Isolamento de citometria de fluxo de células primárias Murino Tipo II epiteliais alveolares de Estudos funcionais e Molecular

Immunology and Infection

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Summary

Nós descrevemos o isolamento rápido de murinos primários células tipo II alveolares epiteliais (AECII) por meio de seleção por citometria de fluxo negativo. Estes AECII mostram viabilidade e pureza elevados e são adequadas para uma ampla gama de estudos funcionais e moleculares relativas ao seu papel em condições respiratórias, tais como doenças auto-imunes ou infecciosas.

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Gereke, M., Autengruber, A., Gröbe, L., Jeron, A., Bruder, D., Stegemann-Koniszewski, S. Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies. J. Vis. Exp. (70), e4322, doi:10.3791/4322 (2012).

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Abstract

Ao longo dos últimos anos, a contribuição das células alveolares tipo II epiteliais (AECII) a vários aspectos da regulação imune no pulmão tem sido cada vez mais reconhecida. AECII têm sido mostrados para participar na produção de citoquina em inflamação das vias aéreas e ao mesmo actuar como células apresentadoras de antigénio, em ambos infecção e de células-T auto-imunidade mediada por 1-8. Por isso, eles são particularmente interessantes também em contextos clínicos, tais como hiper-reactividade ao estrangeiro e auto-antigénios, bem como infecções que, directa ou indirectamente como alvo AECII. No entanto, a nossa compreensão das funções imunológicas detalhadas servidas por células de tipo II alveolares epiteliais no pulmão saudável, bem como na inflamação permanece fragmentária. Muitos estudos sobre a função AECII são realizadas usando o mouse ou humanos alveolares linhas de células epiteliais 9-12. Trabalhando com linhas celulares certamente oferece uma série de vantagens, tais como a disponibilidade de grandes quantidades of células para análise extensiva. No entanto, nós acreditamos que a utilização de AECII murino primário permite um melhor entendimento sobre o papel deste tipo de células em processos complexos como infecção ou inflamação autoimune. AECII murino primário pode ser isolado directamente a partir de animais que sofrem de tais condições respiratórias, o que significa que foram sujeitos a todos os outros factores extrínsecos que desempenham um papel na definição analisados. Como um exemplo, AECII viável pode ser isolado a partir de murganhos intranasalmente infectados com o vírus influenza A, que tem como alvo as células principalmente para a replicação de 13. É importante notar que com a infecção ex vivo de AECII isolado de ratos saudáveis, os estudos das respostas celulares montadas sobre a infecção pode ser ainda mais alargado.

O protocolo para o isolamento de AECII murino primário é baseada na digestão enzimática do pulmão de rato seguido de rotulagem da suspensão de células resultante com anticorpos específicos para CD11c, CD11b, F4/80,CD19, CD45 e CD16/CD32. AECII granulares são, em seguida, identificada como a dispersão não marcado e para o lado de alta (SSC alta) da população de células e são separados por classificação de células activadas por fluorescência 3.

Em comparação com outros métodos de isolamento de células primárias epiteliais de pulmão de rato, o nosso protocolo para o isolamento de citometria de fluxo de AECII por selecção negativa produz intacta, AECII altamente viável e pura em tempo relativamente curto. Além disso, e em contraste com os métodos convencionais de isolamento por filtração e depleção de linfócitos através de ligação do anticorpo-esferas magnéticas acopladas 14, 15, por citometria de fluxo de células para triagem de discriminação permite que, por meio de tamanho celular e granularidade. Dado que a instrumentação de separação de células por citometria de fluxo está disponível, o processo descrito pode ser aplicado a custos relativamente baixos. Ao lado de anticorpos normais e enzimas para a desintegração do pulmão, não reagentes adicionais, tais como magnéticoGrânulos são necessários. As células isoladas são adequadas para uma ampla gama de estudos funcionais e moleculares, que incluem a cultura in vitro e ensaios de estimulação de células T, bem como transcriptoma, proteoma ou análises secretoma 3, 4.

Protocol

Os detalhes sobre os reagentes e materiais necessários estão listados na tabela, no final do protocolo abaixo. Antes de iniciar o trabalho, preparar tubos de 15 ml (um por rato) contendo 4 ml de dispase e pré-aquecê-los a 37 ° C num banho de água. Num bloco de aquecimento, logo aquecer pequenas alíquotas de 1% de agarose de baixa fusão (em água) a 95 ° C até liquefeito e, subsequentemente, arrefecer a 45 ° C até à sua utilização.

1. Preparação do pulmão do rato

  1. Sacrificar o mouse por asfixia CO 2. Nota: Não realizar o deslocamento cervical como isso irá prejudicar a traqueia, de modo que na sequência de passos do protocolo, tal como a instalação do pulmão com um líquido, não pode ser realizada com sucesso. Assegurar a perda de reflexos nociceptivos.
  2. Pulverizar o rato com etanol e fazer um corte de comprimento ao longo da linha média ventral do corpo. Puxe a pele ventral e pele e, posteriormente, também cuidadosamente cortar e remover o peritônio.
  3. Desangrar orato, cortando a veia jugular esquerda e para a direita (Vena jugularis), bem como a artéria renal (renalis Arteria). Remover o sangue fluindo com tecido.
  4. Punção cuidadosamente e retire o diafragma para expor o coração e pulmão cortando as costelas. Tome especial cuidado para não ferir o pulmão.
  5. Com uma cânula 26G e uma seringa de 10 ml cheia com solução salina tamponada com fosfato frio (PBS), a punção do ventrículo direito do coração e o pulmão perfundir com PBS até ficar livre de sangue.
  6. Cortar e remover as glândulas salivares para expor a traquéia. Também corte cuidadosamente o músculo ao redor da traquéia.
  7. Insira uma cânula 22G na traquéia, retire a agulha e empurrar o cateter plástico para o pulmão. Fixar o cateter, amarrando um pequeno pedaço de fio em torno traquéia e cateter.

2. A digestão enzimática do tecido pulmonar

Se desejado, uma amostra de fluido de lavagem broncoalveolar pode serpreparada por lavagem dos pulmões por meio do cateter inserido na traqueia com PBS ou meio antes do passo seguinte.

  1. Utilizando uma seringa de 2 ml, cuidadosamente incutir um volume máximo de 2 ml de dispase (do alíquota de 4 ml) para o pulmão através do cateter de modo a que todos os lóbulos estão completamente expandida. Trocar a seringa com uma seringa de 1 ml contendo 0,5 ml de agarose a liquefeito e também instilar para o pulmão.
  2. Deixar a seringa no cateter para evitar o refluxo da agarose e cobrir imediatamente o pulmão com papel de laboratório tecido e gelo. Deixe o gel de agarose para um par de minutos.
  3. Remover o papel de tecido, o gelo, seringa e cateter, cortou a traqueia e excisão do coração, pulmão e timo do peito. Lavar o pulmão num prato com PBS e remover o coração timo e traqueia restante.
  4. Coloque o pulmão para a 2 ml de dispase restante e incubar à temperatura ambiente durante 45 min.

3. Preparação do PulmãoSuspensão de células

  1. Remover o pulmão do dispase e transferi-lo para um prato contendo 7 ml de anti-CD16/32 anticorpo (1 ug / ml de concentração final) em meio DMEM e 100 ul de DNase.
  2. Usando fórceps, completamente desintegrar o tecido pulmonar, puxando-o à parte e incubar durante 10 min à temperatura ambiente enquanto agitando suavemente em um balancim fixado a 200 rpm. Se desejado, a suspensão de células podem então ser armazenadas a 4 ° C, até ao passo seguinte.
  3. Filtra-se a suspensão de células através de malhas de nylon com 100 um primeiro e, subsequentemente, com 70 uM, 48 uM e 30 uM poros. Ter o cuidado de lavar cada malha, bem como os tubos e pratos cuidadosamente com DMEM para minimizar a perda de células e maximizar o rendimento. Se estiver a juntar amostras, isto pode ser conseguido por aqui posteriormente passando suspensões de células a partir de ratos de um grupo através do mesmo filtro. Substituir o filtro, em caso de entupimento.
  4. Dependendo do volume e transferir o filtrado para um ou mais tubos de 50 ml ecentrifugar durante 15 min a 160 xg e 4 ° C. Remover o sobrenadante.
  5. Ressuspender o sedimento de células em 2 ml de tampão de lise de eritrócitos (0,15 M NH 4 Cl, 0,01 M de KHCO3, 0,1 mM de EDTA, pH 7,2) e rapidamente encerrar a lise por adição de 13 ml de meio DMEM. Transferir a solução para um tubo de 15 ml e centrifugar durante 12 min a 160 xg e 4 ° C.

4. A coloração de anticorpo por separação celular por citometria de fluxo-

  1. Ressuspender as células em 3 ml de cocktail de anticorpo primário, preparado em meio DMEM em diluições apropriadas para citometria de fluxo. (Os anticorpos foram previamente titulado para óptimos diluições de trabalho através da coloração de 1 x 10 6 esplenócitos num volume de 100 ul. Uso de 3 ml do cocktail de anticorpo primário que contém as concentrações ideais para cada um dos anticorpos usados ​​para as células reunidas a partir de um máximo de cinco ratinhos. Se mais camundongos são reunidas para uma amostra, ajustar o volume).
  2. Para a coloração, incubar as células durante 10 min no escuroa 4 ° C.
  3. Lave as células através do enchimento do tubo de 15 ml com DMEM e centrifugação durante 12 min a 160 xg e 4 ° C.
  4. No caso de anticorpos ou desacoplados biotinilados foram usados ​​em 4.1: Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 2-3 ml de cocktail de anticorpo secundário. Mancha durante 10 min a 4 ° C no escuro.
  5. Lave as células através de enchimento do tubo com DMEM e centrifugação durante 12 min a 160 xg e 4 ° C.
  6. Ressuspender as células em 1 ml de DMEM e pré-filtro através de um filtro de 50 um para um tubo de triagem de células. Opcional: Contar as células para se obter o número total de células na suspensão de células do pulmão.

5. De separação de células-

  1. Misturar as células através de agitação em vórtice antes da triagem. Usar um bocal 100 para uM célula triagem de AECII. Pressão do invólucro de fluido, bem como de emissão laser e comprimentos de onda de detecção dependem do instrumento utilizado para a triagem de citometria de fluxo de células, bem como os fluorocromos utilizados na Antibody procedimento de coloração.
  2. Portão sobre as células SSC elevados que são negativas para os fluorocromos utilizados para coloração e tipo para um tubo contendo DMEM. Use a frente altura de dispersão (FSC-H) versus área (FSC-A) e para o lado a altura de dispersão (SSC-H) versus área (SSC-A) janelas para excluir quaisquer doublets ou agregados celulares (veja detalhes da estratégia de propagação em Figura 1 a).
  3. A fim de recolher a ordenada centrífuga células durante 20 min a 280 xg e 4 ° C.
  4. Ressuspender as células em meio de cultura ou de tampão conforme necessário para a análise subsequente.

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Representative Results

Ao classificar suspensões de pulmão de células isoladas a partir de ratos saudáveis, o portão AECII normalmente responsáveis ​​por cerca de 42 ± 10% de todos os eventos. Esse percentual pode ser notavelmente menor quando os ratos com doenças respiratórias, como uma infecção viral são usadas, como a suspensão de células inicial vai conter uma proporção consideravelmente maior de linfócitos e outras células imunológicas recrutados para as vias aéreas. Para AECII isolada do pulmão IAV infectados no dia 3 após a infecção observou-se uma redução da frequência de células no portão AECII por cerca de 50%.

Um tipo comum, bem como uma re-análise das células classificados é representado nas figuras 1-B e 1-C. Como indicado, a pureza das células isoladas representa cerca de 92 ± 5%. Na figura 2a, mostra-se que a separação bem sucedida de populações de células puras podem ser confirmadas por coloração de proteínas tensioactivas-C, o que é expresso exclusivamente pelaAECII 16, 17.

Temos observado que o número de AECII isolado por animal depende fortemente da estirpe de ratinho utilizada. Considerando que ratinhos BALB / c tipicamente render 1 x 10 6 AECII / murganho, da estirpe C57Bl / 6 só produz 1-3 x 10 5 AECII / rato. O número de murganhos utilizados em cada experiência, por conseguinte, depende da estirpe de ratinho, bem como o tipo de análises subsequentes a serem executadas.

No tocante à viabilidade da AECII recuperada, nós tipicamente encontrar taxas de viabilidade de cerca de 90% após a citometria de fluxo de células-classificação. Esta elevada percentagem de células viáveis, em seguida, permite directas análises funcionais, bem como da cultura de curto prazo do AECII primário isolado murino.

Figura 1
Figura 1. Visão geral over a estratégia de propagação utilizado para o isolamento de citometria de fluxo de AECII murino primário por seleção negativa. (A) Visão esquemática sobre a estratégia de propagação. (B) parcelas representante de um tipo de suspensão de pulmão de células. (C) resultado Representante de uma re-análise das células classificados. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2
Figura 2. Caracterização e análise molecular das ordenadas AECII primário murino. (A) cytospins de AECII ordenadas foram coradas para a proteína C do surfactante (SPC). Em comparação com a microscopia de contraste de fase, cerca de 100% das células foram consideradas positivas SPC. (B) perfil de RNA Representante de ordenadas AECII primário murino após isolamento de RNA. Picos específicos para 18S e 28S RNA ribossomal juntamente com o fator RIN calculado representam RNA i ntegrity e qualidade para intactas RNA isolado de AECII.

Figura 3
Figura 3. Análise da nucleoproteína do vírus da gripe A expressão (NP) em AECII murino primário isoladas de ratinhos infectados. C57BL / 6 foram administrados por via intranasal ou solução salina tamponada com fosfato de vírus A da gripe PR8/A/34 nos dias 1, 2 ou 3, antes do isolamento AECII . (A) Gráficos representativos de suspensões de pulmão de células não infectadas a partir de um, bem como um de três dias coradas rato infectado C57Bl / 6 para a classificação. (B) Influenza A expressão NP vírus em AECII classificada foi analisada através de coloração intracelular com um anticorpo específico e NP-análise por citometria de fluxo subseqüente. (C) A tabela mostra a intensidade média de fluorescência (MFI) da coloração NP.

s "> Figura 4
Figura 4. Análise da influenza A nucleoproteína do vírus (NP) expressão in vivo ex infectado primário AECII murino. (A) Representante análise por citometria de fluxo ex vivo de vírus influenza A PR8/A/34 AECII infectadas por coloração intracelular para o vírus da gripe A NP 6 h após a infecção. (B) Resumo dos resultados representativos de NP-coloração ex vivo de vírus influenza A infectado AECII 6 h após a infecção com vírus de diferentes diluições.

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Discussion

O protocolo para o isolamento de AECII murina por citometria de fluxo proporciona uma forma rápida de aceder a partir de células primárias do pulmão do rato para uma ampla gama de estudos funcionais e moleculares. O procedimento descrito proporciona populações altamente viáveis ​​e puras dos AECII que são em número suficiente para directos análises subsequentes, tais como o isolamento de ARN (ver figura 2b) e os estudos de transcriptoma. Para aplicações funcionais, também é possível a cultura de células isoladas, por exemplo, permitindo a geração de AECII meio condicionado ou de co-cultura de experimentos. Como um benefício especial para estes estudos funcionais, o isolamento de células primárias por selecção negativa como descrito aqui produz células intactas que não tenham sido objecto de ligação do anticorpo. No entanto, apesar das vantagens dos estudos em AECII primária sobre as realizadas em linhas de células, existem limitações práticas para o uso dessas células primárias. Ao lado da limitação do número de mera, Que pode não satisfazer os requisitos de estudos de rastreio que requerem extensa, AECII primário sobreviver em cultura apenas durante um tempo limitado, que observamos a média de cerca de 48 horas. Nestas experiências de cultura de curto prazo, nos baseamos na escolha do meio de cultura sobre a natureza dos ensaios seguintes, o meio condicionado foi AECII utilizados e têm obtido resultados satisfatórios com IMDM (IMDM Glutamax, Gibco Cat. No. 31980) suplementado com 10% de SFB, antibióticos padrão e 0,25 mM β-mercaptoetanol.

O protocolo aqui descrito apresenta uma forma relativamente fácil e rápido de isolamento e viável AECII primário puro murino em bons números. A pureza das células produziram após a separação depende criticamente do processo de triagem de células. A coloração clara e forte das populações de células que estão a ser excluído é tão importante como gating rigoroso sobre os acontecimentos SSC elevadas, de modo que a contaminação com células linfóides como tipo bemI As células epiteliais são minimizados. No que diz respeito ao rendimento de células separadas, observou-se que esta é maximizada por lavagem extensiva dos tubos, telas de filtro e as placas durante a preparação da suspensão de células em bruto, bem como pela desintegração completa do tecido após a digestão enzimática. Uma vantagem principal em trabalhar com AECII primária é a de que eles podem ser isolados directamente a partir de hospedeiros que sofrem de doenças do trato respiratório. AECII tal terão sido expostos a todos os factores presentes no seu ambiente de micro-natural e, portanto, também reflectem a situação in vivo. Ao contrário de AECII humano 18, 19, este pode ser estendido para uma ampla gama de sistemas experimentais quando se trabalha em modelos murinos. Temos vindo a tomar vantagem deste em estudos sobre a inflamação auto-imune, bem como infecção viral do pulmão. Assim, verificou-se que AECII de ratinhos que sofriam de CD4 + de células T mediada inflamação respiratória expressar uma grande variedade de inflammatOry genes que demonstra o seu potencial para regular respostas imunes do pulmão 3. Além disso, pode-se mostrar que a exibição AECII auto-antigénios através de histocompatibilidade maior de classe II moléculas que resulta na activação funcional de células T CD4 + reactivas auto células T. Ao mesmo tempo, manter a tolerância AECII pulmão por factores secretores promovem a indução de Foxp3 + células T reguladoras 4.

Com relação à infecção viral do pulmão, conseguimos AECII isolado primário de camundongos infectados com vírus A da gripe. Como mencionado acima, aqui AECII conta para uma proporção menor de toda a suspensão de células de pulmão, tal como um número considerável de células do sistema imune são recrutados para os pulmões em resposta à infecção (ver figura 3a). A coloração intracelular da influenza A nucleoproteína do vírus (NP) no interior das células isoladas mostra aumento da expressão de proteínas do vírus ao longo do tempo, como mostrado na g> figuras 3b e 3c. Estes AECII, desencadeada pelo vírus in vivo, exibem uma ferramenta valiosa para estudos sobre o fenótipo molecular e funcional do epitélio das vias aéreas durante a infecção viral respiratório, bem como durante a recuperação. No entanto, como AECII são o alvo primário do vírus influenza A e há destruição substancial do revestimento epitelial, a taxa de células produziram a partir de camundongos infectados diminui ao longo do curso e com a gravidade da infecção. Além disso, como o vírus replica repetidamente e infecta novas células, o AECII isolado não tenham sido sujeitos a infecção em um único ponto de tempo específico. Assim, estes estudos estão idealmente complementada por experiências ex vivo utilizando infectado AECII murino primário a partir de ratos saudáveis, onde a infecção é melhor sincronizados e que, tal como avaliado por coloração intracelular viral NP mostrada nas figuras 4a e 4b, pode gerar taxas mais elevadas de infecção, dependendo do dose viral utilizada.

jove_content "> Tomados em conjunto, a selecção negativa de citometria de fluxo, tal como descrito aqui apresenta uma forma rápida de isolamento puro e viável AECII primário murino. Estas células são adequadas para uma ampla variedade de análises e são uma ferramenta valiosa para alargar o conhecimento do papel das AECII na regulação imune no trato respiratório in vivo.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer a M. Höxter de assistência técnica para a classificação AECII murino primário de nível de biossegurança 2 amostras.

Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) para DB (SFB587, TP B12 e BR2221/1-1) e uma bolsa da Escola de Pesquisa Biomédica Hannover (DFG GSC 108) para AA. DB é apoiada por iniciativa do Presidente e do Fundo de Networking da Associação Helmholtz de Centros de Pesquisa Alemão (HGF), sob W2/W3-029 número do contrato.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
indwelling cannula Introcan 22G Braun REF 4252098B
Dispase, 100 ml(5000 caseinolytic units) BD Biosciences 354235 aliquot to 4 ml in 15 ml tubes, store at -20 °C
Biozym Plaque Agarose Biozym 840101 1% w/v in H2O
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, 2000 Kunitz units/vial Sigma-Aldrich D4263 freshly dissolve content of 1 vial in 300 μl DMEM
DMEM Gibco 22320-022 used as provided by manufacturer (Low Glucose, Pyruvate, HEPES)
cell strainers (100 μm, 75 μm) BD Falcon 352360, 352350
nylon mesh(48 μm, 30 μm) Bückmann GmbH 03-48/26-1020, 03-30/18-108
CellTrics 50 μm filter PARTEC 04-0042-2317
anti-mouse CD16/CD32 BioLegend 101302 clone 93; purified
anti-mouse F4/80 BioLegend 123116 clone BM8; APC coupled
anti-mouse CD11b BioLegend 101208 clone M1/70; PE coupled
anti-mouse CD11c BioLegend 117310 clone N418; APC coupled
anti-mouse CD45 BioLegend 103102 clone 30-F11; purified
anti-mouse CD19 eBioscience 12-0193-83 eBio 1D3; PE coupled
polyclonal goat anti-rat IgG BD Pharmingen 550767 polyclonal, PE coupled

Antibodies coupled to alternative fluorochromes can be used, depending on the flow cytometer and lasers available.

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