וגם בידוד Immunostaining ימפוציטים ותאי דנדריטים מהתיקונים של Peyer Murine

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

יש התעניינות הולכת וגובר בהבנת הפונקציות החיסוניות של אוכלוסיות מסוימות של תאים בתיקונים של Peyer (PPS), אתרים אינדוקטיביים העיקריים של רקמות הלימפה מעיים כרוכות בכך. כאן אנו מתארים פרוטוקולים מקבילים להכנת PP הכנות תא בודדות לניתוח cytometric זרימה וcryosections PP לimmunostaining.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches. J. Vis. Exp. (73), e50167, doi:10.3791/50167 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

הטלאים של Peyer (PPS) הם רכיבים בלתי נפרדים מרקמות הלימפה מעיים הקשורים (גאלט) ולשחק תפקיד מרכזי בimmunosurveillance והומאוסטזיס מעיים. אנטיגנים חלקיקים וחיידקים בחלל המעי נדגמים ברציפות על ידי תאי PP ז אפיתל זקיק המשויך (Fae) והועברו לרשת בסיסית של תאים דנדריטים (DCS), מקרופאגים ולימפוציטים. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקולים בי PPS Murine הם (אני) ניתק להשעיות תא בודדות ונתון לcytometry הזרימה (ii) שהוכן עבור cryosectioning וimmunostaining. עבור cytometry זרימה, PPS הם מכאני ניתק ולאחר מכן מסונן דרך 70 מיקרומטר ממברנות ליצור השעיות תא בודדות ללא תאי אפיתל ופסולת גדולים. החל עם 20-25 PPS (מארבעה עכברים), שיטה מהירה ולשעתק זו מניבה אוכלוסייה> 2.5 x 10 6 תאים עם> 90% כדאיויות תא. לcryosectioning, טריPPS ly המבודד שקוע בטמפרטורה בינונית אופטימלי חיתוך (אוקטובר), Snap-קפוא בחנקן נוזלי, ולאחר מכן נותח באמצעות cryomicrotome. קטעי רקמה (5-12 מיקרומטר) הם אוויר יבשים, קבועים עם אצטון או מתנול, ולאחר מכן נתונים לimmunolabeling.

Introduction

הטלאים של Peyer (PPS) הם אגרגטים מאקרוסקופיות של זקיקי הלימפה מאורגנים נוכחיים לאורך המעי הדק של בני אדם ועכברים (איור 1), ומהווים את האתרים העיקריים שבו תגובה חיסונית ברירית הם יזמו נגד אנטיגנים תזונתיים, חיידקי commensal, פתוגנים של חיידקים, וחיסונים דרך פה 1-4. בניגוד לרקמות הלימפה היקפיות אחרות כגון הבלוטות הלימפה mesenteric, PPS חסר lymphatics הביא. כאמורות, תגובות חיסוניות בהסתגלות PPS מונעות בתגובה לאנטיגנים הנגזרים מלומן המעי. הדגימה של אנטיגנים luminal מושגת על ידי האפיתל זקיק המשויך (Fae), אשר מורכב משני enterocytes ותאי אנטיגן דגימה הידועים כתאי M. מתחת Fae, באזור הכיפה תת אפיתל (SED), נמצאת רשת של תאים דנדריטים (DCS) מתערבים עם מקרופאגים, תאי B, ותאי T מסוג CD4 + 5-9. במרכזו של כל אחד follicl ימפואידית PPדואר הם תאי דנדריטים זקיקים (FDCs) ומרכז התא B עשיר מרכזי נבטי, מוקף באזורים עשירים בinterfollicular תא T. דגימת האנטיגן ע"י תוצאות PPS בפיתוח + plasmablasts IgA B הסלולרי ותאי CD4 + מפעיל וזיכרון שזרע propria lamina הסביבה ולספק חסינות למגוון רחב לפולשים ריריים.

לנתח את האירועים החיסוניים המורכבים הקשורים לאנטיגן דגימה, עיבוד, והצגה בPPS הוא משימה מרתיעה, בהתחשב בעובדה שתאי PP מהווים רק חלק זעיר מכלל תאי הלימפה ברירית מעי. כדי לסייע באפיון במבחנה של תאים בסביבה זו, אנו מספקים פרוטוקול להכנה כלל תאי PP עכבר לזרימת ניתוח cytometric ופונקציונלי, כמו גם פרוטוקול להכנת PP cryosections למיקרוסקופיה וimmunohistology immunofluorescence. הפרוטוקול שלנו לבידוד, אפיון, וimmunostaining של mousדואר תאי PP הוא לא רומן כשלעצמה, כפי שמעיד עובדה שיש אזכורים רבים שראשיתה יותר מ 25 שנים המצטטים את הטכניקות הללו 5,6,9-11. במקום זאת, הפרוטוקול שלנו מספק שיטה יעילה (ויזואלי) לחוקרי איסוף PPS בפעם הראשונה. את הטכניקות שבם הן שולט בקלות וללא קושי תנבנה מספר גדול של תאים עם> 90% כדאיויות תא. פרוטוקול cryosectioning מניב חלקים סדרתיים לשעתקו מאוד אידיאלי המתאימים מכתימה immunofluorescence והדמית confocal. יתר על כן, הפרוטוקול שלנו משלים את שני מאמרים יופיטר אחרונים אחרים. הראשון, על ידי פוקודה ועמיתיו, מתאר את השימוש במבחני הלולאה ileal גבעול להעריך את הספיגה של חיידקים פתוגניים על ידי תאי PP M 12. השני, על ידי Geem ועמיתיו, מתאר את הבידוד והאפיון של DCS ומקרופגים מרירית מעי העכבר, אך אינו כולל באופן מפורש PPS מהניתוח שלהם 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

בעלי חיים שוכנו בתנאים קונבנציונליים, ספציפיים לפתוגן חופשיים וטופלו בהתאמה מלאה לטיפולו של מרכז Wadsworth המוסדי בעלי החיים ושימוש הנחיות ועדה (IACUC).

1. Gavage האוראלי

  1. (אופציונלי) עומס Gavage עכבר של בחירה עם אנטיגן חיידקים או מריבית באמצעות 22 G-x1.5 ב. מחט האכלה בוטה קצה (פופר המדעי, ניו הייד הפרק, ניו יורק). כרכי משלוח לא יעלו על 400 μl לעכבר.

2. בידוד של תאי PP עבור cytometry זרימה

  1. להרדים עכברים על ידי 2 CO חנק, על פי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש בהנחיות ועדה (IACUC).
  2. לטהר את הבטן עם אתנול 70% או פולידין לפני הניתוח. בצע laparotomy סטנדרטי שכרוך אחת חתך (סנטימטר 1) באמצעות מספרי כירורגיות כיתה לאורך קו אמצע ההתחלה על 1.5 סנטימטרים מהבסיס של כלוב הצלעות. לחשוף את כלחלל itoneal ולזהות cecum. גוזז מעי הדק מסוף בצומת ileal-cecal ועדינות להסיר את המעי בשלמותו. הקפד לא hyperextend רקמת המעי כפי שהוא מוצא מחלל הצפק.
  3. הנח את המעי הדק על מצע של מגבות נייר רטובות או Kimwipes. הרטב את המעי דק בעדינות עם מלח למניעת התייבשות רקמות. חזותי לזהות PPS הבודד הנמצא בצד אנטי mesenteric של המעי (איור 1). בדרך כלל, עכבר אחת יש 5-10 PPS הגלוי שמופצים באופן שווה מהתריסריון (פרוקסימלי) לאילאום (דיסטלי). בממוצע, עכברים 4 יניבו 23 PPS.
  4. בעזרת מספריים מעוגלים ניתוח, PPS הבודד עדינות בלו ולמקם אותם בתמיסת המלח המאוזנת של האנק הקר (HBSS). הערה, המספריים צריכים להיות ממוקמים עקומה כלפי מעלה מעל PP ואז בעדינות להחיל את הרקמות. הבלו רק PP (לא surrounding רקמות) והעברה לHBSS הקר.
    הערה: כל incubations וצעדי צנטריפוגה מנקודה זו והלאה בסעיף 2 שצריכים לעשות ב 4 ° C כדי לשמר כדאיויות תא.
  5. העברת PPS לבינוני 5 מיליליטר טחול דיסוציאציה ודגירה במשך 15-20 דקות על 37 מעלות צלזיוס בזמן נענע בחוזקה ב 250 סל"ד. זמן דגירה ארוכה יותר יהיה השפעה שלילית על כדאיויות תא.
  6. כדי להפיק השעית תא בודדה, PPS מקום במסננת סטרילי (autoclaved) 70 מיקרומטר ניילון רשת סלולרית ולטחון בכוח את הרקמה לרשת באמצעות הבסיס של בוכנה ממזרק 1 סמ"ק. לחלופין, PPS כריך בין שתי שקופיות זכוכית החלבית סטריליים מיקרוסקופ (autoclaved במעטפות) ולטחון בעדינות רקמות בתנועה קדימה ואחורה. השתמש פיפטה העברה סטרילי להעביר השעית התא לתוך צינור 5 מ"ל פלקון.
  7. הוסף EDTA לריכוז סופי של 1 מ"מ להשעית התא. דגירה על נדנדה ל5 דקות בטמפרטורת חדר.
  8. השעית תא למזוג דרך מסננת תא שנייה 70 מיקרומטר כדי להסיר אגרגטים סלולריים נותרים או פסולת רקמות. איסוף תאים בצינור 15 או 50 מיליליטר חרוטים.
  9. תאים כפופים לצנטריפוגה העדינה (5 דקות ב 500 XG). תאי supernatant ו resuspend למזוג בחיץ זרימה, שהוא נאגר מלוח פוספט (PBS) המכיל 1% עגל בסרום עוברי (FCS).
  10. כדי לקבוע את מספר תא וכדאיות, לדלל את התאים 1:10 לtrypan כחול וחזותי לבדוק תאים באמצעות מיקרוסקופ אור וhemocytometer. לחלופין, רוזנת דלפק תא (Invitrogen) או מכשיר דומה ניתן להשתמש כדי למנות מספרים סלולריים ואת הכדאיות באופן אוטומטי.
    החל עם 20-25 PPS, פרוטוקול זה אמור להניב> 2.5 x 10 6 תאים בסך הכל. זה משווה ל ~ 0.8-1.2 x 10 6 תאים לכל עכבר.

תיוג נוגדן של תאים לזרימת cytometry

<תחילת ol = "11">
  • לוותר תאים (10 5 לטובים) לתוך בארות של צלחת תחתונה 96-גם עגולה.
  • צלחת כפוף לצנטריפוגה העדינה (5 דקות ב1000 XG), וsupernatant מזוג ידי ההיפוך בעדינות את הצלחת.
  • Resuspend תאים במאגר בלוק Fc ולדגור על קרח במשך 15 דקות. אמנם יש מספר החוצצים לחסום FC הזמינים מסחרי (למשל חולדה אנטי עכבר CD16/CD32, BD Biosciences), אנחנו פשוט להשתמש במדיום בילה מעכברוש תא B היברידומה (ATCC 2.4.G2) שמפרישה 1 IgG חד שבטי כנגד עכברי Fcγ קולטנים לצעד זה.
  • צלחת כפוף לצנטריפוגה העדינה (5 דקות ב1000 XG) כאמורים לעיל, וsupernatant מזוג ידי ההיפוך בעדינות את הצלחת.
  • הוסף נוגדני fluorophore-מצומדות ישירות למתלים סלולריים בדילול רצוי, ולדגור על קרח למשך 30 דקות עם נדנדה רציפה.
  • צלחת כפוף לצנטריפוגה העדינה (5 דקות ב1000 XG), ומזוגsupernatant ידי ההיפוך בעדינות את הצלחת.
  • שטוף תאים עם 100 μl של חיץ זרימה.
  • צנטריפוגה צלחת ב1000 XG למשך 5 דקות, וsupernatant מזוג ידי ההיפוך בעדינות את הצלחת.
  • תאי resuspend חיץ 400 μl קיבעון, אשר מורכב מ300 μl של חיץ זרימה ו100 μl של paraformaldehyde 1% בPHEM חיץ (60 צינורות מ"מ, 25 מ"מ, HEPES 10 mM EGTA, 4 מ"מ MgCl 2 בשעה 6 pH).
  • תאי נושא לזרום cytometry באמצעות FACSCalibur או שווה ערך. נתח את התוצאות באמצעות גרסה הסלולרית Quest Pro תוכנת 5.2.
  • 3. הכנת Cryosections PP

    1. מראש של אוסף רקמות, להוסיף חיתוך טמפרטורה אופטימלי מתחם (אוקטובר) ל7x7x5 תבניות בסיס פלסטיק מ"מ. כמו כן להכין ברכה של חנקן נוזלי (מ"ל> 750) בדלי דיואר או קרח.
    2. להרדים את העכבר ולבצע laparotamy, כפי שתואר לעיל. הסרת מעי ומניח על מגבות נייר רטובות.
    3. אללבודד PPS לcyrosectioning, לחתוך קטעי 0.5 סנטימטר רוחביים של מעי דק המכילים PP אחת ורקמת העברה לצלחת פטרי המכילה PBS. לשטוף בעדינות לומן של מגזרים אלה עם PBS על מנת להסיר שאריות צואה לא רצוי.
    4. הנח קטעי רקמת מעי אנכי בתוך תבניות בסיס המכילות אוקטובר לטבול את התבניות בחנקן נוזלי ולאפשר לרקמה להקפיא לחלוטין (1-2 דק '). הצבע של אוקטובר ישתנה מברור ללבן כאשר הרקמה קפוא לחלוטין. . לקירור הדרגתי יותר (לדוגמה, כדי להפחית את הפיצוח של אוקטובר), עובש לטבול באמבט של isopentane המקורר עם אדי חנקן נוזליים שים לב: יש להרכיב משקפי בטיחות מתאימים בעת עבודה עם חנקן נוזלי.
    5. הסר תבניות בסיס קפואות מהחנקן הנוזלי באמצעות מלקחיים ולאפשר את התבנית לחמם בטמפרטורת חדר רק מספיק זמן (~ 10-15 שניות) כדי לאפשר את הקצוות של בלוק אוקטובר כדי לרכך. אז כדי להסיר את החסימה מקפואה של אוקטוברהעובש, היפוך העובש ולחץ בעדינות על הגב כדי להוציא את הגוש על פיסת 4 4 x סנטימטר נקיה של רדיד אלומיניום. מייד עוטף את הרקמה בנייר הכסף ומניח בשקית דגימה שכותרתו מאוחסן בחנקן נוזלי או בקרח יבש. לחלופין, להעביר את הרקמות במקפיא (<-20 ° C). השתמש ברקמות תוך שבוע, אחרת את אובניים יהפוך פריך.

    Cryosectioning

    1. Cryosection הרקמות באמצעות יקה CM3050S cryomicrotome או שווה ערך. טמפרטורת החדר בcryostat צריכה להיות מוגדרת -21 ° C.
    2. חתור לסעיפים 12-14 שמיקרומטר בעובי.
    3. איסוף חלקים על פישר SuperFrost שקופיות מיקרוסקופ זכוכית פלוס (או שווה ערך) ולבדוק חזותיים באמצעות מיקרוסקופ אור רגיל בעצמה נמוכה. אם חלקים מרובים עוברים נאספו בשקופית, לוודא שהם התקבצו יחדיו ליישומי מכתים במורד זרם.
    4. חנות לאהוא מחליק בטמפרטורת חדר ובשקופית תיבה, באופן אידיאלי, להשתמש בם בתוך ימים ספורים.

    תיוג נוגדן של Cryosections וניתוח מיקרוסקופיה confocal

    1. שקופיות לטבול באצטון (או מתנול) בצנצנת רקמות מכתימות או מדפים עבור 2 דקות. דגירה ממושכת עלולה לגרום לרקמות להתנתק מהשקופית.
    2. העברת שקופיות לצנצנת מכתימה חדשה ולשטוף 3 פעמים עם PBS-T (1X PBS עם 0.05% Tween-20) ל3 דקות כל אחד.
    3. להקיף את החלקים עם עט הידרופובי ImmEdge. זה יבטיח כי יישארו מרותקים ריאגנטים ונוגדנים לאזור זה במהלך incubations.
    4. דגירת שקופיות בחיץ בלוק (2% סרום עיזים בPBS) למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בתא humidified, מוגנות מפני אור.
    5. דגירת שקופיות עם חיץ בלוק Fc (ראה לעיל) למשך 10 דקות בשעת 37 ° C.
    6. טובל את השקופיות בPBS-T ואזור יבש סביב סעיפים באמצעות Kimwipes או רקמות סופגות אחרות.יש להיזהר שלא לגעת בחלקי הרקמה בפועל.
    7. סעיפי רקמות ריבוד עם פתרון עיקרי נוגדן ודגירה במשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס בתא humidified. נוגדן ראשוני מדולל בדרך כלל במאגר הבלוק לריכוז סופי של 20 מיקרוגרם / מ"ל. השימוש בנוגדנים עיקריים שכותרת-ישירות רצוי, כי ניתן לשלב עד שלושה נוגדנים ישירות בשלב זה. נוגדנים שכותרת-ישירות גם לבטל את הצורך בצעדי דגירת נוגדנים נוספים.
    8. שטפים מחליקים 3 פעמים (5 דקות כל אחת) על ידי טבילה בPBS.
    9. אם, שקופיות אינקובטורים דרושות עם נוגדנים משניים רלוונטיים למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בתא לחות.
    10. שטפים מחליקים 3 פעמים (5 דקות כל אחת) על ידי טבילה בPBS.
    11. דגירת שקופיות במשך 4 דקות בparaformaldehyde 1% בחיץ PHEM, כפי שתוארו לעיל.
    12. יש לשטוף את שקופיות עם PBS לדקות 1.
    13. אזור יבש סביב סעיפים באמצעות Kimwipes או אחר לספוגרקמת אוזן גרון. יש להיזהר שלא לגעת בחלקי הרקמה בפועל. באמצעות פיפטה או טפטף, מניח בעדינות טיפה להאריך בינוני זהב הרכבה ישירות על הסעיף. החל coverslip זכוכית על ההרכבה הבינונית לטפל כדי למנוע בועות. השתמש בנייר סופג כדי לספוג כל מדיום הרכבה עודף.
    14. חותם coverslips לשקופיות מיקרוסקופ עם לק המסחרי ולאפשר לאוויר יבש.
    15. צפו בשקופיות עם ליקה TCS SP5 confocal מיקרוסקופ או שווה ערך.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    ניתוח cytometric זרימת השעיות monodisperse של תאי PP כלל מגלה הבחנה ברורה בין הכנות סלולריות טובות וגרועות. בהכנות סלולריות טובות עם מעל 80% כדאיות, הרוב המכריע של תאים להדגים פיזור גבוה קדימה (FSC), חיווי של נפח תא גבוה, ופיזור נמוך צד (SSC), חיווי של גרעיניות נמוכה של תאים (איור 2 א). בניסוי זה, אנחנו גם מוכנים מכוון "הכנת תא מסכנת" על ידי דוגרי תאי PP במהלך שלבי הבידוד בטמפרטורת חדר (במקום על קרח), ובשלב האחרון, דגירת תאים עם PBS בתוספת 1% FCS (במקום PHEM מאגר). בהכנות הסלולריות המסכנות האלה, רוב תאי התערוכה FSC הנמוך והגבוה SSC והם מחוץ לשער R1 המצוין (איור 2 ב '). תאים אלה כנראה עוברים אפופטוזיס ו / או נימק.

    איור 3 מדגים את השימוש בקוקטייל של עד ארבע דינוגדני fferent fluorophore-מצומדות חד שבטיים להיפלות בין מגוון של סוגי תאים בתא בודדה השעיות PP. תיוג עם מקבץ של בידול (CD) סמני CD19 ולחשוף B220 שתאי B מהווים ~ 60% מהאוכלוסייה בתא המגודרת PP (איור 3 א). תת תאי T ספציפי אפשר למנות בקלות על ידי תיוג כפול עם נוגדנים כנגד CD3 CD4 ו( איור 3B) או CD3 וCD8 (האיור 3C). CD4 + ותאי T CD8 + מהווים 23% ~ ו ~ 9%, בהתאמה של תאי PP כלל. DCS תת כותרת CD11c + (האיור 3D) וCD103 + (לא מוצג) גם אפשר למנות בשיטה זו. CD11c + DCS לתרום לכ 8% מהאוכלוסייה המגודרת המוחלטת, שהיא שווה בערך 10000 DCS לPP. זה בדיוק מסכים עם מספר DCS נצפה על ידי אחרים 14.

    בקרב אוכלוסיית CD11c + + B220. תוצאות דומות מתקבלות כאשר תאי PP נאספים מC57B / 6 עכברים (איור 3E).

    הכנות "עניות" סלולריות יכולות להוביל לתוצאות מטעות מאוד, בעיקר משום שתאים מתים או גוססים נוטים לקשור נוגדנים אינם ספציפי. כפי שמוצג באיור 4, האוכלוסייה של תאים שמכתימים חיובי עבור סמן תא B (B220) ואת סמני תאי T (CD3, פנל; CD4, לוח ב ') עשויים להשתנות על ידי יותר מ 3-קפל שבין טוב ו הכנת תא רעה. איור 4 מראה ייצוג יתר של + B220 וCD3 + תאים הכפולים חיובי (לוח א '), כמו גם B220 + B תאי CD4 + ותאי T תאים כפולים חיוביים (לוח ב') בהכנות סלולריות עניות. כאמור, הפער בB היחסי וכמות תאי ה T בטוב מול עניים נובע מחייב הלא ספציפי של נוגדנים עשוי למות תאים.

    הפרוטוקול שלנו גם מוכיח כי cryosections PP עכבר ניתן לניתוח היסטופתולוגיות, כמו גם immunolabeling. איור 5 משווה צביעת H & E של פרפין העכבר PPS (פנלי A, B) וחתכים קפואים (הלוח 'ג). בעוד סעיפי פרפין מספקים רזולוציה גבוהה יותר ברמה התאית, כאשר מוכתמים על ידי H & E, האזורים הבהירים וכהים של מרכזים הנבטיים PP הם בקלות רבה יותר מסומנים בסעיפי cryosection (איורי 5A-C). cryosections H & E-מוכתם שימושי להשוואת Side-by-צד עם cryosections immunolabeled. Cryosection PP אופייני מוכתם נוגדנים אנטי CD3 לתייג תאי T, הנוגדנים נגד CD11c להדגיש DCS ונוגדנים אנטי-B220 כדי להדגיש תאי B מוצג באיור 6.

    איור 1
    איור 1. patc של העכבר Peyerהס. תמונה של מעי דק עכבר נכרת טרי עם שלוש PPS גלוי (חצים לבנים). את PPS מופיע כשלפוחית ​​מבנים דמויים (5 5 מ"מ) בצד אנטי mesenteric של serosa המעי.

    איור 2
    איור 2. תאי PP סה"כ נותחו על ידי cytometry זרימה. השעית monodisperse של תאי PP כלל היה נתון לcytometry זרימה באמצעות BD FACSCallibur. () דוגמה להכנת תאים טובה. רוב התאים להדגים פיזור גבוה קדימה (FSC), חיווי של נפח תא גבוה, ופיזור נמוך צד (SSC), חיווי של גרעיניות נמוכה של תאים. תאים אלה נמצאים בארגזים בR1. תאים עם FSC הנמוך והגבוה SSC, ממוקם מחוץ לשער R1, נחשבים מת או גוסס תאים. (ב ') דוגמה להכנת תא מסכנת, שברוב התאים נמצאים מחוץ לשערR1 בשל FSC הנמוך והגבוה SSC.

    איור 3
    איור 3. ניתוח נציג זרימה cytometric של לימפוציטים PP. השעיות Monodisperse של תאי PP כלל מודגרות עם נוגדנים עיקריים fluorophore-מצומדות ולאחר מכן נתונה לcytometry זרימה. () תיוג CD19 וB220 של תאי B PP. (BC)-תיוג כפול של אוכלוסיות תאים כלל עם CD3 CD4 ו( B) או CD8 (ג') למנות את תת תאי T ספציפי. (ד) כפול תיוג של אוכלוסיות תאים כלל ל( סמן התא B) B220 וCD11c (סמן DC). (ה) השוואה B220, CD3 , CD4, וצביעת CD11c על תאי PP מBALB / ג ועכברי C57B / 6.

    איור 4
    איור 4. נתונים מטעים זרימת cytometry כתוצאה מהיערכות סלולרית PP עניה. (פנלים משמאל) וטובים (פנלים נכונים) הכנות סלולריות PP עניות הוכתמו (A) נוגדנים ל B220 וCD3 לבדל אוכלוסיות תאי B ו-T, או (ב) נוגדנים לB220 וCD4 לבדל את תאי B מקבוצת משנה של תאי T. יש בדרך כלל מעט מאוד תאים של תאים שמכתימים חיובי עבור CD4 B220 וCD3 או, כפי שמוצגים בלוחות השמאל. לעומת זאת, בהכנות סלולריות עניות תאים כפולים חיוביים מהווים כמעט 20% מהתאים בסך הכל. ראה טקסט לפרטים נוספים בנוגע למה שמהווה הכנת תא "עניים".

    איור 5
    איור 5. סעיפי PP דואר מוכתם הנציג H &. פרפין מוטבע-סעיפים (א, ב) או cryosections (C) של ileal PPשלו היו מוכתם בH & E ודמיין ידי מיקרוסקופ אור. הערה כי האזורים הבהירים וכהים של זקיקי הלימפה הנתחמים בקלות בcryosections, בהשוואה לסעיפי פרפין. קיצורים: V, villous; Fae, אפיתל זקיקים הקשורים; SED כיפה, תת אפיתל; זקיק LF, הלימפה.

    איור 6
    איור 6. תיוג Immunofluorescent של cryosections PP Murine. טרי לחתוך קטעי רקמה של עכבר אחת PP היו אוויר יבש, אצטון קבוע, ומוכתמים ב() נוגדנים FITC-מצומדות אנטי CD3 לתייג תאי T באזורים-הזקיקים בין ו propria lamina; (ב) הנוגדנים PE-מצומדות אנטי CD11c להדגיש DCS בSED, וכן (ג) נוגדנים APC-מצומדות אנטי B220 כדי להדגיש תאי B (ד ') o מורכבת.f תמונות בלוחות חשמל המופק באמצעות תוכנת פיג'י. סרגל קנה מידה הוא ~ 100 מיקרומטר.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקולים מקבילים להכנת PP הכנות תא בודדות לזרימת ניתוח וcryosections cytometric ופונקציונלי לimmunostaining. שני שיטות לשחזור ומאוד נגישים, ובלבד cytometer זרימה וcryostat זמינים. לחוקרים בפעם הראשונה אותו יש לציין כי בהשוואה לטחול, תשואות סלולריות הכוללות מPPS הן דלות יחסית. עם זאת, הפרוטוקול שמתארים בדרך כלל תשואות בין 0.8-1.2 10 6 תאי PP כלל x מעכבר אחת. סולם למעלה הוא אפשרי, למרות שאנחנו בדרך כלל לא יותר מ 20-25 ברכה PPS, משום שמניסיוננו, צבירה מתרחשת ותשואות סלולריות (וכדאיות) ירידה במידה רבה. מצד השני, אנחנו לא ממליצים להשתמש בפחות מ 15 PPS עבור פרוטוקול זה, כמסה קריטית יש צורך לבצע את התאים בהצלחה בהליך הבידוד כולו. אם כדאיויות תא מקסימליים היא בעדיפות לזרם פונקציונלימבחנים, אנו ממליצים שמדגם קטן של תאים מבודדים יהיה נתון למכתים יודיד propidium כדי לאפשר gating יותר מדויק ברכת הקיימא של תאים מסך אוכלוסיית תאי PP. לבסוף, יש לציין כי השיטה שלנו היא נוחה לתא מיון יישומים אם משנה תא מסוים הוא רצוי להעברת מאמצת או בניתוח מבחנה, למשל.

    האוסף של PPS לcryosectioning הוא פשוט יחסית, למרות שבפועל החתך של רקמות PP יכול להיות מאתגר. זה הכרחי, למשל, שרקמות PP כראוי מכוונות בתבניות (כלומר בניצב לבסיס של העובש) כדי להבטיח שסעיפים הרוחביים האמיתיים מתקבלים. אנו מציעים רקמות PP Snap-מקפיאות ולאחר מכן להעמיד את cryosections להחשת fixatives כמו אצטון או מתנול לשמר תגובתיות נוגדנים ("antigenicity"), למרות שהחשנו תוצאת fixatives בירידה בresol הסלולרית ומשנה הסלולר הכלליתution. אם שימור antigenicity אינו מדאיג במיוחד, אז אנחנו ממליצים על השימוש בקישור ההדדי fixatives כמו paraformaldehyde (PFA), תוצאה שבשימור טוב יותר של מבנים תאיים ומשנה הסלולר. אכן, PFA ניתן להשתמש כדי לתקן רקמות לפני cryosectioning. פשוט לטבול PPS נחתך טרי בכמויות עצומות של 4% PFA ל> 2 שעות, לשטוף רקמות עם PBS להסיר מקבע עודף, לאזן רקמות בסוכרוז (15%) אם רוצה, ולאחר מכן להטביע באוקטובר, כמתואר לעיל. רקמה אז יכולה להיות cryosectioned, אבל חייבת להיות חסומה בפתרון גליצין (0.1 מ 'ב PBS במשך 15 דקות) כדי להרוות תגובתי PFA שיורים לפני immunostaining.

    לבסוף, בשעה שתארנו פרוטוקולים לתיוג immunofluorescent של cryosections PP, אותם סעיפים אלה ניתנים לאימונוהיסטוכימיה (IHC) באמצעות ערכות IHC זמינות מסחרי (למשל מעבדות וקטור, Burlingame, ע"א). לIHC, חיוני לכלול peroxidase חסימה או quencהינג צעד בפרוטוקול, כperoxidases אנדוגניים הוא תופעה שכיחה מאוד ברירית המעי. אחרים ציינו כי לIHC, זלוף לב של העכברים עם paraformaldehyde 4% ב PBS משפר שימור רקמות.

    לסיכום, אנו מספקים פרוטוקולים מקבילים ומשלימים לניתוח הכמותי ופונקציונלי של תאי PP Murine, כולל הלימפוציטים וDCs. הכנת השעיות תא בודדות מאפשרת כמותית ותפקודית בניתוח מבחנה מסוגי התאים העיקריים בPPS, בעוד immunolabeling של cryosections מספקת מידע בנוגע ללוקליזציה של סוגי תאים ספציפיים, כמו גם אינטראקציות תא סלולרי שקיימות באתר. המגבלה העיקרית של שתי הגישות הללו היא שלא מייצג הדמיה "בזמן אמת" של אינטראקציות PP תא סלולרי. לעת עתה לפחות, PPS הוכיח אטום להדמית intravital, טכניקה שגרמה למהפכה בהבנה של הלימפוציטים dynamics בבלוטות הלימפה היקפיות. עד שהמחסומים הטכניים המגבילים הדמית intravital של PPS הם להתגבר, הפרוטוקולים מפורטים במאמר זה להכנת PP הכנות תא בודדות לcryosections PP לimmunostaining זרימת ניתוח וcytometric ופונקציונלי יישאר האמצעי העיקרי של חקירה והבנה של הפונקציות החיסוניות של משנה ספציפי -אוכלוסיות של תאים בPPS, אתרים אינדוקטיביים העיקריים של רקמות הלימפה מעיים הקשורים.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

    Acknowledgements

    אנו מודים שיר Renjie (Core cytometry זרימת מרכז Wadsworth) לקבלת סיוע בניתוח תא והלן ג'ונסון (Wadsworth מרכז בעלי חי היסטופתולוגיה Core) להכנת קטעי פרפין. אנו מודים לד"ר ריצ'רד א קול (Core המיקרוסקופי אור מרכז Wadsworth) לקבלת סיוע במיקרוסקופיה confocal ואוסף תמונה. ברצוננו להודות אנדי נטלי (צילום Wadsworth מרכז ואיור) לקבלת סיוע עם אנימציות.

    MDJ נתמך על ידי קרן מחקר מדעי החיים, הווארד יוז רפואי במכון (HHMI) מלגה. SA נתמך על ידי מלגת Wadsworth מרכז-בריאות מחקר בע"מ הבתר ביצוע עצמית. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענקי NIH HD061916 וGM082978.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    OCT Compound Tissue-Tek 4583
    7x7x5 mm Base Molds Fisherbrand 22-363-552
    ImmEdge Pen Vector Labs H-4000
    Superfrost Plus Slides Thermo Scientific 4951
    Edge Rite Blade Thermo Scientific 4280L
    Anti-Mouse CD11c-PE eBioscience 17-0114-82
    Anti-Mouse CD45R/B220-APC BD Pharmigen 553092
    Anti-Mouse CD3-FITC BD Pharmigen 561798
    Anti-Mouse CD4-PE BD Pharmigen 553652
    Anti- Mouse CD8-PE BD Pharmigen 553032
    Anti-Mouse CD19-PercP BioLegend 115531
    Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red Fisher Scientific 14175-079
    70 μm cell strainer BD Falcon 352350
    Spleen Dissociation Medium Stem Cell Technologies 7915
    Goat serum Invitrogen 16210-072
    Fc Block ATCC 2.4.G2 HB-197 Supes obtained from cell line 2.4.G2
    Curved Scissor F.S.T 14061-09
    Cryostat Leica 3050S
    FACS Calibur BD
    Countess Cell Counter Invitrogen
    Hematoxylin Richard Allan 7211
    Eosin Richard Allan 71304
    Formalin Starplex Scientific 3661

    Table 1. Reagents and equipment used in this study.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. Secretory IgA's complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut. Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).
    2. Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue. Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).
    3. Rescigno, M., Sabatino, A. D. i Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease. J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).
    4. Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis. Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).
    5. Iwasaki, A., Kelsall, B. L. Localization of distinct Peyer's patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine. Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).
    6. Iwasaki, A. Mucosal dendritic cells. Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).
    7. Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. Peyer's Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores. Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).
    8. Lelouard, H., et al. Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer's patch dendritic cells that express lysozyme. Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).
    9. Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches. Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).
    10. Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses. J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).
    11. Kelsall, B. L., Strober, W. Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer's patch. J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).
    12. Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer's Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).
    13. Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).
    14. Lopez-Guerrero, D. V., et al. Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer's patches in adult mice. J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics