La protéine plate-forme de production complexe MultiBac à l'EMBL

1EMBL Grenoble Outstation and Unit of Virus Host Cell Interactions (UVHCI) UMR5322
Biology

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Summary

complexes de protéines catalysent les fonctions cellulaires essentielles. Caractérisation fonctionnelle et structurale détaillée de nombreux complexes essentielles nécessite la production recombinante. MultiBac est un système cellulaire baculovirus / insecte particulièrement adaptées pour l'expression de protéines eucaryotes et de leurs complexes. MultiBac a été mis en œuvre comme une plate-forme en libre accès, et les procédures d'exploitation normalisées développés afin de maximiser son utilité.

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Berger, I., Garzoni, F., Chaillet, M., Haffke, M., Gupta, K., Aubert, A. The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL. J. Vis. Exp. (77), e50159, doi:10.3791/50159 (2013).

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Abstract

La recherche en protéomique a révélé la complexité impressionnante de protéomes eucaryotes de détail sans précédent. Il est maintenant une notion communément admise que les protéines dans les cellules existent surtout pas comme des entités isolées, mais exercent leur activité biologique en association avec de nombreuses autres protéines, chez l'homme dix ou plus, formant des lignes d'assemblage dans la cellule pour la plupart, sinon toutes les fonctions vitales. 1 , 2 Connaissance de la fonction et de l'architecture de ces assemblages multiprotéiques nécessite leur disposition dans une qualité supérieure et en quantité suffisante pour une analyse détaillée. La rareté des nombreux complexes de protéines dans les cellules, en particulier chez les eucaryotes, interdit leur extraction à partir de sources indigènes, et nécessite la production recombinante. Le système de vecteur d'expression de baculovirus (BEVS) s'est avérée particulièrement utile pour produire des protéines eucaryotes, dont l'activité repose souvent sur le traitement post-traductionnelle que d'autres systèmes d'expression couramment utilisés peuvent souventpas en charge. 3 BEVS utiliser un baculovirus recombinant dans lequel le gène d'intérêt a été inséré à infecter des cultures de cellules d'insectes qui à leur tour produisent la protéine de choix. MultiBac est un BEVS qui a été particulièrement adaptée pour la production de complexes protéiques eucaryotes qui contiennent de nombreux sous-unités. 4 A condition sine qua non pour une production efficace de protéines et de leurs complexes sont des protocoles robustes pour toutes les étapes d'une expérience d'expression qui peut idéalement être mis en œuvre procédures d'utilisation normalisées (SOP) et suivie également par des utilisateurs non spécialistes avec une relative facilité. La plate-forme MultiBac au Laboratoire européen de biologie moléculaire (EMBL) utilise SOP pour toutes les étapes d'une expérience d'expression de complexes multi, à partir de l'insertion des gènes dans un génome baculoviral ingénierie optimisé pour les propriétés de production de protéines hétérologues à l'analyse à petite échelle de la protéine spécimens produits. 5-8 La plate-formeest installé dans un mode libre accès à l'EMBL de Grenoble et a soutenu de nombreux scientifiques du monde universitaire et de l'industrie pour accélérer les projets de recherche complexes protéiques.

Introduction

L'activité biologique est contrôlé par des assemblages de protéines et d'autres biomolécules qui agissent de concert pour stimuler les fonctions cellulaires. Parmi les exemples notables comprennent les machines qui transcrit l'information héréditaire contenue dans l'ADN en ARN messager. Chez l'homme, plus de 100 protéines sont réunis dans un processus défini et réglementé pour transcrire les gènes, formant de grands complexes multi avec 10 et plusieurs sous-unités dont l'ARN polymérase II et les facteurs généraux de transcription tels que TFIID, TFIIH et autres. 9 D'autres exemples sont l' ribosome, constitué de plusieurs protéines et des molécules d'ARN, qui catalyse la synthèse des protéines, ou le complexe de pore nucléaire qui est responsable de la navette biomolécules à travers l'enveloppe nucléaire chez les eucaryotes. Une dissection architectural et biochimique détaillée de la quasi-totalité des machines multi dans la cellule est essentiel de comprendre leur fonction. L'élucidation de la structure de procaryotes et eukarribosomes yotic, par exemple, constituent des événements de cachet donnant un aperçu sans précédent dans la façon dont ces machines macromoléculaires exercent leurs fonctions désignées dans la cellule. 10,11

Les ribosomes peut être obtenue en qualité et en quantité suffisante pour une étude détaillée de la purification de la matière endogène à partir de cellules en culture, en raison du fait que jusqu'à 30% de la masse cellulaire se compose de ribosomes. ARN polymérase II est déjà moins abondante par des ordres de grandeur, et plusieurs milliers de litres de culture de levure ont dû être traitées pour obtenir une vue atomique détaillée de ce complexe essentiel au cœur de la transcription. 12 L'écrasante majorité des autres complexes essentiels sont toutefois présents dans des quantités beaucoup plus faibles dans les cellules natives, et ne peuvent donc pas être purifiés de manière adéquate à partir de sources d'origine. Pour rendre ces complexes accessibles à l'analyse structurale et fonctionnelle détaillée nécessite la production hétérologue en utilisant te recombinantchniques.

Production de protéines recombinantes a eu un impact majeur sur la recherche en sciences de la vie. De nombreuses protéines ont été produites par recombinaison, et leur structure et leur fonction disséqués à haute résolution. Programmes de génomique structurale ont profité de l'élucidation de ces génomes de nombreux organismes pour s'attaquer au répertoire de produits de gènes d'organismes entiers en mode haut débit (HT). Des milliers de structures de protéines ont ainsi été déterminés. À ce jour, le système le plus prolifique utilisée pour la production de protéines recombinantes a été E. coli, et de nombreux systèmes d'expression ont été développées et affinées au fil des ans pour la production hétérologue dans cet hôte. Les plasmides hébergeant une multitude de fonctionnalités pour permettre la production de protéines dans E. coli remplir catalogues entiers de fournisseurs commerciaux.

Toutefois, E. coli a certaines limites qui la rendent impropre à produire de nombreuses protéines eucaryotes et en pcomplexes protéiques articulaires avec plusieurs sous-unités. Par conséquent, la production de protéines dans des hôtes eucaryotes est devenu de plus en plus la méthode de choix au cours des dernières années. Un système particulièrement bien adapté pour produire des protéines eucaryotes est le système de vecteur d'expression de baculovirus (BEVS) qui s'appuie sur un baculovirus recombinant portant les gènes hétérologues pour infecter des cultures de cellules d'insectes cultivées en laboratoire. Le système MultiBac est un BEVS plus récemment mis au point qui est particulièrement adaptées pour la production de complexes protéiques eucaryotes avec de nombreux sous-unités (Figure 1). MultiBac a été introduite en 2004. 13 Depuis son introduction, MultiBac a été constamment affiné et rationalisé pour simplifier la gestion, améliorer la qualité de la protéine cible et généralement rendre le système accessible à des utilisateurs non spécialistes de la conception des procédures d'exploitation normalisées efficaces (SOP). 4 MultiBac a été mis en place dans de nombreux laboratoires du monde entier, en acAdemia et de l'industrie. A l'EMBL à Grenoble, les programmes d'accès transnationaux ont été mis en place par la Commission européenne pour fournir une formation spécialisée sur la plateforme MultiBac pour les scientifiques qui souhaitent utiliser ce système de production pour faire avancer leurs recherches. La structure et la fonction de nombreux complexes protéiques qui n'étaient jusque-là pas accessible a été élucidée à l'aide d'échantillons produits avec MultiBac. 4 Dans la suite, les étapes essentielles de la production MultiBac sont résumées dans les protocoles qu'ils sont en opération à l'installation MultiBac à l'EMBL de Grenoble.

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Protocol

1. Tandem recombineering (TR) pour créer des constructions d'expression multigénique

  1. Planification de la stratégie de co-expression. approche de conception pour insérer vos gènes d'intérêt en donneurs et accepteurs. Sous-modules physiologiques potentiels de votre complexe doivent être regroupés sur accepteurs et donneurs spécifiques. Utilisez module de multiplication composée de endonucléase Homing (HE) - paires BstXI de combiner des cassettes d'expression sur différents donateurs et des plasmides d'accepteurs 7,8 Créer toutes les constructions pertinentes in silico et valider la stratégie complètement avant de procéder à des travaux expérimentaux.. Par exemple, des gènes d'intérêt doivent être vérifiés ne contiennent pas de SE ou d'autres sites de restriction et la présence de cadres de lecture ouverts (ORF correctes) doit être validée. Pensez à commander des gènes synthétiques optimisés pour les insectes usage des codons de la cellule et la structure secondaire de l'ARNm pour améliorer les niveaux de production de protéines ainsi que la suppression de toute exiHE sites à partir des gènes d'intérêt piquer. Pensez à placer des étiquettes de purification basé sur les données de la littérature sur N-ou flexibles ou exposés extrémités C-terminales des protéines de vos choix. Envisager d'appliquer des stratégies de polyprotéine qui visent à produire plusieurs sous-unités protéiques dans votre complexe si les quantités relatives de protéines individuelles doivent être contrôlés en raison de problèmes de stœchiométrie dans le complexe. 4 Préparez détaillées "How-To" documents (cahier de laboratoire électronique est recommandé) contenant toutes les mesures expérimentales prévus du projet menant à la construction multigénique complète (s). Créer des fichiers électroniques des plasmides fusionnés Cre-loxP par exemple en utilisant le logiciel Cre-ACEMBLER qui peut être téléchargé à partir de la page d'accueil Berger groupe ( multiexpression_technologies www.embl.fr/multibac/ / cre-acembler ).
  2. Insérez vos gènes d'intérêt dans certains bailleurs de fonds etAccepteurs en utilisant des enzymes de restriction et la ligase, ou encore en utilisant des méthodes indépendantes de ligature en suivant des protocoles publiés 5,6,14. Si vous avez accès à une manipulation de liquides poste de travail et si vous prévoyez un grand nombre de constructions doit être généré ( par exemple pour des approches combinatoires) considèrent l'utilisation de scripts robotique développés et mis en œuvre par le groupe Berger (Figure 2). 14,15 Si une manipulation de liquides poste de travail n'est pas disponible, le mode manuel en utilisant microplaques permet l'insertion d'un gène dans un HT comme la mode.
  3. Les contraintes imposées par la nécessité de contrôler la stoechiométrie des sous-unités exprimées peuvent se matérialiser. Dans le cas des niveaux d'expression déséquilibre stoechiométrique de sous-unités individuelles d'un complexe protéique, envisager d'appliquer des stratégies de la polyprotéine de conjoindre plusieurs sous-unités de votre complexe et une protéase spécifique (par exemple le tabac etch virus NIa protéase) au seul grand ORF espacés de sles sites protéolytiques particulières d'intervention. 4,8 considérer co-exprimant un ou plusieurs polypeptides, avec des cassettes d'expression simples si vous avez un très grand complexe avec de nombreuses sous-unités et largement allant des poids moléculaires de sous-unités individuelles. Considérez co-exprimant plusieurs gènes codant pour la même protéine dans une polyprotéine ou plusieurs cassettes d'expression identiques si cette protéine est caractérisée par faible rendement de production. 4,13
  4. Validez toutes les constructions donneur et accepteur clonés par cartographie de restriction (éventuellement en haut débit) et le séquençage. Procéder à fusionner combinaisons donneur-accepteur par Cre-loxP recombinaison pour produire les constructions d'expression multigénique de choix. Valider plasmides de fusion accepteur-donneur purifiée par cartographie de restriction, utiliser des séquences électroniques créés par Cre-ACEMBLER ou des programmes similaires comme référence.
  5. Stocker donateurs purifiés et validé, des accepteurs et des fusions donneur-accepteur à -20 ° C ou -80 ° C. Archive plasmids et leurs séquences (Microsoft Excel, Filemaker, autres) avec soin pour un usage ultérieur.

2. Multigénique Composite baculovirus production, l'amplification et le stockage

  1. Intégrer les vecteurs de transfert de multigéniques le génome baculoviral MultiBac en se transformant en cellules DH10 hébergeant le génome viral et les fonctionnalités requises pour Tn7 transposition. Notez que le génome baculoviral MultiBac peut être préchargé avec des gènes d'intérêt particulier (YFP marqueur, accompagnateurs, etc) dans son propre site LoxP (conçu dans le génome distal du site de fixation Tn7) par une in vivo Cre réaction précédant Tn7 intégration. 13 Après Tn7 transposition, les cellules avec baculovirus composite contenant les gènes d'intérêt sont sélectionnés par criblage bleu / blanc (succès Tn7 résultats de transposition en perte d'α-complémentation de la β-galactosidase, par conséquent, les colonies ayant correct Tn7 transposition restent blanches sur sélectif uneplaques gar contenant X-gal) et le génome est préparé par lyse alcaline et de l'éthanol / précipitation à l'isopropanol. 5,6
  2. La transfection et la production de virus initial. Plaque de culture tissulaire à 6 puits lieu dans hotte stérile. De Sf21 culture de cellules d'insecte log-de phase, semence aliquotes de cellules dans les puits et transfectées par l'ajout du génome baculoviral purifiée et un réactif de transfection mélangés dans un milieu de culture tel que décrit. 6 récolte de virus initial après 48-60 heures en retirant les médias ( de haute qualité, faible titre virus V 0, typiquement de 3 ml par puits). Supplément milieux frais et essais pour la production de protéines (et, si un marqueur YFP est présent, par fluorescence) après encore 2-3 jours. 6,7
  3. Amplification du virus, faible MOI régime. Utilisez V 0 virus d'infecter 25-50 ml de cellules en phase log (densité cellulaire <1x10 6 cellules par ml) dans un petit (100-250 ml) Erlenmeyer shaker flacons agitéssecoueurs sur des plates-formes orbitales (Figure 3). Compter les cellules et diviser chaque h 24 jusqu'à ce que les cellules cessent de doublement (prolifération arrestation). Suivre un régime faible MOI (multiplicité d'infection à savoir le nombre de particules virales par cellule): Les cellules doivent doubler (au moins) une fois (MOI <1), sinon répéter l'expérience avec un petit volume de V 0 ajouté. Normalement, 3 ml de V 0 sont utilisés pour infecter 25 ml de cellules d'insecte Sf21 à une densité de 0.5x10 6 cellules / ml. Cela est essentiel pour prévenir préjudiciable sur-amplification et l'auto-suppression de virus qui peut entraîner la perte des gènes hétérologues d'intérêt. Récolte V 1 virus (25-50 ml) après 48-60 heures par granulation cellules et enlever le support contenant le virus. Supplément par des milieux frais et essai pour YFP et la production de protéines en éliminant les cellules 1x10 6 toutes les 12 ou 24 heures, la granulation et la validation de la production de protéines et de signal de la protéine marqueur (YFP). 6 Amplifier virus (àV 2) plus loin si des volumes plus importants d'expression visent à en infectant jusqu'à 400 ml de cellules dans 2 L shaker flacons avec V 1 virus respect de ce qui précède bas régime MOI (cellules doivent doubler au moins une fois après l'infection par V 1). Rigoureusement tester la production de protéines et de signal de protéine de marquage pendant l'amplification afin d'éviter l'accumulation des virus défectifs ne contenant plus les gènes d'intérêt. Culots cellulaires d'utilisation 5-7 accumulant à chaque amplifications étape déjà pour l'établissement de protocoles de purification pour le complexe de protéine d'intérêt exprimée.
  4. Stockage BIIc du virus de la production. Nous vous recommandons fortement de stocker virus V 2 comme le virus de la production en utilisant le BIIc (B aculovirus-i nfected i nsect c aunes) méthode, pour empêcher toute modification (par exemple la perte du gène d'intérêt) du virus recombinant et de préserver une forte expression niveaus 16 cellules infectées Pellet 24 heures après l'arrestation de prolifération est observée -. A ce stade les cellules contiennent des particules virales complètes, juste avant qu'ils seraient libérés (par bourgeonnement) dans les médias. Retirez les médias et des aliquotes de gel de le culot cellulaire dans de l'azote liquide et conserver indéfiniment. 7,16

3. la production de protéines et de traitement en aval

  1. Infectant les grandes cultures (R) et le suivi YFP. Utilisez V 1, V 2 ou portions BIIc congelés pour infecter les grandes cultures cellulaires pour les cycles de production (typiquement 400 ml dans des flacons 2 L). Adhérer à bas régime MOI (régler le volume du virus utilisé pour l'infection tels que la culture infectée double au moins une fois). Agrandir volumes de culture infectés si nécessaire selon le nombre de flacons de se multiplier. Si protéine marqueur YFP est présent, retirer à intervalles cellules 1x10 6 définies, granulés et lyse des cellules et de suivre l'évolution du signal YFP jusqu'à atteindre un plateau indintoxicantes production maximale de protéines recombinantes. YFP niveaux peuvent être mesurés dans un lecteur de plaques à puits norme 96 capable d'enregistrer des signaux de fluorescence (par exemple Tecan Spectrafluor). Récolte des cellules à ce stade. culots cellulaires de conserver à -20 ° C (à court terme) ou -80 ° C (à long terme).
  2. La lyse des cellules et le fractionnement. Lyse des cellules par votre méthode préférée de choix, adaptés aux exigences de votre protéine (gel-dégel, ultrasons, presse française, et autres). 5-7 cytosol Fractionner et noyaux et à vérifier la présence de vos protéines d'intérêt. Développer des protocoles de purification basé sur les résultats afin de simplifier la purification des protéines. Envisager d'appliquer les procédures de trempage pour extraire vos protéines de la fraction nucléaire dans des conditions de KCl élevés si vos protéines se trouvent dans le noyau. 7,18
  3. La purification des protéines (micro-échelle, à grande échelle). Notez que souvent de petits volumes (10 ou 25 ml) de culture cellulaire sont suFFICIENT pour obtenir des culots de cellules pour la purification de quantités substantielles de vos protéines d'intérêt en raison des niveaux généralement élevés ou très élevés production de protéines hétérologues dans les systèmes cellulaires baculovirus / insecte (souvent 10-100 mg de protéine par litre culture et plus). En conjonction avec micro-purification (plaques à puits multiples, les méthodes micro-pointes, système GE Healthcare ÄKTAmicro, d'autres), il est possible d'obtenir des données biochimiques et de l'activité et souvent aussi quantité suffisante de protéines et de complexes souhaités pour nanolitre échelle cristallisation à haut débit (HTX ). Envisager d'utiliser la purification par affinité de métal (Clonetech Takara TALON, résines Qiagen NiNTA métalliques chélateurs) et un oligo-histidine (6-10 résidus) tag sur les sous-unités exposées de votre protéines complexes pour faciliter la purification, en liaison avec l'échange d'ions et chromatographie d'exclusion de taille en petits volumes en utilisant par exemple le ÄKTAmicro ou une petite machine de purification de volume similaire (Figure 4

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Representative Results

Co-expression forte de protéines hétérologues obtenus par le système MultiBac est illustré à la figure 1d (sondes prises 48 heures après l'infection d'une culture de cellules en suspension). Les bandes de protéine surexprimée est clairement perceptible dans l'ensemble extrait cellulaire (SNP) et le lysat clarifié (SN). La qualité et la quantité de la matière protéique produite est souvent suffisante pour permettre la détermination de la structure des complexes de protéines, telles que le point de contrôle mitotique complexe MCC représenté sur la figure 1e. 17

La figure 2 montre le flux de travail d'une expérience d'assemblage de gène par recombineering tandem assistée par robot (TR). Protocoles d'assemblage d'ADN robustes ont été écrits dans la routine robotique pour l'assemblage parallélisée de constructions d'expression multigénique. Les différentes étapes robotiques sont présentés dans instantanés (figure 2c, I - IV). Les composants de l'ADN à assembler sont générés par PCR et la qualité contrôlée pare-gels (figure 2d, à gauche), les constructions multigéniques assemblés sont également validé par PCR avec des jeux spécialement conçus d'amorces (figure 2d, à droite) 14,15.

La production d'un baculovirus recombinant et l'amplification suit les procédures d'utilisation normalisées (affiché schématiquement sur ​​la Figure 3a). Instantanés de cellules cultivées en monocouche sont présentés (Figure 3b, I. et II.) Suite à une infection par un virus MultiBac.

Le traitement en aval des complexes de protéines recombinantes peut être miniaturisé par chromatographie multi-puits-plaque ou microtip basée pour la purification d'affinité suivie par chromatographie d'exclusion de taille (SEC) des complexes en intégrant dans les systèmes à petite échelle de flux de travail tels que l' ÄKTAmicro (figure 4a). Un profil représentatif SEC d'un 700 humain complexe de facteurs de transcription kDa ~ est affiché. Extrait purifié en utilisantle ÄKTAmicro en petite échelle est généralement suffisante pour la caractérisation par des moyens biochimiques et biophysiques, y compris la microscopie électronique (figure 4b).

Figure 1
Figure 1. Plate-forme technologique MultiBac pour la production de complexes multi. (A) les gènes d'intérêt sont intégrés dans le génome de baculovirus MultiBac en utilisant Tn7 transposition en conjonction avec le dépistage bleu / blanc. Un site loxP sur le squelette du virus permet addition d'autres fonctionnalités comme une protéine marqueur fluorescente pour surveiller les performances du virus et la production de protéines hétérologues. (B) Le baculovirus adopte une forme de bâton allongé et se caractérise par une enveloppe souple qui peut augmenter pour s'adapter à la grand génome (> 130 kb) circulaire d'ADN double brin. Les grandes insertions de gènes hétérologues dans le génome sont tolérés by allonger l'enveloppe. (c) standard erlenmeyers sur les plateformes agitateur peuvent être utilisés pour la culture des cultures de cellules d'insectes à grande échelle pour la production de protéines de heterologues. (d) Le système MultiBac produit efficacement des protéines recombinantes qui sont souvent clairement visible déjà dans l'ensemble- extrait cellulaire (SNP). (e) La structure du complexe checkpoint mitotique a été élucidée par diffraction des rayons X de cristaux cultivés à partir de l'échantillon réalisé avec le système MultiBac. 17 Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2
Figure 2. (Automated) Tandem recombineering (TR). (A) Tandem recombineering utilise de petits ensembles de molécules d'ADN plasmidique synthétique appelé donneurs et accepteurs d'assemblage multconstructions d'expression de igene, éventuellement en mode assistée par robot en utilisant un traitement liquide du poste de travail (à droite). (b) Le workflow TR est affiché. SLIC est synonyme de séquence et la ligature clonage indépendant, Cre représente la fusion donneurs et accepteurs Cre-loxP concaténation dans lequel les gènes d'intérêt ont été insérés par SLIC. expression multigénique constructions générées par cette procédure recombineering utilisant SLIC et Cre en tandem sont ensuite intégrés dans le génome du baculovirus MultiBac et utilisé pour l'expression petite et grande échelle dans des cultures de cellules d'insectes infectées par le virus recombinant. (c) Instantanés de la TR assistée par robot Procédé sont présentés y compris la fourniture d'ADN matrice et les amorces (I), la préparation des réactions de PCR dans des plaques multipuits (II), l'amplification par PCR d'ADN (III) et la préparation des multigénique constructions cultivé en culture de bactéries par lyse alcaline dans des plaques multi-puits ( IV). (d) les produits de PCR utilisées pour TR sont visualisés par nousment le système e-gel (à gauche). Constructions multigéniques remplis sont validés par des réactions d'analyse PCR chargés sur un e-gel (à droite). Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 3
Figure 3. MultiBac génération de virus, l'amplification, le stockage. (A) La procédure d'exploitation standard (SOP) de la plate-forme MultiBac à l'EMBL Grenoble est représenté dans une vue schématique. Le virus recombinant MultiBac est identifiée par criblage bleu-blanc et préparé à partir de cultures bactériennes. Transfection initiale se déroule sur des plaques à 6 puits ensemencés avec des monocouches de cellules d'insectes (Sf21, Sf9, Hi5, autres). Virus est amplifié et protéines cibles produites dans secoueurs Erlenmeyer. Le virus est stocké par portions de congélation de cellules d'insectes infectées (BIIc). Fluorescence est enregistré comme un outil analytique siYFP (ou d'une autre protéine fluorescente) a été intégré en tant que protéine marqueur, par exemple dans le site loxP présents sur le génome de baculovirus MultiBac. (B) instantanés de cellules d'insectes infectées par le baculovirus MultiBac sont présentés. Les cellules arrêtent de proliférer, augmentation de la taille (I.). Les fusions cellulaires sont observées (II). Virus bourgeonné hors des cellules infectées dans les médias sont recueillis et utilisés pour infecter les grandes cultures cellulaires pour la production complexe protéique (III, IV). Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 4
Figure 4. La production de protéines complexes et de traitement en aval. Échantillon complexe de protéines peuvent être déjà bien purifiés à partir de cultures cellulaires initiales à petite échelle en utilisant des méthodes de purification miniaturisés tels que multiplis ou microtip-purification base, éventuellement en association avec des systèmes de chromatographie de petit volume (à gauche). Souvent, le rendement de ces pistes déjà de purification «analytiques» (au milieu) est suffisante pour analyser la structure et la fonction du complexe purifié par une variété de moyens, y compris la microscopie électronique (à droite). Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Discussion

Vidéo instantanés sur les figures 2 et 3 illustrent l'ensemble du processus de production assistée par robot à partir d'ADNc d'expression multigénique construit tout le chemin à l'infection des cultures de cellules d'insectes pour la production de protéines. Nouveaux réactifs (plasmides et virus) et les protocoles robustes ont été développés pour permettre une conduite en s'appuyant sur SOP. L'ensemble du pipeline a été mis en œuvre comme une technologie de plate-forme à l'EMBL à Grenoble. La plate-forme MultiBac a été consultée par de nombreux scientifiques universitaires et industriels qui sont engagés dans la recherche de multiprotein. L'accès à la formation est prise en charge par les programmes d'accès spécialisés financés par la Commission européenne (P-CUBE, BioSTRUCT-X).

La disponibilité des modes opératoires normalisés pour mener à bien l'expression complexe de protéines en utilisant le système MultiBac a rendu cette technologie se prête facilement aussi à des utilisateurs non spécialistes. Opération assistée par robot accélère la production de complexes multi notamculier quand un nombre suffisamment grand de complexes, par exemple des variants et mutants d'un échantillon d'intérêt, doivent être générés en parallèle. Cependant, le fonctionnement manuel à faible débit à moyen aussi de grands avantages de la disponibilité des modes opératoires normalisés. Dans notre expérience, les processus qui pourraient être scénarisées avec succès dans la routine robotique devait être affiné premier avec un effort significatif jusqu'à protocoles suffisamment robustes ont été obtenus qui sont compatibles avec l'utilisation d'un robot. Ces protocoles constituent la base de nos modes opératoires normalisés. 5,6,14,15 En effet, la mise en œuvre de ces protocoles robustes pour le robot mener à un gain d'efficacité considérable aussi d'opérations manuelles dans notre laboratoire.

Beaucoup de protéines et de complexes protéiques ont été et sont produites en utilisant le système MultiBac que nous avons développé, et près de 500 laboratoires dans le monde ont obtenu des réactifs. MultiBac a catalysé la recherche non seulement dans la biologie structurale, mais aussi dans de nombreux OTHzones er sciences de la vie qui enquêtent ou exploiter les interactions entre protéines dans les grands ensembles. MultiBac a également été utilisé pour produire des protéines cibles d'intérêt pharmacologique considérable, y compris des particules pseudo-virales, qui peuvent devenir des candidats vaccins utiles. 4 Plus récemment, MultiBac a également été utilisé pour délivrer des gènes dans les cellules de mammifères et des cultures cellulaires, voire d'organismes entiers en la thérapie génique. 4 Nous prévoyons que des approches telles que celles illustrées dans cette contribution se révéleront utiles pour de nombreux domaines de la recherche impliquant des assemblages multiprotéiques et l'interaction complexe de macromolécules biologiques qui forment la base de processus cellulaires chez la santé et la maladie.

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Disclosures

IB est l'inventeur sur les brevets et demandes de brevet décrivant les pièces de la technologie décrite ici.

Acknowledgements

Nous remercions Christoph Bieniossek, Simon Trowitzsch, Daniel Fitzgerald, Yuichiro Takagi, Christiane Schaffitzel, Yvonne Hunziker, Timothy Richmond et à tous les membres passés et présents du laboratoire Berger de l'aide et des conseils. La plate-forme MultiBac et son développement ont été et sont généreusement financés par des organismes de financement, notamment le Fonds national suisse (FNS), l'Agence Nationale de Recherche (ANR) et le Centre National de Recherche Scientifique (CNRS) et la Commission européenne (CE) dans les programmes-cadres (PC) 6 et 7. Soutien à l'accès transnational est fourni par les projets du 7e PC CE P-CUBE ( www.p-cube.eu ) et BioSTRUCT-X ( www.biostruct-x.eu ). Le ministère français des sciences est particulièrement reconnu pour soutenir la plate-forme MultiBac à l'EMBL à travers l'Investissement d'Avenir projet FRISBI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bluo-Gal Invitrogen 15519-028 (1 g)
Tetracycline Euromedex UT2965-B (25 g) 1,000X at 10 mg/ml
Kanamycine Euromedex EU0420 (25 g) 1,000X at 50 mg/ml
Gentamycine SIGMA G3632 (5 g) 1,000X at 10 mg/ml
IPTG Euromedex EU0008-B (5 g) 1,000X at 1M
Cre-recombinase New England BioLabs M0298
X-Treme GENE HP transfection reagent Roche 06 366 236 001
Hyclone SFM4 Insect Thermo Scientific SH 30913.02
6-well plate Falcon Dominique Dutscher 353046
2 ml pipette Falcon Dominique Dutscher 357507
5 ml pipette Falcon Dominique Dutscher 357543
10 ml pipette Falcon Dominique Dutscher 357551
25 ml pipette Falcon Dominique Dutscher 357535
50 ml pipette Falcon Dominique Dutscher 357550
50 ml tube Falcon Dominique Dutscher 352070
15 ml tube Falcon Dominique Dutscher 352096
1.8 ml cryotube Nunc Dominique Dutscher 55005
100 ml shaker flasks Pyrex Dominique Dutscher 211917
250 ml shaker flasks Pyrex Dominique Dutscher 211918
500 ml shaker flasks Pyrex Dominique Dutscher 211919
2 L shaker flasks Pyrex Dominique Dutscher 211921
Certomat Orbital Shaker + plateau Sartorius 4445110, 4445233
Liquid nitrogen tank dewar 35 L Fisher Scientific M76801
Biological Safety Cabinet Faster Sodipro FASV20000606
Optical Microscope Zeiss 451207
Sf21 Insect cells
Hi5 Insect cells Invitrogen B855-02
Tecan freedom EVO running Evoware plus TECAN
10 μl conductive tips (black), TECAN 10 612 516
200 μl conductive tips (black) TECAN 10 612 510
disposable trough for reagents, 100 ml TECAN 10 613 049
twin.tec PCR plate 96, skirted Eppendorf 0030 128.648
96 well V bottom, non sterile BD falcon 353263
96 deepwell plate color natural, PP) Fisher M3752M
PS microplate, 96 well flat bottom Greiner 655101
96 deepwell plate Thermo scientific AB-0932
24 well blocks RB Qiagen 19583
DpnI restriction enzyme NEB R0176L 20 U/uL
NEBuffer 4 10X NEB B7004S
2X phusion mastermix HF Finnzyme ref F-531L
2X phusion mastermix GC Finnzyme ref F-532L
DGLB 1.5X homemade 7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF
High DNA Mass Ladder for e-gel Life Technologies 10496-016
Low DNA Mass Ladder for e-gel Life Technologies 10068-013
E-gel 48 1% agarose GP Life Technologies G8008-01
Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit Macherey Nagel 740 708.24
PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract Macherey Nagel 740 707.2
Gotaq green master mix Promega M7113
T4 DNA polymerase, LIC-qualified Novagen 70099-3
DTT 100 mM homemade
Urea 2 M homemade
EDTA 500 mM pH 8.0 Homemade
LB broth (Miller) 500 g Athena ES 103

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References

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