İnsan bağırsak mukozasının eksplantlar Kültür ve Polarize Uyarım için Yeni Bir Yöntem

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En az 24 saat boyunca çeşitli uyaranlara yanıt kültürü ve izleme insan bağırsak mukozasının korunması için yeni bir yöntem getirmektedir. Bizim yöntem ile, doku kutup apikal yolla fizyolojik bir uyarım sağlayan, korunur.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Tsilingiri, K., Sonzogni, A., Caprioli, F., Rescigno, M. A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants. J. Vis. Exp. (75), e4368, doi:10.3791/4368 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Birkaç model şu anda gerçekçi etkileşimleri çeşitli yer alan karmaşık insan bağırsak mikro-çevre, simüle etmek için var. Aynı zamanda yanlışlıkla gıda ile yutulur patojen mikroplara karşı etkili bir bağışıklık yanıtları montaj yaparken de gıda antijenlerine karşı bütün bir immünolojik tepki neden olan tolerans şekil olarak uygun dengesini doğrudan, bu etkileşimlerin bağlıdır.

Bağırsak homeostasis mukus eki / bozulması düzenleyen Mikrobiyota (gıda ile ilişkili yararlı bakteri suşlar dahil) ve ev sahibi, arasında çeşitli karmaşık etkileşimler aracılığıyla da korunur, epitel bariyer tarafından antimikrobiyal peptidler üretimi, ve "eğitim" nüfus 'benzersiz, gut yerleşik lenfoid hücrelerin tolerojenik veya immünojenik fenotip kontrol' epitel hücreleri. Bu etkileşimler, in vitro tahlillerde ile yeniden oluşturmak için şimdiye kadar çok zor olmuşturkültürlenmiş hücre çizgileri ya da periferal kan tek-çekirdekli hücreleri ya kullanılarak. Buna ek olarak, fare modelleri, insan bağırsak ile ilgili olarak, bağırsak mukozası (mukus tabakası organizasyon, ortakçı bakteri eden) bileşenleri önemli ölçüde farklılık gösterir. Böylece, irritabl bağırsak sendromu, enflamatuar barsak hastalığı veya kolorektal kanser gibi önemli stresle ilişkili veya patolojik durumlar için klinikte getirilmesi için çeşitli tedaviler çalışmalarını gerçekleştirmek zor olmuştur.

Bu sorunları çözmek için, bize bir polarize şekilde, ev sahibi Mikrobiyota ve immün yanıt ile yerinde klima kendi korumak insan bağırsak mukozasının eksplantlarının teşvik sağlayan yeni bir sistem geliştirdi. Polarize apikal stimülasyon sonucu için büyük önem taşımaktadır immün yanıt ortaya çıkardı. Bu tekrar tekrar bağırsak epi apikal yüz atlamak zaman aynı uyaranlara tamamen farklı tepkiler üretebilir gösterilmiştirsentezlenen, basolaterally epitel hücreleri uyararak ya da lamina propria bileşenleri ile doğrudan temas, tolerojenik gelen immünojenik için fenotip geçiş ve bölgede gereksiz ve aşırı enflamasyon neden olur.

Bu yapıştırma mukoza apikal yüzünde stimülasyon alanı olarak protokolde tarif edilecektir ayrılmış bir mağara silindir polarize uyarılması sağlanır. Biz diğerleri, üç farklı Laktobasillerin suşlarının diferansiyel etkileri arasında, incelemek için bu model kullanılır. Bu model sistem sağlıklı ve hastalık koşullarında probiyotiklerin bağışıklık özelliklerini değerlendirmek için çok güçlü olduğunu göstermektedir.

Protocol

1. Elde ve Doku hazırlanması

  1. Doku (sağlıklı veya İBH mukoza) ameliyat sırasında elde edilir. Bir kez numune 4 ° C'de veya buz üzerinde Kalem / Strep ile desteklenmiş Ca + + / Mg + + ücretsiz HBSS tampon tutarak, en kısa sürede laboratuara transferi eksize edilir.

Numunenin * boyutu doku bulunmasına bağlıdır: elde edilen doku parçası, tanı için gerekli değildir ne sıkı ve sağlıklı ve IBD konular arasında büyük ölçüde değişebilir. Sağlıklı doku kolon kanseri nedeniyle ameliyat geçiren hastalarda eksize edilir.

  1. Hafifçe doku yıkayın ve tüm mezenterik malzeme temizleyin. Bir Petri kabı (mutlaka immerged değil) HBSS tampon doku tutarken steril makas ve forseps kullanarak submukozadan mukoza tabakası ayırın. Mümkün olduğunca az forseps ile mukoza yüzeyine dokunmayın.
  2. En az 1 C çizgili mukoza Kesmem genişliğinde ve mümkün olduğunca uzun süre. Eğer gıda kesim sanki çok, iki steril neşter kullanın.
  3. HBSS hafifçe mukoza temiz ve yukarı bakacak şekilde apikal yüzü bir Petri kabı üzerine uzatmak yıkayın.

2. Doku Montaj

  1. Taze orta (tisDMEM) hazırlayın. DMEM, glutamin (2 mM) ve NaPyr (1 mM) ile desteklenmiş kullanın ve FBS-Na% 15 ekleyin (Fetal Sığır Serumu - Kuzey Amerika), 1% ITS-X ve kullanım sırasında 200 ng / ml, EGF.
  2. FBS-Na (metal ızgaralar tamamen sular altında olacak şekilde yaklaşık 30 ml kullanın) ve batığın metal ızgaraları geri kalanı ile bir 10 cm Petri kabı doldurun. Plaka kendi musluğu plastik silindir açın ve destek tutun.

* Metal ızgaraları demirdir. Örgü, 0.5 mm bir tarafı ile kare-şekillidir.

  1. 10 veya 20 ul pipet ile cerrahi yapıştırıcı 3 ul alın. Bu f tutarken plastik bir silindirin sınırları birine dikkatle uygulayınforseps ile IRM.
  2. Yavaşça mümkün olduğu kadar yakın olan şeridin sınırları birine, mukoza apikal tarafındaki silindir yerleştirin.
  3. Iyi merkezinde orta 850 ul-1 ml koyun ve plaka merkezi kuyunun kenarlarında metal ızgara destek: sıkıca doku üzerinde silindir takmak için tutkal zaman vermek, merkez de organ kültürü plaka hazırlamak.
  4. Uzakta daha önce olduğu gibi iki steril neşter kullanarak silindirin sınırlarından aşırı doku kesin.
  5. Yavaşça bağlı doku ile kaldırma silindiri ve plakanın ortasına metal ızgara üzerinde bazolateral yan.

3. Uyarım

  1. Tercih konsantrasyon seçtiğiniz uyaranlara kullanın.
  2. Pipet ile silindir ya da mukoza yüzeyi bozmadan plastik silindirin merkezine uygun hacim uygulanır. Seçtiğiniz hacmi eşit silindir içindeki yüzeyini kaplayan emin olun. Içindeendikedir hacimleri:
    Büyük plastik silindir: 200 ul
    Orta plastik silindir: 100 ul
    Küçük plastik silindir: 50 ul
  3. Kadar geleneksel bir inkübatör 3 saat için inkübe edin.

* Daha uzun zaman noktalarında inkübe isterseniz, (3.5) Eğer uyaranlara çok daha küçük bir hacim (10-20 ul) kullandığınızdan emin olun ve doğrudan 1 Atm baskısı% 100 O 2 bir ortamda mendilini .

  1. Apikal yüzünde orta kalın bir tabaka gaz değişimi engelliyorsa, doku 2 O yeterli almaz, çünkü doku apikal yüzeyinden uyaranlara ile orta alın ve taze orta DEĞİŞTİR. Kapak plakası.
  2. 1 atm basınçta% 100 O2 atmosferi içinde doku yerleştirin.

4. Hasat

  1. Toplam kültür süresi (± 2,5 saat) 24 saat sonra dikkatli bir şekilde inci silindir çıkarınE bir neşter hafifçe kazıyarak tutkal yardımı ile doku ve (RNA saflaştırma ve gen ekspresyon profili ya da protein saflaştırma ve Batı benek deneyleri için sıvı N2 içinde immünohistokimya ve / veya imünoflüoresan deneylerinde ya da ek dondurulmasını düzeltmek istenen analizine bağlı olarak depolamak .)
  2. Sitokin salgılanması profil için bazolateral orta hasat. Pelet enkaz 7 dakika 8.000 rpm'de santrifüj, bir Eppendorf tüp (alternatif kısım) olarak süpernatant aktarmak ve hemen -20 ° C'de saklayın

* Daha uzun süre süpernatanlar tutmak istiyorsanız, -80 saklayın ° C

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu doku sağlığını koruyan en az 24 saat boyunca kültür sağlıklı ve IBD de insan bağırsak mukozasında korumuştur. Kültür zaman çoğunluğu (toplam en az 85%) O 2 yer aldı önceki gözlemler 1 uyarınca, bu doku geleneksel kuluçka 24 saat (Şekil 2) için hayatta değildi gibi, mümkün oldu. Ayrıca eksplant farklı tepkiler uyarılması (apikal vs bazolateral) ve uyarı 2,3 immünojeniklik polaritesine bağlı olarak bu modelde gözlenebilir göstermiştir.

Bu protokolü kullanarak, farklı probiyotik suşları doku parçası farklı tepkiler olduğunu göstermektedir. Lactobacillus plantarum NCIMB8826 Sağlıklı doku üzerinde şaşırtıcı immünojenik olduğunu kanıtladı. Diğer iki laktobasil suşlarına aksine, buna lenfoid hücrelerinin göçünü de uyaran kalmayıp mukoza koğuşlarda en üst yüzeyi, aynı zamanda önemli ölçüde bu geçiş, CCl4 yanı sıra, IL-1b, geleneksel olarak pro-enflamatuar aktivitesi ile ilgili bir sitokin ile ilgili bir kemokin upregulated. Bizim için sürpriz olsa bile, daha önce L. bir önleyici eylem gözlemlemişti Bu zorlanma canlı bakteri iltihaplı İBH doku uygulanan zaman kolit 4 bir fare modelinde paracasei, bu bir iyileştirici etkisi için tercüme etmedi. Hastalığın 2 akut dönemde İBH mukoza kullanıldığında Aksine, her üç suş zararlı olduğunu kanıtladı.

Bundan başka, 2 İBH mukoza uygulandığında, aynı zamanda önemli ölçüde iyileşir inflamasyon sırasında postbiotic isimli bir probiyotik metabolik ürünü, oldukça invazif Salmonella suşu (FB62) karşı sağlıklı epitel koruma yeteneğine sahip olduğunu göstermiştir.

_upload/4368/4368fig1.jpg "fo: içerik-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/4368/4368fig1hires.jpg "/>
Şekil 1.. Desteği olarak kullanılan metal ızgara set-up ve fotoğraflar şematik gösterimi. A. Kadar yan bakıldığında dizi şematik, b. Kadar üst, c bakıldığında setin şematik. Fotoğraf Eksplant. Doğru yerleştirildiğinde, sadece bazolateral yan merkezi orta odası, d temas alır. Tüm topluluk fotoğraf. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2,
Şekil 2.. Doku sadece O 2 kültür hayatta. Işletim odadan girişte sabit bir. Kültürsüz doku,, 2, C, 24 saat süre ile kültüre b. doku. doku geleneksel bir inkübatör içinde 24 saat boyunca kültürlenir. Orijinal büyütme: 5X.

Şekil 3,
Şekil 3 eksplantlar bir pro-inflamatuar uyarıcı etkisi C-: Belirtilen zaman noktalarında kültüre Stimüle edilmemiş doku, Sal:.. Doku Salmonella ile meydan ve belirtilen zaman noktalarında kültüre. Epitel üst tabakasının yok zaten 2 saat de görülebilir. Adı geçen eksplant, 24 saat sonra geniş dejenerasyonu sunulur. Orijinal büyütme: 10X.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

İnsan bağırsak mukozası için tedaviler geçerli olarak test edilebilir hangi fizyolojik ilgili modelleri olan ihtiyaç uzun vurgulanmıştır. Birçok araştırmacı bu amaçla bugüne kadar kullanılan cep 5 ve fare modellerinde 6 hem de potansiyel eserler ve kusurları belirledik. Umut verici klinik öncesi veriler genellikle elde olsa bile Gerçekten de, bu nadiren önemli klinik fayda çevirmek.

Bu çalışmada açıklanan bir yöntem olup, bir kültür ve polarize tarzda insan bağırsak mukoza eksplant uyarılması için mevcut protokollerde 7, 8, bir, nispeten basit ama etkili ve yeni bir uyum göstermektedir.

Bu model kliniklere her türlü potansiyel bir tedavi almadan önce geçerli klinik öncesi veri üretimi için mükemmel bir tamamlayıcı bir yaklaşım sağlayabilir. Böylece, talihsiz klinik sonuçları 9 potansiyel olarak önlenebilir ve araştırmacılar daha olabilirgüvenli bir şekilde akut inflamatuar koşulların kullanımı için kliniklere tedavi teşvik.

Modelin en önemli avantajlarından polarize karşı olmayan polarize uyarılması karşılaştırmak ve 24 saatlik zaman dilimi içinde doku tepkisi takip imkanı bulunmaktadır. Çok önemli bir parametre, her deneyde, farklı tedaviler hastalar arasında değişkenlik dikkate alınarak hesap sağlar aynı hastadan gelen eksplantlar uygulanabilir olmasıdır. Eksplantlar biyopsilerine kıyasla nispeten büyük boyutta olduğu gerçeği de analizleri çeşitli çok farklı şekillerde (ELISA deneyleri, kantitatif rtPCRs, mikrodizi analizleri, immünohistokimya ve / veya bağışıklık fluorışıması sonuçları teyit aynı eksplant gerçekleştirilebilir demektir veri). Ayrıca, analiz diğer cytofluorimetric analizlerinde bu tür kendi fenotipi teşvik eksplantlar ve değerlendirme ilgisini hücre popülasyonlarının saflaştırma gibi gelecekte de optimize edilebilirsis.

Ancak, dikkate alınması gereken önemli sınırlamalar da vardır. Bu doku durumu dayanır olarak mevcut haliyle bu modeli, tedavileri çok sayıda yüksek verimli görüntüleme için uygun değildir. Onlar tarif modeli daha verimli bir şekilde klinik girmeden önce aday tedavi sonunda test olarak kullanılmakta olanlar olacaktır, oysa 10, uyarım, çok sayıda kolu ve gerçekleştirmek için daha kolay olarak hücre kültürü modelleri muhtemelen bu amaç için daha uygundur. Ayrıca, biz dokusunun canlılığını korumak için başardı sırasında zaman dilimi gibi RNA girişim sürece izleme süreleri, gerektiren deneyler için izin vermez. Son olarak, bakteriyel uyarım, normal bir inkübatör içinde gerçekleştirilir ve anaerobik bakterilerin etkinliğini korumak veya test etmek için izin vermez. Gelecekte bu konularda çalışmak niyetinde değiliz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Biz oksijen odaları sağlamak için mükemmel teknik destek ve Dr Antonio Di Sabatino için Erika Mileti teşekkür ederim.

Finansman: MR ve Fondazione Cariplo ve Marie Curie uluslararası eğitim hareketlilik ağ (Çapraz-Talk, hibe anlaşması No: 21553-2) destek için: Bu çalışma, 7. AB çerçeve programı (Dendroworld IBDase, ERC) hibe tarafından desteklenmiştir KT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
10X HBSS Eurocalne ECM4006XL
Peni/Strepto Lonza DE17602E
Gentamycin Gibco 15750-037
DMEM Lonza BE12614
FBS-Na Gibco 16000-044
100X ITS-X Gibco 51500-056
EGF Tebu-bio 100-15
L-Glutamine Lonza BE17605E
Non essential aminoacids 100X Gibco 11140-035
NaPyr Gibco 11360-039
Materials
Cloning cylinders 6x8 mm BellCo 2090-00608
Cloning cylinders 8x8 mm BellCo 2090-0080
Cloning cylinders 10x10 mm BellCo 2090-01010
Metal grids Home made
Centre well organ culture plate BD Falcon 353037
Surgical glue (Vetbond) 3M 1469SB
Oxygen Jars Home made
Oxygen tanks Air Liquid Sanità

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schuller, S., Lucas, M., Kaper, J. B., Giron, J. A., Phillips, A. D. The ex vivo response of human intestinal mucosa to enteropathogenic Escherichia coli infection. Cell. Microbiol. 11, 521-530 (2009).
  2. Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. (2012).
  3. Tsilingiri, K., Rescigno, M. Should probiotics be tested on ex vivo organ culture models? Gut Microbes. Manuscript in preparation (2012).
  4. Mileti, E., Matteoli, G., Iliev, I. D., Rescigno, M. Comparison of the immunomodulatory properties of three probiotic strains of Lactobacilli using complex culture systems: prediction for in vivo efficacy. PLoS One. 4, e7056 (2009).
  5. Cencic, A., Langerholc, T. Functional cell models of the gut and their applications in food microbiology--a review. Int. J. Food Microbiol. 141, Suppl 1. S4-S14 (2010).
  6. te Velde, A. A., Verstege, M. A., Hommes, D. W. Critical appraisal of the current practice in murine TNBS-induced colitis. Inflamm. Bowel Dis. 12, 995-999 (2006).
  7. Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J. Anat. 134, 459-469 (1982).
  8. Browning, T. H., Trier, J. S. Organ culture of mucosal biopsies of human small intestine. J. Clin. Invest. 48, 1423-1432 (1969).
  9. Besselink, M. G., et al. Probiotic prophylaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 371, 651-659 (2008).
  10. Lakhdari, O., et al. Identification of NF-kappaB modulation capabilities within human intestinal commensal bacteria. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 282356 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics