Isolar e imunocoloração linfócitos e células dendríticas a partir de placas de Peyer Murino

Immunology and Infection

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Summary

Existe um interesse crescente na compreensão das funções imunológicas de subpopulações específicas de células em placas de Peyer (PP), os locais primários indutivos de tecidos linfóide associado ao intestino. Aqui destacamos protocolos paralelos para preparar PP preparações de células individuais para análise por citometria de fluxo e criosseções PP para imunocoloração.

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De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches. J. Vis. Exp. (73), e50167, doi:10.3791/50167 (2013).

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Abstract

Placas de Peyer (PP) são componentes integrais dos tecidos linfóide associado ao intestino (GALT) e desempenham um papel central na imunovigilância intestinal e homeostase. Antigénios particulados e micróbios no lúmen intestinal estão continuamente sujeitos a amostragem por células PP M no epitélio folicular-associado (FAE) e transportado para uma rede de base de células dendríticas (DC), macrófagos, linfócitos e. Neste artigo, descreve protocolos em que PPs murinos são (i) dissocia-se em suspensões de células isoladas e sujeitas a citometria de fluxo, e (ii) preparado para cryosectioning e imunocoloração. Para a citometria de fluxo, PPs são dissociadas mecanicamente e em seguida filtrada através de membranas 70 uM para gerar suspensões de células individuais livres de células epiteliais e os detritos de grandes dimensões. Começando com 20-25 PPs (a partir de quatro ratinhos), esse método rápido e reproduzível origina uma população de> 2,5 x 10 6 células, com> 90% de viabilidade celular. Para cryosectioning, frescoPPs ly isoladas estão imersos em meio de corte ideal de temperatura (OCT), congelado em nitrogênio líquido, e seccionados usando um cryomicrotome. As secções de tecido (5-12 mm) são secas ao ar, fixadas com acetona ou metanol, e, em seguida, submetido a imunomarcação.

Introduction

Placas de Peyer (PP) são agregados macroscópicos de organizados folículos linfóides presentes em todo o intestino delgado dos humanos e ratos (Figura 1) e que constituem os sítios primários em que mucosas respostas imunes são iniciadas contra antígenos alimentares, bactérias comensais, agentes patogénicos microbianos e vacinas orais 1-4. Ao contrário de outros tecidos linfóides periféricos, como os linfonodos mesentéricos, PPs não têm vasos linfáticos aferentes. Como tal, as respostas imunes adaptativas em PPs são accionados em resposta a antigénios derivados a partir do lúmen intestinal. A amostragem de antigénios luminais é realizado pelo epitélio do folículo-associado (FAE), que consiste em dois enterócitos e antigénio-amostragem células conhecidas como células M. Abaixo da FAE, na cúpula sub-epitelial (SED) região, encontra-se uma rede de células dendríticas (CDs) misturavam-se com macrófagos, células B e células T CD4 + 5-9. No centro de cada follicl PP linfóidee são células dendríticas foliculares (FDC) e uma de células B rico centro centro germinal, ladeada por zonas de célula T ricos interfoliculares. Amostragem de antigénio por PPs resulta no desenvolvimento de IgA + plasmablasts de células B e as células CD4 + efectoras e de memória que a semente da lâmina envolvente e proporcionar imunidade a uma grande variedade de invasores mucosas.

Dissecando os eventos imunológicos complexos associados à amostragem antígeno, tratamento e apresentação em PPC é uma tarefa difícil, considerando-se que as células PP constituem apenas uma pequena fração do total de células linfóides na mucosa intestinal. Para ajudar na caracterização in vitro de células neste meio, é proporcionado um protocolo para a preparação de células totais de PP de rato para a análise de citometria de fluxo e funcionais, bem como um protocolo para a preparação de PP criocortes para microscopia de imunofluorescência, e imunohistologia. O protocolo para o isolamento, caracterização e imunocoloração de mouscélulas E PP não é novidade, por si só, como evidenciado pelo fato de que há inúmeras referências datam mais de 25 anos que citam estas técnicas 5,6,9-11. Em vez disso, nosso protocolo fornece um método (e visual) simplificado para investigadores coleta PPs pela primeira vez. As técnicas aqui descritos são facilmente dominado e prontamente produzir grandes números de células com> 90% de viabilidade celular. O protocolo cryosectioning rende altamente reprodutíveis de secções seriadas idealmente adequadas para a coloração de imunofluorescência e de imagem confocal. Além disso, o nosso protocolo complementa dois outros artigos de Jove recentes. O primeiro, por Fukuda e colaboradores, descreve a utilização de ensaios de ligadura de laço ileal para avaliar a absorção de bactérias patogénicas em células PP M 12. O outro, pelo GEEM e colaboradores, descreve o isolamento e caracterização de DCs e macrófagos da mucosa intestinal do rato, mas exclui explicitamente PPs da sua análise 13.

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Protocol

Os animais foram alojados em convencionais, livres de patógenos específicos condições e foram tratados em total conformidade com cuidado o Wadsworth Center Animal da Comissão Institucional e de Uso (IACUC) diretrizes.

1. Gavagem oral

  1. (Opcional) estirpe de ratinho Gavage de escolha com antigénio ou micróbios de interesse utilizando uma G 22 x1.5-in. blunt-ponta da agulha alimentação (Popper Scientific, New Hyde Park, NY). Volumes de entrega não deve exceder 400 ul por rato.

2. Isolamento de Células PP para Citometria de Fluxo

  1. Euthanize ratos por asfixia CO 2, de acordo com o cuidado de animais e de uso institucional do comitê (IACUC) diretrizes.
  2. Purificar o abdómen com etanol a 70% ou betadine antes da cirurgia. Realizar uma laparotomia padrão que envolve uma incisão (1 cm) único usando tesouras cirúrgicas grau ao longo do inicio da linha média de cerca de 1,5 cm da base da caixa torácica. Exponha o porcavidade itoneal e identificar o ceco. Cortar o intestino pequeno terminal na junção íleo-cecal e remova o intestino na sua totalidade. Tomar cuidado para não hiperextensão o tecido intestinal, uma vez que está a ser removida a partir da cavidade peritoneal.
  3. Coloque o intestino delgado em uma cama de toalhas de papel úmidas ou Kimwipes. Molhar o intestino delgado suavemente com solução salina para evitar a desidratação dos tecidos. Identificar visualmente PPs individuais localizados no lado anti-mesentérico do intestino (Figura 1). Tipicamente, um único rato tem 5-10 PPs visíveis que são uniformemente distribuídos a partir do duodeno (proximal) ao íleo (distal). Em média, quatro ratos renderá 23 PPs.
  4. Utilizando uma tesoura cirúrgica, curvadas suavemente consumo PPs individuais e colocá-los em solução fria salina balanceada de Hank (HBSS). Nota, a tesoura curva deve ser colocada voltada para cima logo acima do PP e então suavemente aplicada ao tecido. Excise apenas a PP (não surrounding de tecido) e de transferência de HBSS frio.
    Nota: Todas as incubações e os passos de centrifugação a partir deste ponto para a frente na secção 2, deve ser feita a 4 ° C para preservar a viabilidade celular.
  5. Transferir PPs em 5 ml de Meio Baço dissociação e incubar durante 15-20 min a 37 ° C, enquanto se agita vigorosamente a 250 rpm. Tempo de incubação vai afetar negativamente a viabilidade celular.
  6. Para gerar uma suspensão de célula única, PPs lugar numa estéril 70 um (autoclavado) nylon peneira malha de célula e à força moer o tecido dentro da malha utilizando a base de um êmbolo de uma seringa de 1 cc. Como alternativa, o PPS sanduíche entre duas lâminas de vidro fosco estéreis microscópio (autoclavado em envelopes) e gentilmente moer tecidos com um movimento de ida e volta. Usar uma pipeta estéril para transferir a suspensão de células para um tubo Falcon de 5 ml.
  7. Adicionar EDTA para uma concentração final de 1 mM para a suspensão de células. Incubar em uma cadeira de balanço para5 min à temperatura ambiente.
  8. Suspensão de células através de um segundo decantar célula 70 um filtro para remover quaisquer agregados remanescentes celulares ou restos de tecido. Recolher as células num tubo de 15 ml ou 50 cónica.
  9. Células sujeitas a centrifugação suave (5 min a 500 xg). Decantar sobrenadante e ressuspender as células em tampão de fluxo, que é salino tamponado com fosfato (PBS) contendo 1% de soro fetal de vitelo (FCS).
  10. Para determinar o número de células e viabilidade, diluir as células em azul de tripano 01:10 e inspeccionar visualmente células utilizando um microscópio de luz e um hemocitómetro. Alternativamente, um contador de células Countess (Invitrogen) ou instrumento similar pode ser usado para enumerar automaticamente o número de células e viabilidade.
    Começando com 20-25 PP, este protocolo deve render> 2,5 x 10 6 células totais. Isso equivale a ~ 0,8-1,2 x 10 6 células por mouse.

Labeling anticorpo de células por citometria de fluxo

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  • Pipetar as células (10 5 por cavidade) em cavidades de uma placa de 96 poços de fundo redondo.
  • Placa sujeita a centrifugação suave (5 min a 1000 xg), e decantar o sobrenadante invertendo suavemente a placa.
  • Ressuspender as células em tampão de bloqueio Fc e incubar em gelo durante 15 min. Embora haja um certo número de tampões de bloco comercialmente disponíveis Fc (por exemplo, de rato anti-ratinho CD16/CD32, BD Biosciences), simplesmente usar meio gasto a partir de uma célula de hibridoma de rato B (ATCC 2.4.G2) que segrega um IgG monoclonal murino contra um Fcy receptores para este passo.
  • Placa sujeita a centrifugação suave (5 min a 1000 xg), como acima, e decantar o sobrenadante invertendo suavemente a placa.
  • Adicionar fluoróforo anticorpos conjugados directamente para as suspensões de células a diluição desejada, e incubar em gelo durante 30 min com agitação contínua.
  • Placa sujeita a centrifugação suave (5 min a 1000 xg), e decantarsobrenadante, invertendo com cuidado a placa.
  • Lavar as células com 100 uL de tampão de fluxo.
  • Centrifugar a placa 1000 xg durante 5 minutos, decanta-se o sobrenadante e invertendo suavemente a placa.
  • Ressuspender as células 400 tampão de fixação ul, que consiste em 300 ul de tampão de fluxo e 100 uL de paraformaldeído a 1% em tampão PHEM (60 mM de PIPES, HEPES 25 mM, EGTA 10 mM, MgCl2 4 mM, pH 6).
  • As células sujeitas a citometria de fluxo utilizando um FACSCalibur ou equivalente. Analisar os resultados utilizando células da Quest versão do software Pro 5.2.
  • 3. Preparação de PP criocortes

    1. Antes da coleta de tecido, adicione Optimal Cutting Temperatura composto (OCT) para 7x7x5 milímetros moldes base de plástico. Também preparar um conjunto de azoto líquido (> 750 mL) num balde de gelo ou dewar.
    2. Euthanize rato e executar uma laparotamy, como descrito acima. Remover intestino e coloque em toalhas de papel molhado.
    3. Paraisolar PPs para cyrosectioning, cortar segmentos de 0,5 centímetros transversais do intestino delgado, contendo uma única e tecido PP transferência para uma placa de Petri contendo PBS. Lave o lúmen desses segmentos com PBS para remover os restos não desejados fecal.
    4. Colocar os segmentos de tecido intestinal verticalmente dentro de moldes de bases contendo outubro Mergulhar os moldes em azoto líquido e permitir que o tecido para congelar completamente (1-2 min). A cor da OCT irá mudar de transparente para branco quando o tecido é completamente congelada. . Para um arrefecimento mais gradual (por exemplo, para reduzir a fractura do OCT), molde imerso em um banho de isopentano resfriado com nitrogênio líquido vapores Nota: Usar óculos de segurança adequadas quando se trabalha com nitrogênio líquido.
    5. Remover os moldes de bases congelados do azoto líquido utilizando fórceps e permitir que o molde se aquecer à temperatura ambiente, apenas o tempo suficiente (~ 10-15 segundos) para permitir que as bordas do bloco OCT para amolecer. Para, em seguida, remover o bloco congelado de outubro deo molde, inverter o molde e pressione suavemente sobre a volta para ejetar o bloco para um 4 x 4 cm limpo pedaço de papel alumínio. Imediatamente enrolar o tecido na película e colocar num saco de amostra marcado armazenados em azoto líquido ou em gelo seco. Alternativamente, a transferência de tecido em um congelador (<-20 ° C). Usar o tecido dentro de uma semana, de outro modo os blocos vão tornar-se frágil com a idade.

    Cryosectioning

    1. Criocorte o tecido utilizando uma Leica CM3050S cryomicrotome ou equivalente. A temperatura da câmara do criostato deve ser ajustado para -21 ° C.
    2. Esforce-se para as secções que são 12-14 um de espessura.
    3. Colete secções em Fisher SuperFrost Plus (ou equivalente) lâminas de microscópio de vidro e inspecionar visualmente utilizando um microscópio de luz padrão de baixa potência. Se várias seções estão sendo coletados em um slide, garantir que eles estão agrupados em cluster para aplicações de coloração jusante.
    4. Loja tele desliza para a temperatura ambiente dentro de uma caixa corrediça e, de preferência, usa-los dentro de poucos dias.

    Labeling anticorpo de criocortes e Análise Microscopia Confocal

    1. Imergir as lâminas em acetona (ou metanol) em frasco de tecido de coloração ou prateleiras durante 2 min. Incubação prolongado pode causar tecidos para destacar do slide.
    2. Transferir as lâminas para coloração novo frasco e lava-se 3 vezes com PBS-T (1X PBS com 0,05% de Tween-20) durante 3 minutos cada.
    3. Cercar as seções com uma caneta hidrofóbica ImmEdge. Isto irá assegurar que os reagentes e anticorpos permanecerá confinado a essa área durante as incubações.
    4. Incubar as lâminas em tampão de bloqueio (soro de cabra a 2% em PBS) durante 30 min a 37 ° C numa câmara humidificada, protegido da luz.
    5. Incubar as lâminas com tampão de bloqueio Fc (ver acima) durante 10 min a 37 ° C.
    6. Dip slides em PBS-T, e em torno de secções de área seca usando Kimwipes ou tecido absorvente.Tome cuidado para não tocar nos cortes de tecido reais.
    7. Sobreposição de secções de tecido com uma solução de anticorpo primário e incubar durante 30 min a 37 ° C numa câmara humidificada. O anticorpo primário é geralmente diluído em tampão de bloqueio para uma concentração final de 20 ug / ml. A utilização de anticorpos marcados directamente primários é desejável, porque até três anticorpos pode ser combinada directamente nesta etapa. Anticorpos marcados directamente também eliminar a necessidade de passos adicionais de incubação de anticorpos.
    8. Lavar as lâminas três vezes (5 min cada) por imersão em PBS.
    9. Se necessário, incubar com anticorpos secundários relevantes para 30 min a 37 ° C numa câmara de humidade.
    10. Lavar as lâminas três vezes (5 min cada) por imersão em PBS.
    11. Incubar as lâminas durante 4 min em paraformaldeído a 1% em tampão PHEM, como descrito acima.
    12. Lavar as lâminas com PBS durante 1 min.
    13. Área seca em torno de seções usando Kimwipes ou outros absorvertecido ent. Tome cuidado para não tocar nos cortes de tecido reais. Usando uma pipeta ou conta-gotas, coloque delicadamente uma gota de Prolongar meio de Ouro de montagem diretamente na seção. Aplicar uma lamela de vidro para o meio de montagem com cuidado para evitar bolhas. Use papel absorvente para absorver qualquer excesso de meio de montagem.
    14. Lamínulas do selo para lâminas de microscópio com unha polonês comercial e deixar secar ao ar.
    15. Ver slides com uma Leica TCS SP5 ou microscópio confocal equivalente.

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    Representative Results

    Citometria de fluxo e suspensões monodispersas de células totais PP revela uma clara distinção entre preparações de células boas e pobres. Em preparações de células com mais de 80 anos de boa viabilidade%, a grande maioria das células demonstram alta dispersão frontal (FSC), um indicador do volume da célula de alta e baixa dispersão lateral (SSC), um indicador de granularidade baixa de células (Figura 2A). Nesta experiência, também preparado intencionalmente a "preparação de células pobres" por incubação de células PP durante os passos de isolamento, à temperatura ambiente (em vez de sobre o gelo), e, no último passo, incubando as células com PBS mais FCS a 1% (em vez de PHEM tampão). Nestas preparações de células pobres, a maioria das células exibem FSC baixa e alta SSC e estão fora do portão indicado R1 (Figura 2B). Estas células são susceptíveis a sofrer apoptose e / ou necrose.

    A Figura 3 demonstra a utilização de uma mistura de até quatro different fluoróforo conjugados de anticorpos monoclonais para discriminar entre uma variedade de tipos celulares em suspensões de células individuais de PP. A marcação com aglomerado de diferenciação (CD) de marcadores CD19 e revelam que as células B B220 constitui ~ 60% da população de células gated PP (Figura 3A). Específicas subconjuntos de células T podem ser facilmente enumerados por dupla marcação com anticorpos contra CD3 e CD4 (Figura 3B) ou de CD3 e CD8 (Figura 3C). CD4 + e CD8 + T constituem ~ 23% e ~ 9%, respectivamente, das células totais de PP. DCs CD11c + subconjuntos marcados (Figura 3D) e CD103 + (não mostrados) podem também ser identificadas por este método. CD11c + DCs contribuem para cerca de 8% da população total fechado, o que é equivalente a 10.000 CDs por PP. Isto concorda com exactamente o número de DCs observados por outros 14.

    Entre a população de CD11c + + B220. Resultados semelhantes são obtidos quando as células são recolhidas a partir de PP C57B / 6 machos (Figura 3E).

    "Pobre" preparações de células pode levar a resultados altamente enganosas, em grande parte porque as células mortas ou a morrer tendem a se ligar anticorpos não especificamente. Como mostrado na Figura 4, a população de células que coram positivo para ambos o marcador de células B (B220) e os marcadores de células T (CD3, painel A; CD4, painel B) pode variar em mais de 3 vezes entre uma boa e preparação de células mal. Figura 4 mostra uma representação mais de + B220 e CD3 + dupla de células positivas (Painel A), bem como B220 + células B e células T CD4 + de duplo células positivas (Painel B) em preparações de células pobres. Como mencionado acima, a disparidade de B relativa e números de células T no bem e mal é provavelmente devido à ligação não específica de anticorpos de células a morrer.

    O protocolo também demonstra que criocortes rato PP são acessíveis à análise histopatológica, bem como imunomarcação. Figura 5 compara a coloração de H & E de parafina rato PPs (painéis A, B) e as secções congeladas (painel C). Enquanto as seções de parafina fornecer mais resolução a nível celular quando corados por H & E, as zonas claras e escuras de PP centros germinais são mais facilmente demarcada em seções criocorte (Figuras 5A-C). Criocortes H & E-stained são úteis para o lado-a-lado com os criocortes immunolabeled comparação. Um típico criocorte PP coradas com anticorpos anti-CD3 para rotular as células T, anti-CD11c anticorpos DCs para destacar e anti-B220 anticorpos para destacar as células B é mostrado na Figura 6.

    Figura 1
    Figura 1. Patc rato Peyerhes Imagem. intestino de um rato recém-cortado pequeno, com três PPs visíveis (setas brancas). Os PPs aparecem como estruturas do tipo blister (5 x 5 mm), no lado anti-mesentérica da serosa intestinal.

    Figura 2
    A Figura 2. As células totais de PP analisadas por citometria de fluxo. Uma suspensão monodispersa de células totais de PP foi submetido a citometria de fluxo utilizando um FACSCallibur BD. (A) Exemplo de uma preparação de células bem. A grande maioria das células demonstrar dispersão frontal alta (FSC), um indicador de volume de células de alta e baixa dispersão lateral (SSC), um indicador de granularidade baixa de células. Estas células são encaixotados em R1. As células com baixo FSC e SSC alta, localizada do lado de fora do portão R1, são consideradas as células mortas ou a morrer. (B) Exemplo de uma preparação de células pobre, na qual a maioria das células são do lado de fora do portãoR1 devido ao baixo FSC e SSC alta.

    Figura 3
    Figura 3. As suspensões de análise por citometria de fluxo representativas de linfócitos PP. Monodispersas de células totais de PP incubadas com anticorpos conjugados com fluoróforo primário e, em seguida, submetido a citometria de fluxo. (A) rotulagem CD19 e B220 de células B de PP. (BC) etiquetagem dupla de populações de células totais com CD3 e CD4 (B) ou CD8 (C) para enumerar subpopulações de células T específicas. (D)-etiquetagem dupla de populações de células totais para B220 (marcador de células B) e CD11c (marcador de DC). (E) Comparação B220, CD3 , CD4, e coloração em células CD11c PP de BALB / c e camundongos C57B / 6.

    Figura 4
    Figura 4. O fluxo de dados enganosos citometria como resultado de preparações de células pobres PP. Bom (painéis esquerdos) e pobre (painéis da direita) as preparações de células PP foram coradas com (A) e de anticorpos anti-CD3 B220 para diferenciar as populações de células T e B ou (b) anticorpos de B220 e CD4 para diferenciar as células B a partir de um subconjunto de células T. Em geral, há muito poucas células de células que coram positivo para CD4 B220 e CD3, ou, como se mostra nos painéis da esquerda. Em contraste, em preparações de células pobres duplo células positivas constitui quase 20% do total de células. Veja o texto para obter mais detalhes sobre o que constitui uma preparação celular "pobre".

    Figura 5
    Figura 5. Representante de H & E-secções coradas PP. Secções embebidas em parafina (A, B) ou criocortes (C) de ileal PPs foram coradas com H & E e visualizadas por microscopia de luz. Note-se que as zonas claras e escuras dos folículos linfóides são facilmente demarcados nos criocortes, em comparação com as secções de parafina. Abreviaturas: V, vilosos; FAE, folículo-associado epitélio; SED, cúpula sub-epitelial; folículo, LF linfóide.

    Figura 6
    Figura 6. Rotulagem imunofluorescente de criocortes murinos PP. Freshly cortar secções de tecido de um único rato PP foram secos ao ar, acetona-fixo, e coradas com (A) conjugados com FITC anti-CD3 para rotular as células T nas regiões foliculares e inter- lâmina própria (B), PE-conjugado anti-CD11c anticorpos para realçar DCs na SED, e (C) de APC-conjugado anti-B220 anticorpos para destacar as células B (D) A o composto.f imagens em painéis AC gerados usando o software Fiji. Barra de escala é de aproximadamente 100 mm.

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    Discussion

    Neste artigo, nós fornecemos protocolos paralelos para preparar PP preparações de células individuais para análise por citometria de fluxo e funcional e criosseções para a imunocoloração. Ambos os métodos são altamente reprodutível e facilmente acessível, na condição de um citómetro de fluxo e criostato estão disponíveis. Para os investigadores primeira vez deve-se sublinhar que, quando comparado com o baço, o rendimento total de células de PPs são relativamente escassas. No entanto, o protocolo destacamos geralmente rendimentos entre 0,8-1,2 x 10 6 células totais PP de um rato. Scale-up é possível, apesar de normalmente não fazer piscina mais de 20-25 PP, porque, em nossa experiência, a agregação ocorre e produz celulares (e viabilidade) declínio muito. Por outro lado, não é recomendável utilizar menos de 15 PPs para este protocolo, tal como uma massa crítica é necessária para realizar com sucesso as células através de todo o processo de isolamento. Se a viabilidade celular máxima é uma prioridade para a jusante funcionalensaios, é recomendável que uma pequena amostra de células isoladas ser submetidos a coloração com iodeto de propídio para permitir a propagação mais preciso da piscina viável de células a partir da população total de células PP. Finalmente, deve notar-se que o nosso método é passível de classificação celular aplicações se um subconjunto específico de células é desejável para a transferência adoptiva ou in vitro, por exemplo.

    A coleção de PPs para cryosectioning é relativamente simples, embora a secção real de tecidos PP pode ser um desafio. É imperativo, por exemplo, que os tecidos de PP são adequadamente orientados em moldes (ou seja, perpendicular à base do molde) para assegurar que as secções transversais são verdadeiros obtidos. Propomos tecidos snap-PP congelamento e, em seguida, submeter os criocortes para precipitar fixadores como acetona ou metanol para preservar a reactividade do anticorpo ("antigenicidade"), embora precipitando fixadores resultado numa diminuição do resol celular e sub-celular globalution. Se preservar antigenicidade não é uma preocupação especial, recomendamos o uso de cross-linking fixadores como paraformaldeído (PFA), o que resulta em uma melhor preservação das estruturas celulares e sub-celular. Com efeito, PFA podem ser usados ​​para fixar os tecidos antes de cryosectioning. Simplesmente mergulhar recém PPs excisadas em quantidades de 4% PFA durante> 2 horas, lava-se o tecido com PBS para remover o excesso de fixador, equilibrar tecido em sacarose (15%), se desejado, e em seguida incorporar em OCT, como descrito acima. O tecido pode então ser cryosectioned, mas devem ser bloqueados com glicina solução (0,1 M em PBS durante 15 min) para extinguir residual reactivo PFA antes de imunocoloração.

    Finalmente, enquanto que descrevemos protocolos para a rotulagem de imunofluorescência do PP criosseções, essas mesmas seções são passíveis de imuno-histoquímica (IHQ) utilizando kits disponíveis comercialmente IHC (por exemplo, Vector Labs, Burlingame, CA). Para IHC, é essencial a inclusão de uma peroxidase de bloqueio ou quenching passo no protocolo, como peroxidases endógenas são altamente prevalentes na mucosa intestinal. Outros observaram que para IHC, a perfusão cardíaca dos ratos com paraformaldeído a 4% em PBS melhora a preservação do tecido.

    Em resumo, temos desde protocolos paralelos e complementares para análise quantitativa e funcional das células murinas PP, incluindo linfócitos e células dendríticas. A preparação de suspensões de células únicas permite quantitativo e funcional in vitro análise dos tipos de células principais dos PPs, enquanto imunomarcação de criocortes fornece informações sobre a localização de tipos específicos de células, bem como a interacções célula-célula que existem in situ. A principal limitação de ambas estas abordagens é que nem representa "tempo real" de visualização de PP interacções célula-célula. Por enquanto, pelo menos, PPs provaram impermeável à imagiologia intravital, uma técnica que revolucionou o entendimento de linfócitos Dynamics em linfonodos periféricos. Até as barreiras técnicas que limitam imagens intravital de PPs são superados, os protocolos descritos neste artigo para preparar PP preparações de células individuais para análise por citometria de fluxo e funcional e criosseções PP para imunomarcação permanecerá o principal meio de investigar e compreender as funções imunológicas de sub específicas -populações de células em PPC, os sítios primários indutivos de intestino tecidos linfóides associados.

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    Disclosures

    Não há conflitos de interesse declarados.

    Acknowledgements

    Agradecemos Renjie Song (Wadsworth Centro Núcleo de Citometria de Fluxo) para assistência na análise de células e Johnson Helen (Wadsworth centro animal Histopatologia Core) para a preparação de parafina. Agradecemos ao Dr. Richard A. Cole (Wadsworth Centro Núcleo de Microscopia de luz) para a assistência com microscopia confocal e coleção de imagens. Nós gostaríamos de agradecer Andy Bentley (Wadsworth Center Foto e Ilustração) para assistência com animações.

    MDJ é apoiado pela Fundação de Pesquisa de Ciências da Vida, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Fellowship. SA é suportado por um Centro de Pesquisa em Saúde-Wadsworth Inc. comunhão intramural de pós-doutorado. Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH HD061916 e GM082978.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    OCT Compound Tissue-Tek 4583
    7x7x5 mm Base Molds Fisherbrand 22-363-552
    ImmEdge Pen Vector Labs H-4000
    Superfrost Plus Slides Thermo Scientific 4951
    Edge Rite Blade Thermo Scientific 4280L
    Anti-Mouse CD11c-PE eBioscience 17-0114-82
    Anti-Mouse CD45R/B220-APC BD Pharmigen 553092
    Anti-Mouse CD3-FITC BD Pharmigen 561798
    Anti-Mouse CD4-PE BD Pharmigen 553652
    Anti- Mouse CD8-PE BD Pharmigen 553032
    Anti-Mouse CD19-PercP BioLegend 115531
    Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red Fisher Scientific 14175-079
    70 μm cell strainer BD Falcon 352350
    Spleen Dissociation Medium Stem Cell Technologies 7915
    Goat serum Invitrogen 16210-072
    Fc Block ATCC 2.4.G2 HB-197 Supes obtained from cell line 2.4.G2
    Curved Scissor F.S.T 14061-09
    Cryostat Leica 3050S
    FACS Calibur BD
    Countess Cell Counter Invitrogen
    Hematoxylin Richard Allan 7211
    Eosin Richard Allan 71304
    Formalin Starplex Scientific 3661

    Table 1. Reagents and equipment used in this study.

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    References

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