट्रेकिआ आसपास के मांसपेशियों में कटौती.
  7. ट्रेकिआ में एक 22G निबाह प्रवेशनी डालें, सुई को हटाने और फेफड़ों की ओर प्लास्टिक कैथेटर धक्का. यार्न के ट्रेकिआ और कैथिटर के चारों ओर एक छोटा सा टुकड़ा बांधने कैथेटर फिक्स.

2. फेफड़े के ऊतकों के enzymatic पाचन

अगर वांछित, एक ब्रोन्कोएल्वियोलर lavage द्रव का नमूना हो सकता हैपीबीएस या माध्यम से ट्रेकिआ में अगले कदम से पहले डाला कैथेटर के माध्यम से फेफड़ों निस्तब्धता द्वारा तैयार की है.

  1. एक 2 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग, ध्यान से फेफड़ों में कैथेटर के माध्यम से के 2 मिलीलीटर dispase (4 मिलीलीटर अशेष भाजक से) की एक अधिकतम मात्रा इतनी टपकाना कि सभी lobes पूरी तरह से विस्तार कर रहे हैं. 1 मिलीलीटर सिरिंज तरलीकृत agarose 0.5 मिलीलीटर युक्त साथ सिरिंज का आदान - प्रदान और भी फेफड़ों में टपकाना.
  2. Agarose के पीछे के प्रवाह को रोकने के लिए और तुरंत प्रयोगशाला टिशू पेपर और बर्फ के साथ फेफड़ों को कवर कैथेटर पर सिरिंज छोड़ो. मिनट की एक जोड़ी के लिए agarose जेल चलो.
  3. टिशू पेपर, बर्फ, सिरिंज, और कैथेटर निकालें, ट्रेकिआ और आबकारी दिल, फेफड़ों और सीने से thymus में कटौती. फिर पीबीएस के साथ एक डिश में फेफड़ों कुल्ला और दिल thymus, और शेष ट्रेकिआ हटा.
  4. फेफड़ों dispase के शेष 2 मिलीलीटर में रखो और 45 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.

3. फेफड़े की तैयारीसेल सस्पेंशन

  1. फेफड़ों dispase से निकालें और यह एक DMEM मध्यम और 100 μl DNase में anti-CD16/32 एंटीबॉडी के 7 मिलीलीटर (1 ग्राम / एमएल अंतिम एकाग्रता) युक्त डिश में स्थानांतरित.
  2. संदंश का प्रयोग, पूरी तरह से इसे खींच अलग से फेफड़े के ऊतकों बिखर और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं जबकि धीरे एक घुमाव 200 rpm के लिए सेट पर कमाल. अगर वांछित, सेल निलंबन तो अगले कदम तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा.
  3. 100 और बाद में साथ 70 सुक्ष्ममापी सुक्ष्ममापी, 48 सुक्ष्ममापी और 30 सुक्ष्ममापी pores के साथ नायलॉन 1 meshes सेल के माध्यम से निलंबन फ़िल्टर करें. प्रत्येक जाल के रूप में और ट्यूबों DMEM साथ अच्छी तरह व्यंजन के रूप में अच्छी तरह कुल्ला कोशिकाओं के नुकसान को कम करने के लिए और अधिकतम उपज ख्याल रखना. यदि आप नमूने pooling कर रहे हैं, यह बाद में एक समूह के चूहों से एक ही फिल्टर के माध्यम से कोशिकाओं के निलंबन से गुजर रहा यहाँ प्राप्त किया जा सकता है. नवीनीकृत clogging के मामले में फिल्टर.
  4. की मात्रा पर निर्भर करता है, एक या एक से अधिक 50 मिलीलीटर ट्यूबों छानना हस्तांतरण और160 XG में 15 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र तैरनेवाला निकालें.
  5. 2 मिलीलीटर एरिथ्रोसाइट lysis बफर (0.15 एम एनएच 4 सीएल, 0.01 एम 3 KHCO, 0.1 मिमी EDTA, पीएच 7.2) में सेल गोली Resuspend और जल्दी से DMEM माध्यम के 13 मिलीलीटर के अलावा द्वारा lysis को समाप्त. 160 XG में 12 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र समाधान स्थानांतरण

4. फ्लो cytometric सेल छँटाई के लिए एंटीबॉडी धुंधला

  1. 3 मिलीलीटर प्राथमिक एंटीबॉडी कॉकटेल, प्रवाह cytometry के लिए उपयुक्त dilutions DMEM माध्यम में तैयार में कोशिकाओं Resuspend. (एंटीबॉडी पहले 100 μl के एक मात्रा में 1 x 10 6 splenocytes धुंधला इष्टतम काम dilutions के लिए titrated उपयोग करें. प्राथमिक प्रतिरक्षी कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के प्रत्येक के लिए इष्टतम सांद्रता युक्त कॉकटेल के 3 मिलीग्राम से पाँच चूहों को जमा. यदि अधिक चूहों एक नमूना जमा कर रहे हैं, मात्रा समायोजित).
  2. धुंधला के लिए अंधेरे में 10 मिनट के लिए कोशिकाओं सेते हैं4 डिग्री सेल्सियस
  3. DMEM मध्यम और centrifugation के साथ 160 XG में 12 मिनट और 4 के लिए 15 मिलीलीटर ट्यूब भरने द्वारा कोशिकाओं को धो डिग्री सेल्सियस
  4. मामले में uncoupled या biotinylated एंटीबॉडी 4.1 में इस्तेमाल किया गया: तैरनेवाला निकालें और 2 में कोशिकाओं resuspend - 3 मिलीग्राम माध्यमिक एंटीबॉडी कॉकटेल. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट में के लिए अंधेरे में दाग.
  5. DMEM और centrifugation साथ 160 XG में 12 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए भरने ट्यूब के माध्यम से कोशिकाओं धोने
  6. DMEM और पूर्व फिल्टर के 1 मिलीलीटर में एक 50 सुक्ष्ममापी सेल छँटाई के लिए एक ट्यूब में फिल्टर के माध्यम से कोशिकाओं Resuspend. वैकल्पिक: सेल फेफड़ों निलंबन में कुल सेल नंबर प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं गणना.

5. सेल छँटाई

  1. छँटाई करने के लिए पहले vortexing द्वारा कोशिकाओं मिलाएं. के सेल छँटाई AECII के लिए एक 100 सुक्ष्ममापी नोजल का प्रयोग करें. म्यान तरल पदार्थ के रूप में के रूप में अच्छी तरह से लेजर उत्सर्जन और पता लगाने तरंगदैर्य दबाव लिखत प्रवाह cytometric के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सेल छँटाई antib में इस्तेमाल किया fluorochromes के लिए इस्तेमाल किया पर निर्भरody धुंधला हो जाना प्रक्रिया.
  2. एसएससी उच्च कोशिकाओं कि एक DMEM युक्त ट्यूब में धुंधला हो जाना और प्रकार के लिए इस्तेमाल किया fluorochromes के लिए नकारात्मक हैं पर गेट. आगे तितर बितर (FSC - एच) ऊंचाई बनाम क्षेत्र (FSC-A) और बगल की ओर तितर बितर (एसएससी - एच) ऊंचाई क्षेत्र बनाम (एसएससी-A) खिड़कियों को बाहर करने के लिए किसी भी दोहरी या सेल समुच्चय (में gating रणनीति का विवरण देखने के चित्रा 1).
  3. आदेश में 280 XG में 20 मिनट और 4 के लिए क्रमबद्ध कोशिकाओं अपकेंद्रित्र इकट्ठा करने के लिए डिग्री सेल्सियस
  4. Resuspend संस्कृति मध्यम या बफर में कोशिकाओं के रूप में बाद के विश्लेषण के लिए आवश्यक है.

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Representative Results

जब सेल फेफड़ों स्वस्थ चूहों से अलग निलंबन छँटाई, AECII गेट आमतौर पर के बारे में 42 के लिए खाते ± सभी घटनाओं का 10%. यह प्रतिशत काफ़ी कम जब एक वायरल संक्रमण के रूप में सांस की शर्तों के साथ चूहों का इस्तेमाल कर रहे हैं, हो सकता है, के रूप में प्रारंभिक सेल निलंबन लिम्फोसाइटों और अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं वायुमार्ग के लिए भर्ती की एक काफी उच्च अनुपात शामिल कर सकते हैं. 3 दिन के बाद संक्रमण पर IAV संक्रमित फेफड़ों से अलग AECII के लिए हम लगभग 50% से फाटक AECII में कोशिकाओं की आवृत्ति की एक कमी मनाया गया है.

एक ठेठ हल कोशिकाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से फिर से विश्लेषण तरह 1 ख और ग 1 आंकड़े में दिखाया गया है. संकेत के रूप में, अलग कक्षों की पवित्रता लगभग 92 खातों ± 5%. आंकड़ा 2a में, हम बताते हैं कि शुद्ध सेल आबादी के सफल जुदाई surfactant प्रोटीन सी, जो विशेष रूप से व्यक्त किया जाता है के लिए धुंधला हो जाना द्वारा पुष्टि की जा सकती है16 AECII, 17.

हमने देखा है कि एकल पशु प्रति अलग AECII की संख्या जोरदार माउस इस्तेमाल तनाव पर निर्भर करता है. 3 10 x 5 / AECII माउस - / BALB ग चूहों जबकि आम तौर पर 6 AECII / माउस, C57BL / 6 तनाव केवल 1 पैदावार 1 10 x उपज प्रयोग प्रति इस्तेमाल चूहों की संख्या इसलिए बाद में प्रदर्शन किया जा विश्लेषण के प्रकार के माउस के रूप में के रूप में अच्छी तरह से तनाव पर निर्भर करता है.

पुनः प्राप्त AECII की व्यवहार्यता के बारे में, हम आम तौर पर 90% के आसपास के प्रवाह cytometric सेल छँटाई के बाद व्यवहार्यता दरों को खोजने के. व्यवहार्य कोशिकाओं के इस उच्च अनुपात तो प्रत्यक्ष कार्यात्मक रूप में के रूप में अच्छी तरह से पृथक प्राथमिक murine AECII के संस्कृति अल्पकालिक विश्लेषण की अनुमति देता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. अवलोकन ओgating नकारात्मक चयन द्वारा प्राथमिक murine AECII के प्रवाह cytometric अलगाव के लिए इस्तेमाल किया रणनीति (ए) gating रणनीति पर योजनाबद्ध सिंहावलोकन देखें. (बी) एक सेल फेफड़ों निलंबन तरह के प्रतिनिधि भूखंडों. (सी) हल कोशिकाओं के एक विश्लेषण के प्रतिनिधि परिणाम. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. विशेषता और क्रमबद्ध प्राथमिक murine AECII की आणविक विश्लेषण () क्रमबद्ध AECII की Cytospins surfactant प्रोटीन सी (SPC) के लिए दाग थे. चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी की तुलना में, कोशिकाओं के लगभग 100% करने के लिए छठे वेतन आयोग सकारात्मक पाए गए. शाही सेना अलगाव के बाद क्रमबद्ध प्राथमिक murine AECII (बी) के प्रतिनिधि आरएनए प्रोफ़ाइल. 18S और गणना RIN कारक साथ 28S ribosomal शाही सेना के साथ के लिए विशिष्ट चोटियों मैं शाही सेना का प्रतिनिधित्व करते हैं और AECII से अक्षुण्ण अलग शाही सेना के लिए ntegrity गुणवत्ता.

चित्रा 3
चित्रा 3. इन्फ्लूएंजा प्राथमिक murine संक्रमित चूहों से अलग AECII में एक वायरस nucleoprotein अभिव्यक्ति (एनपी) के विश्लेषण C57BL / 6 चूहों intranasally फॉस्फेट दिलाई गई. 1 दिन, 2 या 3 पर खारा या इन्फ्लूएंजा ए वायरस PR8/A/34 AECII अलगाव से पहले buffered . (ए) एक uninfected से फेफड़ों सेल निलंबन के प्रतिनिधि भूखंडों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक तीन दिवसीय छँटाई के लिए संक्रमित C57BL / 6 माउस दाग. (बी) इन्फ्लुएंजा क्रमबद्ध AECII में एक वायरस एनपी अभिव्यक्ति एक एनपी विशिष्ट एंटीबॉडी और बाद प्रवाह cytometric विश्लेषण के साथ intracellular धुंधला हो जाना के माध्यम से विश्लेषण किया गया. (सी) तालिका एनपी धुंधला हो जाना का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) से पता चलता है.

s "> चित्रा 4
चित्रा 4. इन्फ्लूएंजा ए वायरस (NP) nucleoprotein पूर्व प्राथमिक murine AECII संक्रमित vivo में अभिव्यक्ति का विश्लेषण पूर्व vivo इन्फ्लूएंजा के एक PR8/A/34 वायरस इन्फ्लूएंजा ए वायरस 6 एनपी के लिए intracellular धुंधला हो जाना द्वारा संक्रमित AECII प्रतिनिधि (ए) प्रवाह cytometric विश्लेषण. पोस्ट घंटा संक्रमण. (बी) के पूर्व vivo इन्फ्लूएंजा के एक अलग वायरस dilutions के साथ AECII 6 घंटे पोस्ट संक्रमण वायरस संक्रमित एनपी धुंधला से प्रतिनिधि परिणाम का सारांश.

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Discussion

हमारा प्रोटोकॉल प्रवाह cytometry द्वारा murine AECII के अलगाव के लिए कार्यात्मक और आणविक अध्ययन की एक पूरी श्रृंखला के लिए माउस फेफड़ों से प्राथमिक कोशिकाओं तक पहुँचने का एक तेजी से रास्ता प्रदान करता है. वर्णित प्रक्रिया पैदावार AECII की अत्यधिक व्यवहार्य और शुद्ध आबादी है कि शाही सेना (देखें आंकड़ा 2b) अलगाव और transcriptome अध्ययन जैसे प्रत्यक्ष बाद का विश्लेषण करती है, के लिए पर्याप्त संख्या में हैं. कार्यात्मक अनुप्रयोगों के लिए, यह भी संभव है अलग कक्षों की संस्कृति AECII वातानुकूलित मध्यम या सह संस्कृति प्रयोगों की पीढ़ी उदा अनुमति देता है. इन कार्य के अध्ययन के लिए विशेष रूप से एक लाभ के रूप में, नकारात्मक चयन द्वारा प्राथमिक कोशिकाओं के अलगाव के रूप में यहाँ वर्णित पैदावार अछूता कोशिकाओं है जो बाध्यकारी एंटीबॉडी के अधीन नहीं किया गया है. हालांकि, सेल लाइनों में प्रदर्शन उन पर प्राथमिक AECII में अध्ययन के लाभ के बावजूद, इन प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए व्यावहारिक सीमाएं हैं. अगले संख्या में मात्र सीमा, जो व्यापक प्रदर्शन की आवश्यकता होती है पढ़ाई की आवश्यकताओं को पूरा नहीं कर सकते हैं, प्राथमिक AECII जो हम 48 घंटा के आसपास औसत करने के लिए मनाया है एक सीमित समय के लिए ही संस्कृति में जीवित रहते हैं. इन अल्पकालिक संस्कृति प्रयोगों में, हम संस्कृति के माध्यम का चुनाव बाद assays AECII वातानुकूलित मध्यम में इस्तेमाल किया गया था की प्रकृति पर आधारित है और IMDM (IMDM Glutamax, Gibco बिल्ली 31980 नंबर) के साथ पूरक के साथ संतोषजनक परिणाम हासिल 10% FCS, मानक एंटीबायोटिक दवाओं और 0.25 मिमी β-mercaptoethanol.

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल व्यवहार्य और अच्छी संख्या में शुद्ध प्राथमिक murine AECII अलग करने का एक अपेक्षाकृत आसान और तेजी से रास्ता दिखाता है. जुदाई के बाद झुकेंगे कोशिकाओं की शुद्धता गंभीर रूप से सेल छँटाई की प्रक्रिया पर निर्भर करता है. सेल आबादी है जो बाहर रखा जा रहे हैं की एक स्पष्ट और मजबूत धुंधला हो एसएससी उच्च घटनाओं पर कड़े gating के रूप में भी उतना ही महत्वपूर्ण है, ताकि प्रकार के रूप में अच्छी तरह से lymphoid कोशिकाओं के साथ contaminationsमैं उपकला कोशिकाओं को कम से कम कर रहे हैं. अलग कोशिकाओं की पैदावार के बारे में, हमने देखा है कि इस कच्चे सेल निलंबन की तैयारी enzymatic पाचन के बाद ऊतक के पूर्ण विघटन के रूप में के रूप में अच्छी तरह के दौरान ट्यूबों, फिल्टर meshes और प्लेटों के व्यापक निस्तब्धता द्वारा maximized है. प्राथमिक AECII के साथ काम करने का एक मुख्य लाभ यह है कि वे श्वसन तंत्र के रोगों से पीड़ित मेजबान से सीधे पृथक कर सकते हैं. ऐसे AECII सभी उनके प्राकृतिक सूक्ष्म वातावरण में मौजूद है और इसलिए अच्छी तरह vivo स्थिति में प्रतिबिंबित कारकों को उजागर किया गया है जाएगा. मानव AECII 18, 19 के लिए के विपरीत, इस प्रयोगात्मक प्रणालियों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए बढ़ाया जा सकता है जब murine मॉडल में काम कर रहा है. हम autoimmune के रूप में के रूप में अच्छी तरह से फेफड़ों के वायरल संक्रमण सूजन के बारे में अध्ययन में किया गया है इस का लाभ ले रही है. जिससे हम CD4 से पीड़ित चूहों से कि AECII पाया + टी सेल मध्यस्थता श्वसन सूजन inflammat की एक विस्तृत श्रृंखला व्यक्तORY जीन जो फेफड़ों के प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 3 को विनियमित करने के लिए अपनी क्षमता को दर्शाता है. इसके अलावा, हम प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल वर्ग द्वितीय अणुओं के कार्यात्मक सक्रियण ऑटो प्रतिक्रियाशील CD4 + टी कोशिकाओं में जो परिणाम के माध्यम से आत्म प्रतिजनों कि AECII प्रदर्शन दिखा सकता है. एक ही समय में AECII स्रावित Foxp3 की प्रेरण + विनियामक टी कोशिकाओं 4 को बढ़ावा देने के कारकों द्वारा फेफड़ों सहिष्णुता बनाए रखने.

फेफड़ों के वायरल संक्रमण के बारे में, हम सफलतापूर्वक इन्फ्लूएंजा ए वायरस से संक्रमित चूहों से प्राथमिक AECII अलग है. जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, पूरे फेफड़ों सेल निलंबन के एक छोटे अनुपात के लिए यहाँ AECII खाते, प्रतिरक्षा कोशिकाओं के काफी संख्या के रूप में संक्रमण के जवाब में फेफड़ों के लिए भर्ती कर रहे हैं (आंकड़ा 3a देखें). अलग कोशिकाओं के भीतर एक वायरस nucleoprotein (एनपी) इन्फ्लूएंजा के intracellular धुंधला हो जाना समय के दौरान अधिक वायरल प्रोटीन की बढ़ती अभिव्यक्ति से पता चलता है के रूप में दिखाया जी आंकड़े> 3b और 3c. इन AECII, vivo में वायरस से ट्रिगर, श्वसन वायरल संक्रमण के दौरान airway उपकला के आणविक और कार्यात्मक phenotype के रूप में के रूप में अच्छी तरह के दौरान वसूली के बारे में अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदर्शित. हालांकि, AECII के रूप में इन्फ्लूएंजा ए वायरस के प्राथमिक लक्ष्य हैं और वहाँ उपकला परत की पर्याप्त विनाश है, कोशिकाओं की दर संक्रमित चूहों से मिले पाठ्यक्रम पर और संक्रमण की गंभीरता के साथ कम हो जाती है. इसके अलावा, के रूप में वायरस बार बार replicates और नई कोशिकाओं को संक्रमित, पृथक AECII संक्रमण के अधीन समय में एक ही बिंदु पर परिभाषित नहीं किया गया है. इस प्रकार, इन अध्ययनों आदर्श स्वस्थ चूहों जहां संक्रमण बेहतर और सिंक्रनाइज़ है जो, रूप में intracellular वायरल एनपी 4a और 4b आंकड़े में दिखाया धुंधला हो जाना द्वारा मूल्यांकन से पूर्व प्राथमिक murine AECII संक्रमित vivo का उपयोग कर प्रयोगों से पूरित कर रहे हैं, संक्रमण की उच्च दरों के आधार पर कर सकते हैं उपज वायरल खुराक इस्तेमाल.

jove_content "> साथ में ले ली, प्रवाह के रूप cytometric नकारात्मक चयन यहाँ वर्णित शुद्ध और व्यवहार्य प्राथमिक murine AECII अलग की एक तेजी से जिस तरह से प्रदर्शित करता है इन कोशिकाओं विश्लेषण की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त हैं और हमारे AECII की भूमिका के ज्ञान का विस्तार करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है. vivo में श्वसन तंत्र में प्रतिरक्षा विनियमन.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

हम करने के लिए तकनीकी सहायता के लिए जैव सुरक्षा स्तर 2 नमूनों से प्राथमिक murine AECII छँटाई में एम. Höxter धन्यवाद देना चाहूंगा.

यह काम DB जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (DFG) (SFB587, टी.पी. बी 12 और BR2221/1-1) और ए.ए. हनोवर जैव चिकित्सा अनुसंधान स्कूल (DFG GSC 108) से एक वजीफा से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. DB राष्ट्रपति की पहल और जर्मन रिसर्च केंद्र के Helmholtz अनुबंध संख्या W2/W3-029 के तहत एसोसिएशन (HGF) नेटवर्किंग कोष द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
indwelling cannula Introcan 22G Braun REF 4252098B
Dispase, 100 ml(5000 caseinolytic units) BD Biosciences 354235 aliquot to 4 ml in 15 ml tubes, store at -20 °C
Biozym Plaque Agarose Biozym 840101 1% w/v in H2O
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, 2000 Kunitz units/vial Sigma-Aldrich D4263 freshly dissolve content of 1 vial in 300 μl DMEM
DMEM Gibco 22320-022 used as provided by manufacturer (Low Glucose, Pyruvate, HEPES)
cell strainers (100 μm, 75 μm) BD Falcon 352360, 352350
nylon mesh(48 μm, 30 μm) Bückmann GmbH 03-48/26-1020, 03-30/18-108
CellTrics 50 μm filter PARTEC 04-0042-2317
anti-mouse CD16/CD32 BioLegend 101302 clone 93; purified
anti-mouse F4/80 BioLegend 123116 clone BM8; APC coupled
anti-mouse CD11b BioLegend 101208 clone M1/70; PE coupled
anti-mouse CD11c BioLegend 117310 clone N418; APC coupled
anti-mouse CD45 BioLegend 103102 clone 30-F11; purified
anti-mouse CD19 eBioscience 12-0193-83 eBio 1D3; PE coupled
polyclonal goat anti-rat IgG BD Pharmingen 550767 polyclonal, PE coupled

Antibodies coupled to alternative fluorochromes can be used, depending on the flow cytometer and lasers available.

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References

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