림프구와 손쥐 Peyer의 패치에서 수지상 세포를 분리하고 Immunostaining

Immunology and Infection

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Summary

Peyer의 패치에있는 셀의 특정 subpopulations (조달청), 창자 관련 림프의 조직의 주요 유도 사이트의 면역 기능을 이해 증가 관심이 있습니다. 여기 흐름 cytometric 분석 및 immunostaining을위한 PP cryosections위한 단일 셀 준비를 PP 준비 병렬 프로토콜을 설명합니다.

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De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches. J. Vis. Exp. (73), e50167, doi:10.3791/50167 (2013).

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Abstract

Peyer의 패치 (조달청) 창자 관련 림프 조직의 핵심 부품 (갈트)이며, 장 immunosurveillance과 항상성에 중심 역할을한다. 장 루멘의 미립자 항원과 미생물이 지속적으로 대과 - 관련 상피 (FAE)에 PP M 세포에 의해 샘플 및 기본 수지상 세포 네트워크 (코디네이터), 대 식세포 및 림프구로 이송됩니다. 이 문서에서는, 우리는 손쥐 조달청은 (i) 단일 세포 현탁액에 dissociated이며, 유동 세포 계측법을 받게하고 (ii) cryosectioning 및 immunostaining을 준비하는 프로토콜을 설명합니다. 유동 세포 계측법를 들어, 조달청은 기계적으로 dissociated하고 상피 세포 및 대형 쓰레기의 무료 단세포 현탁액을 생성하기 위해 70 μm 멤브레인을 통해 필터링합니다. 20-25 조달청 (4 마우스에서)를 시작으로,이 신속하고 재현 방법은> 2.5 인구를 산출 × 10> 90 % 세포 생존 능력 6 셀. cryosectioning, 신선한 들어지적인 절연 조달청은 cryomicrotome을 사용하는 다음 최적의 절삭 온도 (OCT) 중간, 액체 질소 스냅인 - 냉동 및 sectioned에 몰두하고 있습니다. 조직 섹션 (5-12 μm)은 아세톤이나 메탄올로 고정, 공기 건조 있으며, 다음 immunolabeling를 받게.

Introduction

Peyer의 패치 (조달청) 인간과 생쥐 (그림 1)의 소장에 걸쳐 현재의 조직 림프 모낭 매크로 집계하고 점막 면역 응답이식이 항원, 공생 박테리아, 미생물 병원균, 그리고 구두 백신에 대해 시작되는에서 주요 사이트를 구성 1-4. 같은 창 자간 막 림프절과 같은 다른 주변 림프 조직과는 달리, 조달청은 수입 성의 lymphatics가 부족합니다. 조달청에서 같은 적응 면역 반응은 장 내강에서 파생 된 항원에 대한 응답으로 구동 때문입니다. luminal 항원의 샘플링은 M 세포로 알려진 enterocytes 및 항원 샘플링 세포 모두로 구성되어 있습니다 대과 - 관련 상피 (FAE)에 의해 달성된다. FAE 아래의 하위 상피 돔 (SED) 지역에, 대 식세포, B 세포, 그리고 CD4 + T 세포를 5-9로 혼합 된 수지상 세포 (DC가)의 네트워크에 자리 잡고 있습니다. 각 PP 림프 follicl의 핵심e는 follicular의 수지상 세포 (FDCs)와 T 세포 풍부한 interfollicular 지역으로 둘러싸인 B 세포 풍부한 중앙 본원 센터입니다. 이가 + B 세포 plasmablasts와 CD4 + 효과기 및 메모리 셀의 개발에 조달청 결과로 항원 샘플링 그 종자 주위의 얇은 판의 propria와 점막 침략자에 대한 광범위한 내성을 제공합니다.

조달청의 항원 샘플링, 처리, 및 프리젠 테이션과 관련된 복잡한 immunologic 이벤트를 해부하는 것은 PP 세포는 장의 점막에 총 림프 세포의 아주 작은 일부를 구성하는 것을 생각하면 부담스러운 작업입니다. 이 환경에서 세포의 체외 특성화에에 도움이하기 위해, 우리는 흐름 cytometric 및 기능 분석뿐만 아니라, immunofluorescence 현미경과 immunohistology에 대한 cryosections을 PP 준비하기위한 프로토콜 총 마우스 PP 전지를 준비하기위한 프로토콜을 제공합니다. mous의 절연, 특성 및 immunostaining에 대한 프로토콜전자 PP 전지는 이러한 기술 할 5,6,9-11를 인용 25 년 이상 거슬러 올라가는 많은 참조가 있다는 사실에 의해 입증, 본질적으로 소설이 아닙니다. 오히려, 우리의 프로토콜은 처음 조달청를 수집 조사의 간소화 (및 영상) 메소드를 제공합니다. 우리가 설명하는 기술을 쉽게 습득하고 쉽게> 90 % 세포 생존과 세포의 큰 숫자를 얻을 수 있습니다. cryosectioning 프로토콜은 이상적으로 immunofluorescence 얼룩 및 공 촛점 이미징에 적합 높은 재현 시리얼 섹션을 산출. 또한, 우리 프로토콜은 두 개의 다른 최근 주피터 기사를 보완합니다. 첫 번째는, 후쿠다 및 동료에 의해, PP M 세포 12 병원성 박테리아의 이해를 평가하는 출혈도 잡았 ileal 루프 assays의 사용을 설명합니다. 다른 하나는, Geem 및 동료에 의해 ​​DCS 및 마우스 장 점막에서 대 식세포의 분리 및 특성을 설명하지만, 명시 적으로 분석 13 일부터 조달청을 제외.

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Protocol

동물은 종래의, 무균 조건 하에서 보관되었으며 워즈 워드 센터의 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC) 가이드 라인에 전체 준수 취급되었다.

1. 구강 Gavage

  1. 22 G를 x1.5-에 사용 관심 항원이나 미생물과 선택 (옵션) Gavage 마우스 변형. 무딘 엔드 먹이 바늘 (Popper 과학, 뉴 하이드 파크 (Hyde Park), NY). 배달 볼륨 마우스 당 400 μl를 초과 할 수 없습니다.

2. 유동 세포 계측법에 대한 PP 세포의 분리

  1. 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 가이드 라인에 따라, CO 2 질식으로 쥐를 안락사시켜야.
  2. 70 % 에탄올 또는 수술하기 전에 betadine으로 복부를 정화. 갈비의 기본에서 1.5 cm에 대한 중간 선을 따라 처음 수술 학년 가위를 사용하여 하나의 (1 ㎝) 절개를 포함하는 표준 개복술을 수행합니다. 당 노출itoneal 캐비티와이게 맹장을 식별합니다. ileal-cecal 교차점에서 터미널 소장을 하나 자르지 부드럽게 전체에서 장을 제거합니다. 이 복막 캐비티에서 제거되는대로 장 조직을 hyperextend 않도록주의보십시오.
  3. 젖은 종이 수건이나 Kimwipes의 침대에 소장을 놓는다. 조직 탈수를 방지하기 위해 식염수에 부드럽게 소장 젖었 어. 시각 장 (그림 1)의 반 장간막 측에있는 개인 조달청를 확인합니다. 일반적으로 한 번의 마우스가 고르게 회장 (말초)에 십이지장 (근위)에서 배포됩니다 5-10 표시 조달청이 있습니다. 평균적으로, 네 마우스 23 조달청를 얻을 수 있습니다.
  4. 곡선 외과 가위, 부드럽게 소비세 개인 조달청과 차가운 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)에 넣어 사용하기. 참고, 가위 방금 PP 위에 곡선 측을 배치하고 부드럽게 조직에 적용해야합니다. 소비세 만 PP (안 surroundiNG 조직)과 차가운 HBSS로 전송됩니다.
    참고 : 앞으로 제 2의이 시점에서 모든 incubations 및 원심 분리 단계는 ° C 세포 생존 능력을 유지하기 위해 4시에 수행해야합니다.
  5. 37 15-20 분 5 ML의 비장 분리 매체 및 배양에 조달청을 전송 ° C 힘차게 250 rpm으로 흔들어 동안. 긴 배양 시간은 부정적인 세포 생존에 영향을 미칩니다.
  6. 멸균 (autoclaved) 70 μm 나일론 메쉬 셀 스트레이너에 대한 단일 세포 현탁액, 장소 조달청을 생성하고 강제로 1 참조 주사기에서 플런저의 기본을 사용하여 메쉬로 조직을 분쇄합니다. 또한, 두 불투명 멸균 유리 현미경 슬라이드 (봉투에 autoclaved)과 부드럽게 앞뒤로 운동과 조직을 부러 사이의 샌드위치 조달청. 5 ML 팔콘 튜브에 세포 현탁액을 전송하기 위해 멸균 전송 피펫을 사용합니다.
  7. 세포 현탁액 1 mm의 최종 농도에 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가합니다. 대한 락커에 품다상온에서 5 분 거리에 있습니다.
  8. 두 번째 70 μm 전지 스트레이너를 통해 가만히 따르다 세포 현탁액은 남아있는 세포 집계 또는 조직 파편을 제거합니다. 15 또는 50 ML 원뿔 튜브에 세포를 수집합니다.
  9. 부드러운 원심 분리에 따라 셀 (500 XG에서 5 분). 인산염 식염수 (PBS)는 1퍼센트 태아 송아지 혈청 (FCS)를 포함하는 버퍼입니다 흐름 버퍼에 가만히 따르다 표면에 뜨는 및 resuspend 세포.
  10. 휴대폰 번호와 가능성을 확인하려면 trypan 파랑에 1시 10분 세포를 희석하고 시각적으로 가벼운 현미경과 hemocytometer를 사용하여 세포를 검사한다. 또한, 백작 셀 카운터 (Invitrogen) 또는 이와 유사한 악기가 자동으로 셀 번호와 생존을 열거하는 데 사용할 수 있습니다.
    20-25 조달청를 시작으로,이 프로토콜은> 2.5 X 10 6 총 세포를 얻을 수 있습니다. 이 ~ 0.8-1.2 마우스 당 X 10 6 세포에 equates.

유동 세포 계측법에 대한 세포의 항체 라벨링

<안녕, 시작 = "11">
  • 96 - 웰 둥근 바닥 판 우물에 세포를 (물론 당 10 5) 투여.
  • 부드러운 원심 분리 (1,000 XG에서 5 분), 그리고 부드럽게 반전 플레이트에 의해 가만히 따르다 표면에 뜨는에 따라 판.
  • FC 블록 버퍼에 세포를 Resuspend 15 분 동안 얼음에 품다. 상업적으로 이용 가능한 FC 블록 버퍼의 수 (예 쥐 안티 - 마우스 CD16/CD32, BD Biosciences)가 있지만, 우리는 단순히 손쥐에 대한 단클론 IgG 1 숨기면 쥐 B 세포 하이 브리 도마 (ATCC 2.4.G2)에서 소비 매체를 사용하여 이 단계에 대한 Fcγ 수용체.
  • 이상과 같이 부드러운 원심 분리 (1,000 XG에서 5 분), 그리고 부드럽게 반전 플레이트에 의해 가만히 따르다 표면에 뜨는에 따라 판.
  • 원하는 희석에서 세포 현탁액에 직접 형광 - 복합 항체를 추가하고, 지속적으로 요동과 30 분에 얼음에 품다.
  • 제목 부드러운 원심 분리로 판 (1,000 XG에서 5 분), 그리고 가만히 따르다부드럽게 반전 플레이트에 의해 표면에 뜨는.
  • 흐름 버퍼 100 μl로 세포를 씻으십시오.
  • 부드럽게 반전 접시로 5 분, 그리고 가만히 따르다 표면에 뜨는 1,000 XG에서 판을 원심 분리기.
  • Resuspend 세포 흐름 버퍼 300 μl와 PHEM 버퍼에 1 % paraformaldehyde (60 MM 파이프, 25 밀리미터 HEPES, 10 MM EGTA, 4 MM pH를 6 MgCl 2)의 100 μl로 구성되어 400 μl 고정 버퍼.
  • 제목 셀 FACSCalibur 또는 동급를 사용하여 세포 계측법을 흘러. 셀 퀘스트 프로 소프트웨어 버전 5.2을 사용하여 결과를 분석합니다.
  • 3. PP Cryosections의 작성

    1. 조직 컬렉션의 사전에서 7x7x5 mm 플라스틱베이스 금형에 최적의 절삭 온도 (OCT) 화합물을 추가 할 수 있습니다. 또한 dewar 또는 얼음 양동이의 액체 질소 (> 750 ML)의 풀을 준비합니다.
    2. 마우스를 안락사시켜야하고 위에 설명 된대로, laparotamy을 수행합니다. 젖은 종이 타월에 소장과 장소를 제거합니다.
    3. 에cyrosectioning에 조달청을 따로 분리하여 PBS를 포함하는 페트리 접시에 단일 PP 및 전송 조직을 포함하는 작은 창자의 0.5 cm 가로 세그먼트를 잘라. 부드럽게 원치 않는 지저분한 오염 물질을 제거하기 위해 PBS로 해당 세그먼트의 내강을 씻어.
    4. 수직 10월를 포함하는 기본 틀 안에서 장 조직 세그먼트를 배치합니다. 액체 질소에 금형을 빠져과 조직은 (1-2 분) 완전히 정지 할 수 있습니다. 조직이 완전히 고정 될 때 10월의 색상은 분명에서 흰색으로 변경됩니다. . 더 점진적 냉각 (예 : 10월의 균열 줄이기 위해)의 경우, 액체 질소 증기를 냉각 이소 펜탄의 욕조에 담그지 곰팡이 ​​참고 : 액체 질소와 함께 작업 할 때 적절한 안전 고글을 착용하십시오.
    5. 집게를 사용하여 액체 질소에서 냉동의 기본 틀을 제거하고 곰팡이가 10월 블록의 가장자리가 부드럽게 할 수 있도록 충분히 만족 상온 (~ 10-15 초)에서 따뜻하게 할 수 있습니다. 그때부터 10월의 냉동 블록을 제거하려면금형, 금형 반전과 알루미늄 호일의 클린 4 X 4cm 기사에 블록을 꺼내 뒷면에 살짝 누르십시오. 즉시 액체 질소 나 드라이 아이스에 저장 라벨이 표본 가방에 호일과 장소에 조직을 래핑. 또는 냉동고 (<-20 ° C)에서 조직을 전송할 수 있습니다. 일주일 이내에 조직을 사용, 그렇지 않으면 블록은 나이가 취성이 될 것입니다.

    Cryosectioning

    1. Cryosection Leica CM3050S cryomicrotome 또는 동급를 사용하여 조직을. 그라 이오 스탯의 챔버 온도는 -21로 설정해야 ° C.
    2. 두께 12-14 μm 아르 섹션에 노력하고 있습니다.
    3. 피셔 SuperFrost 플러스 (또는 이에 상응하는 금액)의 유리 현미경 슬라이드로 섹션을 수집하여 표준 저전력 광 현미경을 사용하여 시각적으로 검사한다. 여러 섹션 슬라이드에서 수집되는 경우가 하류 착색 응용 프로그램 모여 있는지 확인합니다.
    4. 스토어 t그는 슬라이드 상자에 실온에서 슬라이드하고, 이상적으로, 몇 일 이내에 사용하십시오.

    Cryosections의 항체 라벨링 및 공 촛점 현미경 분석

    1. 2 분을위한 조직 염색법 병이나 랙에 아세톤에 빠져 슬라이드 (또는 메탄올). 장시간 부화는 슬라이드에서 분리 조직의 원인이 될 수 있습니다.
    2. 새로운 착색 병에 슬라이드를 갈아 3 분마다 PBS-T (0.05 % 십대 초반-20과 1X PBS)로 3 회 씻는다.
    3. ImmEdge의 소수성 펜으로 섹션을 둘러 싸다. 이 시약 및 항체가 incubations 동안 그 지역에 국한 유지 될 수 있도록해야합니다.
    4. 빛으로부터 보호 humidified 챔버에서 37 ° C에서 30 분을 위해 블록 버퍼에 슬라이드 (PBS에 2 % 염소 혈청을) 품다.
    5. 37 10 분에 FC 블록 버퍼 (위 참조) 슬라이드를 품다 ° C.
    6. PBS-T 및 Kimwipes 또는 기타 흡수제 조직을 사용하여 섹션을 건조한 지역에서 수영을 슬라이드.실제 조직 섹션을 터치하면 안됩니다.
    7. 오버레이 조직 37 번 30 분을위한 기본 항체 솔루션과 배양 ° humidified 챔버에서 C로 섹션을 제공합니다. 기본 항체는 일반적으로 20 μg / ML의 최종 농도에 블록 버퍼에 희석되어 있습니다. 많은 셋처럼 항체가이 단계에서 직접 결합 할 수 있기 때문에 직접 표시 주요 항체의 사용은 바람직하다. 직접 표시된 항체는 또한 추가 항체 부화 단계에 대한 필요성을 제거합니다.
    8. 워시는 PBS에 빠져 3 회 (5 분마다)을 슬라이드.
    9. 만약 수분 챔버에서 37 ° C에서 30 분 관련 보조 항체와 필요 품다 슬라이드.
    10. 워시는 PBS에 빠져 3 회 (5 분마다)을 슬라이드.
    11. 위의 설명 PHEM 버퍼의 1 % paraformaldehyde에 4 분을 위해 슬라이드를 품다.
    12. 1 분에 PBS로 슬라이드를 씻어.
    13. 드라이 Kimwipes를 사용하여 섹션을 지역 또는 다른 흡수다닐 조직. 실제 조직 섹션을 터치하면 안됩니다. 피펫이나 스포이트를 사용하여 부드럽게 섹션에 직접 골드 장착 매체를 연장 한 방울을 넣으십시오. 거품을 피하기 위해 돌봐 장착 매체에 유리 coverslip을 적용합니다. 초과 장착 매체를 흡수하는 압지를 사용합니다.
    14. 상업 매니큐어와 건조한 공기 할 수있는 현미경 슬라이드에 인감이 coverslips.
    15. Leica TCS SP5 또는 이에 상응하는 공 촛점 현미경으로 슬라이드를 볼 수 있습니다.

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    Representative Results

    총 PP 세포 monodisperse 현탁액의 흐름 cytometric 분석은 좋은 가난한 셀 준비를 확실히 구별을 보여줍니다. 80 %의 생존과 좋은 휴대 준비에서 세포의 대부분은 높은 기대 분산 (FSC), 높은 세포 볼륨의 지표, 낮은 측 분산 (SSC), 낮은 세포 단위 (그림 2A)의 표시기를 보여줍니다. 이 실험에서 우리는 의도적으로 (대신 PHEM의 PBS 플러스 1% FCS와 세포를 잠복기, 마지막 단계에서, 실온 (대신 얼음에의)에서 격리 단계에서 PP 세포를 잠복기가와가 "가난한 셀 준비"를 준비 ) 버퍼. 이 불쌍한 셀 준비에서 세포의 대부분이 낮은 FSC와 높은 SSC을 전시하고 지정된 게이트 R1 (그림 2B) 밖에 있습니다. 이러한 세포는 가능성이 apoptosis 및 / 또는 괴사를 겪고 있습니다.

    그림 3 네 디에의 칵테일의 사용을 보여줍니다PP 단일 세포 현탁액에서 셀 다양한 유형의 사이에 차별 할 수 fferent 형광 - 복합 단클론 항체. 차별화의 클러스터 (CD) 마커 CD19와 B 세포의 출입을 금지 PP 세포 인구의 ~ 60 % (그림 3A)를 구성하는 B220 공개와 함께 라벨. 특정 T 세포 하위 집합을 쉽게 3 번 CD와 CD4 (그림 3B) 또는 3 번 CD 및 CD8 (그림 3C)에 대한 항체가있는 이중 라벨가 열거 할 수 있습니다. CD4 +와 CD8 + T 세포는 전체 PP 세포의 각각 ~ 23 %와 ~ 9 %를, 구성합니다. 코디네이터는 하위 집합 표시 CD11c + (그림 3D) 및 CD103 +이 (미도시)도이 방법으로 열거 할 수 있습니다. CD11c + 코디네이터는 PP 10,000 코디네이터와 거의 동일합니다 전체 개폐 인구의 약 8 %에 기여하고있다. 지금이 바로 다른 14에 의해 관찰 된 지구 코디네이터의 번호로 동의합니다.

    CD11c의 인구 중 + +에 두 번 긍정적이었다. PP 세포가 C57B / 6 마우스 (그림 3E)에서 수집 할 때 비슷한 결과가 얻어진다.

    "싸구려"셀 준비가 죽었거나 죽어 세포가 아닌 구체적으로 항체를 바인딩하는 경향이 크게 때문에, 매우 오해의 소지가있는 결과를 초래할 수 있습니다. 그림 4에 도시 된 바와 같이, B 세포 마커 (B220)와 T 세포 마커 (3 번 CD, 패널, CD4, 패널 B) 모두에 긍정적 인 얼룩 세포의 인구는 좋은 사이 3 배 이상 다를 수 있습니다 나쁜 세포 준비. 그림 4 이상 B220 +과 (패널 A) 세포에는 3 번 CD + 더블 긍정적으로 표현뿐만 아니라, B220을 보여줍니다 + B 세포와 CD4 + T 세포 낮은 세포 준비에 두 번 긍정적 인 셀 (패널 B). 위에서 언급 한 바와 같이,의 상대적 B와 T 세포 숫자의 격차는 가난한 대 좋은 세포를 죽어 가능성이 항체의 비 특정 바인딩 때문입니다.

    우리 프로토콜은 또한 마우스 PP의 cryosections이 histopathologic 분석뿐만 아니라 immunolabeling 의무 아르 보여줍니다. 그림 5는 마우스 조달청의 파라핀 (패널 A, B) 및 냉동 섹션 (패널 C)의 H & E 염색을 비교합니다. 파라핀 섹션은 H & E로 물들어 세포 수준에서 더 많은 해상도를 제공하는 반면, PP 본원 센터의 빛과 어두운 영역은 더 쉽게 cryosection 섹션 (그림 5A-C)에 demarcated 있습니다. H & E-스테인드 cryosections는 immunolabeled cryosections과 나란히 비교하는 데 유용합니다. B 세포를 강조하기 위해 DCS 및 반 B220 항체를 강조하기 위해 T 세포, 항 CD11c 항체 라벨을 반에는 3 번 CD 항체 물들 전형적인 PP의 cryosection는 그림 6에 표시됩니다.

    그림 1
    1 그림. 마우스 Peyer의 patc세 보이는 조달청 (흰색 화살표)로 갓 excised 마우스 소장의 HES. 이미지. 조달청은 장 serosa의 반 창 자간 막 측면에 물집과 같은 구조 (5 × 5 ㎜)으로 나타납니다.

    그림 2
    그림 2. 유동 세포 계측법에 의해 분석 총 PP 세포가. 총 PP 세포의 monodisperse 서스펜션은 BD FACSCallibur를 사용하여 유동 세포 계측법을 받게되었습니다. 좋은 세포 준비 (A) 예는. 세포의 대부분은 높은 기대 분산 (FSC), 높은 세포 볼륨의 지표, 낮은 측 분산 (SSC), 낮은 세포 단위의 표시기를 보여줍니다. 이러한 세포는 R1의 박스입니다. R1 게이트의 밖에있는 낮은 FSC와 높은 SSC,있는 세포는 죽은 세포를 죽어 간주됩니다. 세포의 대부분이 문 밖에있는 가난한 셀 준비의 (B) 예R1 낮은 FSC와 높은 SSC 때문입니다.

    그림 3
    그림 3. 총 PP 세포의 PP 림프구의 대표 흐름 cytometric 분석. Monodisperse 사용 중지가 형광 - 복합 차 항체와 incubated하고 유동 세포 계측법을 받게. PP B 세포 (A) CD19과 B220 라벨. (BC)의 총 세포 인구의 두 번 라벨 3 번 CD 및 CD4 (B) 또는 CD8와 (C) 특정 T 세포 하위 집합을 열거합니다. (D) B220 (B 세포 마커)에 대한 총 세포 인구의 두 번 라벨 및 CD11c (DC 표시). (E) 비교 B220, 3 번 CD , CD4 및 BALB / c와 C57B / 6 마​​우스에서 PP 세포에서 CD11c 착색.

    그림 4
    4 그림. 가난한 PP 셀 준비의 결과로 오해의 소지가있는 유동 세포 계측법 데이터입니다. 좋은 (왼쪽 패널)과 가난 (오른쪽 패널) PP 세포 준비가로 (A) 항체 물들 된 B와 T 세포 인구 또는 (B) 항체을 차별화 할 B220과 3 번 CD B220과 T 세포의 하위 집합에서 B 세포를 차별화하는 CD4합니다. 왼쪽 패널에 표시된 B220과 3 번 CD 또는 CD4 양성 얼룩 세포의 거의 세포는 일반적으로 있습니다. 반면, 가난한 셀 준비에 두 번 긍정적 인 세포는 전체 세포의 거의 20 %를 구성합니다. "가난한"셀 준비를 구성 무엇에 대한 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오.

    그림 5
    그림 5. 대표 H & E-스테인드 PP 섹션. 파라핀 - 임베디드 섹션 (A, B) 또는 ileal PP의 cryosections (C)S는 H & E 물들과 빛 현미경으로 시각화했다. 림프 모낭의 빛과 어두운 영역이 쉽게 파라핀 섹션에 비해, cryosections에 demarcated을 뜻합니다. 약어 : V, villous, FAE, 고치 - 관련 상피, SED, 하위 상피 돔, LF, 림프 소낭.

    그림 6
    6 그림. 손쥐 PP의 cryosections의 Immunofluorescent 라벨이 있습니다. 갓 PP는, 공기 건조 아세톤 - 고정, 그리고 (A) FITC-복합 항에는 3 번 CD 항체는 간 follicular 지역에서 T 세포에 레이블을하고 물들했다 번의 마우스의 조직 섹션을 잘라 얇은 판의 propria, (B) PE-복합 항 CD11c 항체는 SED의 코디네이터를 강조하기 위해, 그리고 (C) APC-복합 반 B220 항체는 B 세포를 강조하기 위해 (D) 복합 O.AC 피지 소프트웨어를 사용하여 생성 패널의 F 이미지. 스케일 바 ~ 100 μm이다.

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    Discussion

    이 문서에서는, 우리는 immunostaining에 대한 흐름 cytometric 및 기능 분석 및 cryosections위한 단일 셀 준비를 PP 준비를 위해 병렬 프로토콜을 제공합니다. 두 가지 방법은 흐름 cytometer와 그라 이오 스탯을 사용할 수 있습니다 제공 높은 재현하고 쉽게 액세스 할 수 있습니다. 처음 수사를 위해이 비장에 비해, 조달청의 총 세포 수율이 상대적으로 빈약하다고 지적한다. 그럼에도 불구하고, 프로토콜은 우리가 일반적으로 한 번의 마우스 0.8-1.2 X 10 6 전체 PP 세포 사이의 수율을 설명합니다. 우리가 일반적으로 이상 20-25 조달청을 수영장하지 않지만 우리의 경험에 크게을 집계가 발생하고 세포 수율 (및 가능성) 감소, 때문에 스케일 업이 가능합니다. 중요한 질량이 성공적으로 전체 격리 절차를 통해 세포를 수행 할 필요가 있습니다 같은 다른 한편으로, 우리는이 프로토콜 이하 15 조달청를 사용하지 않는 것이 좋습니다. 최대 세포 생존 능력은 하류 기능에 대한 우선 순위 경우assays, 우리는 분리 된 세포의 작은 샘플이 더 정확한 게이팅 전체 PP 세포 인구에서 세포의 가능한 풀 수 있도록 propidium 요오드화물 착색를 받게하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 그것은 우리의 방법은 특정 셀 집합이 입양 전송 또는 체외 분석에 예를 들어, 원하는 경우 응용 프로그램을 정렬 셀에 복종 할 의무가있는 것에주의해야한다.

    PP의 조직의 실제 sectioning이 도전 할 수 있지만 cryosectioning을위한 조달청의 컬렉션은 상대적으로 간단합니다. 그것은 PP의 조직은 진정한 가로 섹션을 취득 할 수 있도록 (금형의 기본에 즉, 수직) 금형에서 제대로 방향 것으로, 예를 들어, 필수적입니다. 우리는 스냅 - 냉동 PP의 조직을 제안하고 전체 셀룰러 및 하위 세포 resol의 감소에 fixatives 결과를 precipitating하더라도 다음, 항체 반응성을 ( "항원") 보존하기 위해 아세톤이나 메탄올과 같은 fixatives를 precipitating에 cryosections을 subjectingution. 항원을 유지하는 것은 특정 문제가 아닌 경우, 우리는의 사용을 권장합니다 가교 paraformaldehyde (PFA), 셀룰러 및 하위 세포 구조를 더 잘 보존의 결과와 같은 fixatives합니다. 사실, PFA 전에 cryosectioning에 조직 문제를 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 간단히> 2 시간에 4퍼센트 PFA의 풍부한 양의 신선 excised 조달청을 빠져 초과 정착액을 제거하는 PBS로 조직을 씻고, 원하는 경우 자당의 조직 (15 %)를 평형 후 위에서 설명한, 10 월에 삽입 할 수 있습니다. 조직는 cryosectioned이 될 수 있지만, 이전 immunostaining에 잔류 반응 PFA을 해소하기 위해 글리신 용액 (15 분에 PBS에 0.​​1 M)로 차단해야합니다.

    우리는 PP cryosections의 immunofluorescent 라벨에 대한 프로토콜을 설명 반면 마지막으로,이 같은 부분은 상업적으로 이용 가능한 IHC 키트 (예를 들면 벡터 연구소, Burlingame, CA)를 사용하여 immunohistochemistry (IHC)에 의무가 있습니다. IHC를 들어, 차단 퍼 옥시 데이즈 나 quenc를 포함하는 것이 필수적입니다내생 peroxidases는 장의 점막에 매우 유행 아르로 프로토콜의 hing 단계. 기타 IHC를 들어, PBS에 4 % paraformaldehyde로 쥐 심장 재관류가 조직 보존을 향상 지적했다.

    요약에서, 우리는 림프구 및 DCS 등의 손쥐 PP 세포의 정량 및 기능 분석을위한 병렬 및 보완 프로토콜을 제공합니다. cryosections의 immunolabeling의 특정 세포 유형의 국산화뿐만 아니라, 현장에 존재하는 세포 세포의 상호 작용에 관한 정보를 제공하면서 단일 세포 현탁액의 준비는 조달청의 주요 세포 유형의 시험 관내 분석 정량 및 기능 수 있습니다. 이러한 방식을 둘 다의 주요 제한도는 PP 세포 세포의 상호 작용 "실시간"시각화를 대표한다는 것입니다. 적어도 지금은, 조달청은 intravital 영상, 림프구 dynami의 이해를 혁명 한 기술에 대한 불 투과성 증명주변 림프절에 CS. 조달청의 intravital 이미징을 제한 기술적 장벽이 극복 될 때까지, 프로토콜은 특정 하위의 면역 기능을 조사하고 이해의 주요 수단 유지됩니다 흐름 cytometric 및 기능 분석 및 immunostaining에 대한 PP의 cryosections위한 단일 셀 준비를 PP 준비를 위해이 문서에서 설명 조달청의 세포 - 인구, 창자 관련 림프 조직의 주요 유도 사이트.

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    Disclosures

    관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

    Acknowledgements

    우리는 세포 분석 및 파라핀 섹션의 준비 헬렌 존슨 (워즈 워드 센터 동물 조직 병리학 코어)의 도움을 Renjie 노래 (워즈 워드 센터 유동 세포 계측법 코어)을 감사드립니다. 우리는 공 촛점 현미경 및 이미지 수집과 도움 박사 리처드 A. 콜 (워즈 워드 센터 라이트 현미경 핵심)을 감사드립니다. 우리는 애니메이션 지원 앤디 벤틀리 (워즈 워드 센터 사진 및 삽화)을 인정하고 싶습니다.

    MDJ은 생명 과학 연구 재단, 하워드 휴즈 의학 연구소 (HHMI) 동지에 의해 지원됩니다. SA는 워즈 워드 센터 - 건강 연구 주식회사 교내 박사 친목에 의해 지원됩니다. 이 작품은 NIH 보조금 HD061916과 GM082978에 의해 부분적으로 지원되었다.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    OCT Compound Tissue-Tek 4583
    7x7x5 mm Base Molds Fisherbrand 22-363-552
    ImmEdge Pen Vector Labs H-4000
    Superfrost Plus Slides Thermo Scientific 4951
    Edge Rite Blade Thermo Scientific 4280L
    Anti-Mouse CD11c-PE eBioscience 17-0114-82
    Anti-Mouse CD45R/B220-APC BD Pharmigen 553092
    Anti-Mouse CD3-FITC BD Pharmigen 561798
    Anti-Mouse CD4-PE BD Pharmigen 553652
    Anti- Mouse CD8-PE BD Pharmigen 553032
    Anti-Mouse CD19-PercP BioLegend 115531
    Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red Fisher Scientific 14175-079
    70 μm cell strainer BD Falcon 352350
    Spleen Dissociation Medium Stem Cell Technologies 7915
    Goat serum Invitrogen 16210-072
    Fc Block ATCC 2.4.G2 HB-197 Supes obtained from cell line 2.4.G2
    Curved Scissor F.S.T 14061-09
    Cryostat Leica 3050S
    FACS Calibur BD
    Countess Cell Counter Invitrogen
    Hematoxylin Richard Allan 7211
    Eosin Richard Allan 71304
    Formalin Starplex Scientific 3661

    Table 1. Reagents and equipment used in this study.

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    References

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