Un nuevo método para la Cultura y polarizado estimulación de explantes mucosa intestinal humana

Biology

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Summary

Se introduce un nuevo método para el mantenimiento de la mucosa intestinal humana en la cultura y el seguimiento de la respuesta a diversos tipos de estímulos durante al menos 24 horas. Con nuestro método, se mantiene la polaridad del tejido, lo que permite una estimulación fisiológica a través de la ruta apical.

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Tsilingiri, K., Sonzogni, A., Caprioli, F., Rescigno, M. A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants. J. Vis. Exp. (75), e4368, doi:10.3791/4368 (2013).

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Abstract

Pocos modelos existen actualmente para simular de forma realista micro-entorno del complejo del intestino humano, donde una variedad de interacciones tienen lugar. La homeostasis adecuada depende directamente en estas interacciones, que dan forma a una respuesta inmunológica toda la inducción de tolerancia contra antígenos de los alimentos, mientras que al mismo tiempo de montaje de las respuestas inmunes eficaces contra los microbios patógenos ingeridos accidentalmente con alimentos.

La homeostasis intestinal se conserva también a través de diversas interacciones complejas entre la microbiota (incluyendo cepas bacterianas beneficiosas relacionados con los alimentos) y el anfitrión, que regulan la fijación / degradación de la mucosidad, la producción de péptidos antimicrobianos por la barrera epitelial, y la "enseñanza" de células epiteliales de que controla el fenotipo tolerogenic o inmunogénica de las células linfoides únicos, gut-residentes "poblaciones. Estas interacciones han sido hasta ahora muy difícil de reproducir en los ensayos in vitroya sea utilizando líneas de células cultivadas o células mononucleares de sangre periférica. Además, los modelos de ratón difieren sustancialmente en los componentes de la mucosa intestinal (organización capa de moco, las bacterias comensales comunidad) con respecto a el intestino humano. Por lo tanto, los estudios de una variedad de tratamientos de cesación en las clínicas para las condiciones importantes relacionados con el estrés o patológicos tales como el síndrome del intestino irritable, enfermedad inflamatoria del intestino o cáncer colorrectal han sido difíciles de llevar a cabo.

Para abordar estas cuestiones, hemos desarrollado un novedoso sistema que nos permite estimular explantes de mucosa intestinal humana que mantienen su in situ acondicionado por la microbiota de acogida y la respuesta inmune, de manera polarizada. Estimulación apical polarizado es de gran importancia para el resultado de la respuesta inmunitaria provocada. Se ha demostrado repetidamente que los mismos estímulos pueden producir completamente diferentes respuestas cuando se pasan por alto la cara apical de la epi intestinalthelium, estimulación de las células epiteliales hacia la membrana basolateral o que entren en contacto directo con los componentes de la lámina propia, cambiando el fenotipo de tolerógeno a inmunogénica y causando la inflamación innecesaria y excesiva en la zona.

Hemos logrado la estimulación polarizada por un cilindro de encolado cueva que delimita la zona de estimulación en la cara apical de la mucosa como se describe en el protocolo. Se utilizó este modelo para examinar, entre otros, los efectos diferenciales de las tres cepas de lactobacilos diferentes. Se demuestra que este modelo de sistema es muy poderoso para evaluar las propiedades inmunomoduladoras de los probióticos en buenas condiciones de salud y la enfermedad.

Protocol

1. Obtención y preparación del tejido

  1. Se obtiene de tejido (sano o EII mucosa) durante la cirugía. Una vez que la muestra se extirpa transferencia al laboratorio tan pronto como sea posible, manteniéndolo en Ca + + / Mg + + tampón HBSS suplementado con penicilina / estreptomicina a 4 º C o en hielo.

* El tamaño de la muestra depende de la disponibilidad del tejido: la parte del tejido obtenido, es estrictamente lo que no se necesita para el diagnóstico y puede variar en gran medida entre sujetos sanos y EII. El tejido sano se escindió de los pacientes sometidos a cirugía por cáncer de colon.

  1. Lave el tejido suave y limpiarlo de todo el material mesentérica. Se separa la capa mucosa de la submucosa usando tijeras y pinzas estériles mientras se mantiene el tejido en tampón HBSS en una placa de Petri (no necesariamente sumergido). Toque la superficie de la mucosa con la pinza lo menos posible.
  2. Cortar mucosa en las rayas, al menos, 1 cm de ancho y el mayor tiempo posible. Utilice dos bisturís estériles, tanto como si estuviera cortando los alimentos.
  3. Lavar limpiar suavemente la mucosa en HBSS y se extienden sobre una placa de Petri con la parte apical hacia arriba.

2. Montaje del tejido

  1. Preparar medio fresco (tisDMEM). Utilizar DMEM suplementado con glutamina (2 mM) y NaPyr (1 mM), y añadir 15% de FBS-Na (suero bovino fetal - América del Norte), 1% SU-X y 200 ng / ml de EGF en el momento de uso.
  2. Llenar una placa Petri de 10 cm con el resto de la FBS-Na (utilizar alrededor de 30 ml de manera que las rejillas de metal serán completamente sumergidos) y sumerja las rejillas de metal. Mantenga la placa de abrir y apoyar los cilindros de plástico de su grifo.

* Las rejillas metálicas están hechas de hierro. La malla es de forma cuadrada con un lado de 0,5 mm.

  1. Tome 3 l de pegamento quirúrgico con un 10 o 20 l pipeta. Aplicar con cuidado a una de las fronteras de un cilindro de plástico mientras mantiene It fIRM con las pinzas.
  2. Colocar suavemente el cilindro en el lado apical de la mucosa, lo más cercano a uno de los bordes de la tira como sea posible.
  3. Para dar el tiempo de pegamento para unir firmemente el cilindro sobre el tejido, preparar la placa de cultivo de órganos de centro-así: Dispensar 850 l-1 ml de medio en el centro y así apoyar la rejilla de metal en los bordes del pocillo central de la placa.
  4. Cortar el exceso de tejido de los bordes del cilindro con dos escalpelos estériles como antes.
  5. Levante con cuidado el cilindro con el tejido adjunto y coloque el lado basolateral de la rejilla metálica en el centro de la placa.

3. Estímulo

  1. Utilice los estímulos de su elección en su concentración preferida.
  2. Aplicar volumen apropiado en el centro del cilindro de plástico sin perturbar el cilindro o la superficie de la mucosa con la punta de la pipeta. Asegúrese de que el volumen elegido cubre uniformemente la superficie interior del cilindro. Envolúmenes dicated:
    Large cilindro de plástico: 200 l
    Medio cilindro de plástico: 100 l
    Pequeño cilindro de plástico: 50 l
  3. Incubar durante un máximo de 3 horas en una incubadora convencional.

* Si desea incubar puntos temporales más largos, asegúrese de usar un volumen mucho menor de los estímulos (10-20 l) y colocar directamente el tejido en una atmósfera de 100% de O 2 en la presión de 1 atm (ver 3.5) .

  1. Tome el medio con los estímulos de la superficie apical de los tejidos y no sustituyen con un nuevo medio, debido a que el tejido no recibe suficiente O 2 si una gruesa capa de soporte en la cara apical impide el intercambio gaseoso. Cubra el plato.
  2. Coloque el tejido en una atmósfera de 100% de O 2 en la presión de 1 atm.

4. Cosecha

  1. Después de 24 horas de tiempo total de cultivo (± 2,5 h) retirar con cuidado el cilindro de thtejido de correo con la ayuda de un escalpelo pegamento raspando suavemente y almacenarlo en función del análisis deseado (fijar para inmunohistoquímica y / o ensayos de inmunofluorescencia, o congelamiento rápido en N2 líquido para la purificación de ARN y perfiles de expresión génica o la purificación de proteínas y ensayos de Western blot ).
  2. Se recoge el medio basolateral para el perfil de secreción de citoquinas. Centrifugar a 8000 rpm durante 7 min a los desechos de pellets, transferir el sobrenadante en un tubo Eppendorf (alternativamente alícuota) y almacenar inmediatamente a -20 ° C.

* Si desea mantener sobrenadantes durante más tiempo, guárdelas a -80 ° C.

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Representative Results

Hemos tenido éxito en el mantenimiento de la mucosa intestinal humana sana y EII en cultivo durante al menos 24 horas preservar el bienestar de los tejidos. De acuerdo con observaciones anteriores 1, esto sólo era posible si la mayoría del tiempo de cultivo (al menos el 85% del total) se llevó a cabo en O 2, como el tejido no sobrevivió durante 24 horas en incubadoras convencionales (Figura 2). También hemos demostrado que las diferentes respuestas de los explantes pueden ser observadas en este modelo en función de la polaridad de la estimulación (apical vs basolateral) y la inmunogenicidad de los estímulos 2,3.

El uso de este protocolo, se muestra que diferentes cepas probióticas pueden provocar respuestas diferentes por parte de los tejidos. Lactobacillus plantarum NCIMB8826 resultó ser sorprendentemente inmunogénica en el tejido sano. Al contrario de las otras dos cepas de lactobacilos, no sólo inducía la migración de las células linfoides a las salas de la superficie más superior de la mucosa, pero también significativamente upregulated una quimiocina relevantes a esta migración, CCl4, así como la IL-1b, una citoquina tradicionalmente relacionado con la actividad pro-inflamatoria. Para nuestra sorpresa, a pesar de que se había observado previamente una acción preventiva de L. paracasei en un modelo de ratón de la colitis 4, esto no se tradujo en un efecto curativo cuando se aplicaron bacterias vivas de esta cepa en el tejido inflamado EII. Más bien, las tres cepas demostraron ser perjudiciales cuando se utiliza en la EII la mucosa en la fase aguda de la enfermedad 2.

Además, se demostró que el producto metabólico de un probiótico, llamado postbiotic, es capaz de proteger el epitelio sano contra una cepa de Salmonella y no invasiva (FB62), mientras que al mismo tiempo aminora significativamente la inflamación cuando se aplica sobre la mucosa EII 2.

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Figura 1. Representación esquemática de la puesta a punto y las fotos. Una foto. Representación esquemática de la puesta en marcha se ve desde el lado, b. Representación esquemática de la puesta en marcha se ve desde la parte superior, c. De la rejilla de metal que se usa como soporte para el explante. Cuando se coloca correctamente, sólo el lado basolateral entra en contacto con la cámara de medio centro, d. Foto de todo el conjunto. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

La figura 2
Figura 2. El tejido sólo sobrevive cultura en O 2. Un tejido. Uncultured, fijado a la llegada de la sala de operaciones, 2, c. tejido cultivaron durante 24 horas en una incubadora convencional. Ampliación original: 5X.

Figura 3
Figura 3 El efecto de un estímulo pro-inflamatoria en los explantes C-: tejido no estimulado se cultivaron durante los puntos de tiempo indicados; Sal:.. Tejido desafió con Salmonella y se cultivaron durante los puntos de tiempo indicados. La destrucción de la capa superior del epitelio ya es visible en 2 h. El explante presenta extensa degeneración después de 24 horas. Ampliación original: 10 veces.

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Discussion

Mucho tiempo se ha hecho hincapié en la necesidad de modelos fisiológicamente relevantes en los que los tratamientos para la mucosa intestinal humana se pueden probar válida. Muchos investigadores han identificado artefactos y defectos tanto en la célula 5 y 6 modelos de ratón utilizado hasta ahora para tal fin. En efecto, a pesar de que los datos preclínicos prometedores se obtienen a menudo, éstos rara vez se traducen en un beneficio clínico significativo.

El método descrito en este trabajo, se presenta una adaptación relativamente simple, pero eficaz y novedoso a los protocolos existentes 7, 8 para la cultura y la estimulación de los explantes mucosa intestinal humana de una manera polarizada.

Este modelo podría proporcionar un excelente enfoque complementario para la generación de los datos pre-clínicos válidos antes de tomar un tratamiento potencial de cualquier tipo a las clínicas. Por lo tanto, los resultados clínicos desafortunados 9 podrían ser evitadas y los investigadores pudieron máspromover de forma segura tratamientos a las clínicas para el manejo de condiciones inflamatorias agudas.

Las principales ventajas del modelo son la posibilidad de comparar la estimulación polarizado versus no y para seguir la respuesta del tejido sobre un marco de tiempo de 24 horas. Un parámetro muy importante es que en todos los experimentos, los diferentes tratamientos se aplican en explantes procedentes del mismo paciente, que permite tomar en cuenta la variabilidad entre pacientes. El hecho de que los explantes son de un tamaño relativamente grande en comparación con biopsias también significa que una variedad de análisis se puede realizar en el mismo explante, lo que confirma los resultados de muchas maneras diferentes (ensayos de ELISA, rtPCRs cuantitativos, análisis de microarrays, inmunohistoquímica y / o inmunofluorescencia datos). Además, otros tipos de análisis podrían ser optimizados en el futuro, tales como la purificación de las poblaciones de células de interés a partir de explantes estimuladas y la evaluación de su fenotipo mediante análisis citofluorimétricosis.

Sin embargo, también hay limitaciones importantes que deben tenerse en cuenta. En su forma actual, este modelo no es adecuado para el cribado de alto rendimiento de un gran número de tratamientos, ya que se basa en la disponibilidad del tejido. Modelos de cultivo de células son probablemente más adecuados para ese propósito ya que son más fáciles de manejar y llevar a cabo un gran número de estimulaciones en 10 mientras que el modelo se describe de manera más eficiente sería utilizado como la prueba final de los tratamientos candidatos antes de entrar en las clínicas. Por otra parte, el marco de tiempo durante el cual hemos tenido éxito para preservar la viabilidad del tejido no permite experimentos que requieren períodos de seguimiento largos, tales como interferencia de ARN. Por último, la estimulación bacteriana se lleva a cabo en una incubadora regular y no permite preservar o probar el efecto de las bacterias anaerobias. Es nuestra intención de trabajar sobre estos temas en el futuro.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Damos las gracias a Erika Mileti para un excelente soporte técnico y el Dr. Antonio Di Sabatino para proporcionar las cámaras de oxígeno.

Financiación: Este trabajo fue apoyado por becas de los programas marco de la UE séptimo (IBDase, ERC: Dendroworld) y Fondazione Cariplo a MR y el apoyo de una red Marie Curie de Formación Internacional Movilidad (Cross-Talk, del acuerdo de subvención n º: 21553-2) para KT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
10X HBSS Eurocalne ECM4006XL
Peni/Strepto Lonza DE17602E
Gentamycin Gibco 15750-037
DMEM Lonza BE12614
FBS-Na Gibco 16000-044
100X ITS-X Gibco 51500-056
EGF Tebu-bio 100-15
L-Glutamine Lonza BE17605E
Non essential aminoacids 100X Gibco 11140-035
NaPyr Gibco 11360-039
Materials
Cloning cylinders 6x8 mm BellCo 2090-00608
Cloning cylinders 8x8 mm BellCo 2090-0080
Cloning cylinders 10x10 mm BellCo 2090-01010
Metal grids Home made
Centre well organ culture plate BD Falcon 353037
Surgical glue (Vetbond) 3M 1469SB
Oxygen Jars Home made
Oxygen tanks Air Liquid Sanità

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References

  1. Schuller, S., Lucas, M., Kaper, J. B., Giron, J. A., Phillips, A. D. The ex vivo response of human intestinal mucosa to enteropathogenic Escherichia coli infection. Cell. Microbiol. 11, 521-530 (2009).
  2. Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. (2012).
  3. Tsilingiri, K., Rescigno, M. Should probiotics be tested on ex vivo organ culture models? Gut Microbes. Manuscript in preparation (2012).
  4. Mileti, E., Matteoli, G., Iliev, I. D., Rescigno, M. Comparison of the immunomodulatory properties of three probiotic strains of Lactobacilli using complex culture systems: prediction for in vivo efficacy. PLoS One. 4, e7056 (2009).
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  7. Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J. Anat. 134, 459-469 (1982).
  8. Browning, T. H., Trier, J. S. Organ culture of mucosal biopsies of human small intestine. J. Clin. Invest. 48, 1423-1432 (1969).
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  10. Lakhdari, O., et al. Identification of NF-kappaB modulation capabilities within human intestinal commensal bacteria. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 282356 (2011).

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