Isolare e Immunostaining linfociti e le cellule dendritiche da placche di Peyer murino di

Immunology and Infection

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Summary

Vi è un crescente interesse per la comprensione delle funzioni immunologiche specifiche sottopopolazioni di cellule nelle placche di Peyer (PP), i siti primari induttivi di gut-tessuti linfoidi associati. Qui delineare protocolli paralleli per la preparazione di PP preparazioni di cellule singole per l'analisi di citometria a flusso e criosezioni PP per immunostaining.

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De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches. J. Vis. Exp. (73), e50167, doi:10.3791/50167 (2013).

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Abstract

Placche di Peyer (PP) sono parte integrante dei tessuti linfoide associato all'intestino (GALT) e gioca un ruolo centrale nella immunosorveglianza intestinale e l'omeostasi. Antigeni particolato e microbi nel lume intestinale sono continuamente campionata da PP cellule M nel follicolo-associato epitelio (FAE) e trasportato a una rete sottostante di cellule dendritiche (DC), macrofagi e linfociti. In questo articolo, descriviamo protocolli in cui PPs murini sono (i) dissociato in sospensioni di cellule singole e sottoposti a citometria di flusso e (ii) preparato per criosezionamento e immunocolorazione. Per citometria di flusso, PP sono dissociate meccanicamente e poi filtrata attraverso membrane 70 micron per generare sospensioni di cellule singole libere delle cellule epiteliali e detriti grande. Partendo con 20-25 PP (da quattro topi), questo metodo veloce e riproducibile produce una popolazione di> 2,5 x 10 6 cellule con> vitalità cellulare del 90%. Per criosezionamento, frescoPP ly isolati sono immersi in ottimale temperatura di taglio (OCT) medio, snap-congelato in azoto liquido, e quindi sezionato con un cryomicrotome. Le sezioni di tessuto (5-12 micron) sono essiccati all'aria, fissato con acetone o metanolo, e quindi sottoposti a immunomarcatura.

Introduction

Placche di Peyer (PP) sono aggregati macroscopici organizzati follicoli linfoidi presenti in tutto l'intestino tenue di esseri umani e topi (Figura 1) e costituiscono i siti primari avviate mucosali risposte immunitarie contro antigeni alimentari, batteri commensali, patogeni microbici e vaccini orali 1-4. A differenza di altri tessuti linfoidi periferici, come i linfonodi mesenterici, PPs mancano vasi linfatici afferenti. Come tali, le risposte immunitarie in PP sono guidati in risposta ad antigeni derivati ​​dal lume intestinale. Il campionamento di antigeni luminali è compiuta la dal follicolo-associata epitelio (FAE), che consiste di due enterociti e antigene-campionamento cellule note come cellule M. Sotto la FAE, nel sub-epiteliale cupola (SED) regione, si trova una rete di cellule dendritiche (DC), mescolate con i macrofagi, cellule B e le cellule T CD4 + 5-9. Al centro di ogni follicl PP linfoidee sono cellule follicolari dendritiche (FDC) e una a cellule B ricco di centro in centro germinale, fiancheggiata da cellule T-zone ricche interfollicolari. Campionamento Antigen dai risultati PPs nello sviluppo di IgA + plasmablasts cellule B e le cellule effettrici CD4 + e la memoria che le sementi della lamina propria circostante e garantire l'immunità a una vasta gamma di invasori della mucosa.

Dissezione gli eventi immunologici complessi associati con il campionamento antigene, l'elaborazione e la presentazione in PP è un compito arduo, considerando che le cellule PP costituiscono solo una piccola frazione delle cellule linfoidi in totale mucosa intestinale. Per aiutare nella caratterizzazione in vitro di cellule in questo ambiente, forniamo un protocollo per la preparazione di cellule totali topo PP per analisi citofluorimetrica e funzionale, nonché un protocollo per la preparazione di PP criosezioni per immunofluorescenza e immunoistologia. Il nostro protocollo per l'isolamento, la caratterizzazione, e immunostaining di protocolli d'intesaposta cellule PP non è nuova di per sé, come dimostra il fatto che ci sono numerosi riferimenti risalgono a più di 25 anni che citano queste tecniche 5,6,9-11. Piuttosto, il nostro protocollo prevede una snella (e visivo) Metodo per investigatori raccolta PPs per la prima volta. Le tecniche che descrivono facilmente padronanza e prontamente produrre un gran numero di cellule con> la vitalità cellulare del 90%. Il protocollo criosezionamento produce sezioni seriali altamente riproducibili ideali per la colorazione e immunofluorescenza confocale. Inoltre, il nostro protocollo integra altri due articoli recenti Giove. Il primo, di Fukuda e colleghi, descrive l'uso di saggi ligato anello ileali per valutare la diffusione dei batteri patogeni da PP cellule M 12. L'altro, da Geem e colleghi, descrive l'isolamento e la caratterizzazione di cellule dendritiche e macrofagi dalla mucosa intestinale del mouse, ma esclude esplicitamente dalla loro analisi PP 13.

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Protocol

Gli animali sono stati alloggiati sotto convenzionali, esenti da organismi patogeni specifici condizioni e sono stati trattati nel pieno rispetto Institutional Animal Care del Centro Wadsworth e uso Comitato (IACUC) le linee guida.

1. Sonda gastrica

  1. (Opzionale) topo ceppo Gavage di scelta con l'antigene o microbi di interesse utilizzando un 22 G x1.5-in. blunt-end ago alimentazione (Popper scientifico, New Hyde Park, NY). I volumi di consegna non deve superare i 400 microlitri per topo.

2. Isolamento delle cellule PP per Citometria a Flusso

  1. Eutanasia topi da CO 2 asfissia, secondo la cura degli animali istituzionale e uso delle commissioni (IACUC) le linee guida.
  2. Pulire l'addome con il 70% di etanolo o betadine prima dell'intervento. Eseguire una laparotomia standard che coinvolge un singolo (1 cm) incisione con le forbici chirurgiche di qualità lungo la linea mediana inizio circa 1,5 cm dalla base della gabbia toracica. Esporre il percavità itoneal e identificare il cieco. Snip l'intestino terminale piccolo al ileale-cecale giunzione e rimuovere delicatamente l'intestino nella sua interezza. Fare attenzione a non estendersi troppo il tessuto intestinale mentre viene rimosso dalla cavità peritoneale.
  3. Posare il piccolo intestino su un letto di tovaglioli di carta umidi o Kimwipes. Bagnare il piccolo intestino delicatamente con soluzione fisiologica per prevenire la disidratazione dei tessuti. Identificare visivamente PPs singoli posti sul lato anti-mesenterico dell'intestino (Figura 1). In genere, un mouse deve 5-10 PP visibili che sono uniformemente distribuiti dal duodeno (prossimale) a ileo (distale). In media, i topi quattro produrrà 23 PP.
  4. Utilizzando curve forbici chirurgiche, PPS singoli accise delicatamente e metterli in soluzione salina bilanciata di Hank fredda (HBSS). Nota, le forbici devono essere posti curva verso l'alto sopra la PP e poi delicatamente applicata al tessuto. Accise solo il PP (non surrounding tessuto) e trasferimento in HBSS freddo.
    Nota: Tutte le incubazioni e le fasi di centrifugazione da questo punto in avanti nella sezione 2 dovrebbe essere fatto a 4 ° C per preservare la vitalità cellulare.
  5. Trasferire PPs in 5 ml di dissociazione Medio Milza e incubare per 15-20 minuti a 37 ° C, mentre scuotendo vigorosamente a 250 giri al minuto. Tempo di incubazione più lungo influenzerà negativamente la vitalità cellulare.
  6. Per generare una sospensione di cellule singole, PP posto su una sterile (sterilizzato) 70 filtro nylon cella um maglie e forzatamente macinare il tessuto in maglia utilizzando la base di uno stantuffo di una siringa da 1 cc. In alternativa, PPs a sandwich tra due lastre di vetro sterili microscopio smerigliato (autoclave in buste) e delicatamente macinare tessuti con un movimento avanti e indietro. Utilizzare una pipetta sterile di trasferimento per trasferire la sospensione cellulare in una provetta 5 ml Falcon.
  7. Aggiungere EDTA ad una concentrazione finale di 1 mM alla sospensione cellulare. Incubare su un agitatore per5 min a temperatura ambiente.
  8. Sospensione cellulare Decantare attraverso un secondo filtro 70 micron delle cellule per rimuovere eventuali aggregati rimanenti detriti cellulari o tessuti. Raccogliere le cellule in un tubo 15 o 50 ml.
  9. Cellule soggette a centrifugazione dolce (5 min a 500 xg). Decantare il surnatante e risospendere le cellule in tampone di flusso, che è salina tamponata con fosfato (PBS) contenente 1% di siero fetale bovino (FCS).
  10. Per determinare il numero e la vitalità cellulare, le cellule diluire 1:10 in trypan blu e ispezionare visivamente le cellule utilizzando un microscopio ottico e un emocitometro. In alternativa, un contatore di cellule Countess (Invitrogen) o uno strumento simile può essere utilizzato per enumerare automaticamente i numeri e la vitalità cellulare.
    A partire con 20-25 PPs, questo protocollo dovrebbe produrre> 2,5 x 10 6 cellule totali. Ciò equivale a ~ 0,8-1,2 x 10 6 cellule per il mouse.

Etichettatura degli anticorpi di cellule di citometria a flusso

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  • Dispensare cellule (10 5 per pozzetto) in pozzetti di una piastra a 96 pozzetti fondo tondo.
  • Piastra soggetta a centrifugazione leggera (5 min a 1000 xg), e decantare supernatante capovolgendo delicatamente la piastra.
  • Risospendere le cellule in tampone blocco Fc e incubare su ghiaccio per 15 min. Mentre ci sono un certo numero di commercialmente disponibili buffer blocco FC (es. ratto anti-topo CD16/CD32, BD Biosciences), è sufficiente utilizzare un mezzo trascorso da B ratto cellulare di ibridoma (ATCC 2.4.G2) che secerne un anticorpo monoclonale murino contro IgG 1 Fcy recettori per questo passo.
  • Piastra soggetta a centrifugazione leggera (5 min a 1000 xg) come sopra, e decantare supernatante capovolgendo delicatamente la piastra.
  • Aggiungere fluoroforo anticorpi coniugati direttamente sospensioni cellulari a diluizione desiderato, e incubare su ghiaccio per 30 min con dondolo continua.
  • Piastra di riserva di centrifugazione dolce (5 min a 1.000 xg), e decantaresupernatante capovolgendo delicatamente la piastra.
  • Lavare le cellule con 100 pl di tampone di flusso.
  • Centrifugare piastra a 1000 xg per 5 minuti, e decantare supernatante capovolgendo delicatamente la piastra.
  • Risospendere le cellule 400 microlitri tampone di fissaggio, che consiste in 300 pl di tampone di flusso e 100 pl di 1% paraformaldeide in PHEM buffer (60 mM, PIPES 25 mM HEPES, 10 mM EGTA, 4 mM MgCl 2 a pH 6).
  • Cellule riserva di citometria a flusso utilizzando un FACSCalibur o equivalente. Analizzare i risultati utilizzando Quest versione inglese del software Pro 5.2.
  • 3. Preparazione di criosezioni PP

    1. In anticipo di raccolta di tessuti, aggiungere ottimale temperatura di taglio (OCT) composto a base di stampi 7x7x5 mm plastica. Inoltre preparare una pozza di azoto liquido (> 750 ml) in un secchio dewar o ghiaccio.
    2. Euthanize mouse e eseguire un laparotamy, come descritto sopra. Rimuovere intestino e il luogo su carta assorbente bagnato.
    3. Aisolare PPs per cyrosectioning, tagliare 0,5 centimetri segmenti trasversali di piccolo intestino contenenti un unico PP e tessuto trasferimento in una capsula di Petri contenente PBS. Lavare delicatamente il lume di questi segmenti con PBS per rimuovere indesiderati detriti fecali.
    4. Inserire i segmenti del tessuto intestinale in verticale all'interno di stampi di base contenenti ottobre Immergere gli stampi in azoto liquido e permettono tessuto di congelare completamente (1-2 min). Il colore del PTOM cambia da chiaro a bianco quando il tessuto è completamente congelato. . Per un raffreddamento più graduale (ad esempio, per ridurre la rottura del PTOM), la muffa immergere in un bagno di isopentano raffreddato con vapori di azoto liquido Nota: Indossare occhiali di sicurezza appropriate quando si lavora con l'azoto liquido.
    5. Rimuovere stampi di base congelati dal azoto liquido con pinze e consentire lo stampo riscaldare a temperatura ambiente per il tempo necessario (~ 10-15 sec) per consentire ai bordi del blocco ottobre per ammorbidire. Per rimuovere il blocco di ghiacciato di ottobre dalo stampo, capovolgere lo stampo e premere delicatamente sulla parte posteriore per espellere il blocco su un panno pulito 4 x 4 pezzi cm foglio di alluminio. Immediatamente avvolgere il tessuto in stagnola e posto in un sacchetto campione etichettato conservati in azoto liquido o in ghiaccio secco. In alternativa, trasferire tessuto in congelatore (<-20 ° C). Utilizzare il tessuto entro una settimana, altrimenti i blocchi diventa fragile con l'età.

    Criosezionamento

    1. Cryosection il tessuto utilizzando un Leica CM3050S cryomicrotome o equivalente. La temperatura della camera del criostato deve essere impostato a -21 ° C.
    2. Tendere sezioni che sono 12-14 pm di spessore.
    3. Raccogliere sezioni su Fisher SuperFrost Plus (o equivalente) vetrini per microscopio e ispezionare visivamente con un basso livello di potenza microscopio ottico. Se più sezioni sono stati raccolti su una diapositiva, in modo che essi sono raggruppati insieme per le applicazioni di colorazione a valle.
    4. Negozio di tscivola a temperatura ambiente in una scatola e, idealmente, li usano in pochi giorni.

    Etichettatura di anticorpi criosezioni e analisi al microscopio confocale

    1. Immergere i vetrini in acetone (o metanolo) in vaso tessuto colorazione o rack per 2 min. Incubazione prolungato può causare tessuti per staccare dalla diapositiva.
    2. Trasferire diapositive a vaschetta di colorazione nuovo e lavare 3 volte con PBS-T (1X PBS con 0,05% Tween-20) per 3 min ciascuna.
    3. Restringere le sezioni con una penna idrofobo ImmEdge. Questo farà sì che i reagenti e gli anticorpi rimarrà confinato in quell'area durante l'incubazione.
    4. Incubare i vetrini in tampone di blocco (siero di capra 2% in PBS) per 30 min a 37 ° C in una camera umidificata, al riparo dalla luce.
    5. Incubare vetrini con tampone blocco Fc (vedi sopra) per 10 min a 37 ° C.
    6. Immergere i vetrini in PBS-T e asciutto intorno sezioni utilizzando Kimwipes o su altri tessuti assorbenti.Fare attenzione a non toccare le sezioni di tessuto reali.
    7. Sezioni tissutali overlay con soluzione di anticorpo primario e incubare per 30 min a 37 ° C in una camera umidificata. Anticorpo primario è normalmente diluita in tampone di blocco ad una concentrazione finale di 20 pg / ml. L'uso di anticorpi marcati direttamente primari è desiderabile, perché ben tre anticorpi possono essere combinati direttamente a questa fase. Anticorpi marcati direttamente anche eliminare la necessità di ulteriori passaggi di incubazione dell'anticorpo.
    8. Lavare i vetrini 3 volte (5 minuti ciascuno) per immersione in PBS.
    9. Se necessario, i vetrini incubare con anticorpi secondari pertinenti per 30 min a 37 ° C in una camera umida.
    10. Lavare i vetrini 3 volte (5 minuti ciascuno) per immersione in PBS.
    11. Incubare i vetrini per 4 min in 1% paraformaldeide in tampone PHEM, come descritto sopra.
    12. Sciacquare i vetrini con PBS per 1 min.
    13. Zona intorno a secco sezioni utilizzando Kimwipes o altri assorbireent tessuto. Fare attenzione a non toccare le sezioni di tessuto reali. Usando una pipetta o contagocce, posizionare con cura una goccia di prolungare medie Oro montaggio diretto sulla sezione. Applicare un coprioggetto di vetro sul supporto di montaggio avendo cura di evitare bolle. Utilizzare carta assorbente per assorbire l'eccesso di terreno di montaggio.
    14. Seal coprioggetti per vetrini da microscopio con smalto commerciale e lasciare asciugare all'aria.
    15. Visualizzare le diapositive con una Leica TCS SP5 o equivalente microscopio confocale.

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    Representative Results

    Analisi citofluorimetrica di sospensioni monodisperse del totale delle cellule PP rivela una chiara distinzione tra preparazioni di cellule buone e poveri. In preparazioni di cellule buoni rapporti con oltre l'80% la redditività, la maggior parte delle cellule dimostrano alta forward scatter (FSC), un indicatore di volume cellulare alta, e disperdere lato basso (SSC), un indicatore di granularità delle cellule basso (Figura 2A). In questo esperimento, abbiamo anche volutamente preparato un "cattiva preparazione cella" incubando le cellule PP durante i passaggi di isolamento a temperatura ambiente (anziché sul ghiaccio) e, nell'ultimo passaggio, incubando le cellule con PBS più 1% FCS (anziché PHEM tampone). In queste preparazioni di cellule poveri, la maggior parte delle cellule presentano bassa e alta FSC SSC e sono al di fuori del cancello indicato R1 (Figura 2B). Queste cellule sono probabilmente incontro ad apoptosi e / o necrosi.

    Figura 3 illustra l'utilizzo di un cocktail di fino a quattro different anticorpi monoclonali coniugati con fluorocromo a discriminare tra una varietà di tipi di cellule in sospensioni di cellule singole PP. Etichettatura con cluster di differenziazione (CD) marcatori CD19 e B220 rivelano che le cellule B costituiscono ~ 60% della popolazione cellulare gated PP (Figura 3A). Specifiche sottopopolazioni di cellule T possono essere facilmente enumerate da doppia marcatura con anticorpi anti CD3 e CD4 (Figura 3B) o CD8 e CD3 (Figura 3C). CD4 + e CD8 + T costituiscono ~ 23% e il 9%, rispettivamente delle cellule totali PP. DC sottoinsiemi etichettato CD11c + (Figura 3D) e CD103 + (non mostrato) può anche essere enumerate da questo metodo. CD11c + DC contribuiscono a circa l'8% della popolazione totale gated, il che corrisponde circa a 10.000 DC per PP. Questo concorda esattamente con il numero di DC osservato da altri 14.

    Tra la popolazione di CD11c + + B220. Risultati simili sono ottenuti quando le cellule sono raccolte dal PP C57B / 6 topi (Figura 3E).

    "Poveri" preparazioni di cellule può portare a risultati altamente fuorvianti, in gran parte perché le cellule morte o morenti tendono a legarsi anticorpi non specificamente. Come mostrato in figura 4, la popolazione di cellule che macchiano positivo sia per il marcatore cellule B (B220) ed i marcatori di cellule T (CD3, pannello A, CD4, pannello B) può variare di più di tre volte tra una buona e preparato cellulare cattivo. Figura 4 mostra una rappresentazione più di + B220 e CD3 + doppio cellule positive (Pannello A), così come B220 + cellule B e cellule T CD4 + cellule doppio positive (Pannello B) in preparazioni di cellule poveri. Come menzionato sopra, la disparità B relativa e numero di cellule T in buona contro poveri è probabilmente dovuto al legame non specifico degli anticorpi cellule morenti.

    Il nostro protocollo dimostra anche che il mouse criosezioni PP sono suscettibili di analisi istopatologica, così come immunomarcatura. Figura 5 mette a confronto la colorazione H & E di paraffina del mouse PPs (pannelli A, B) e sezioni congelate (pannello C). Mentre le sezioni di paraffina fornire maggiore risoluzione a livello cellulare quando macchiata da H & E, le zone chiare e scure di PP centri germinativi sono più facilmente delimitata in sezioni cryosection (Figure 5A-C). Criosezioni H & E-tinto sono utili per side-by-side di confronto con criosezioni immunolabeled. Un tipico PP cryosection colorate con anticorpi anti-CD3 per marcare le cellule T, anticorpi anti-CD11c per evidenziare DC e anti-B220 anticorpi per evidenziare cellule B è mostrato in Figura 6.

    Figura 1
    Figura 1. Mouse Peyer PATChes. Immagine di un intestino topo appena asportato piccola con tre PP visibili (frecce bianche). I partners di blister appaiono come strutture simili (5 x 5 mm) sul anti-mesenterico lato della sierosa intestinale.

    Figura 2
    Figura 2. Totale cellule PP mediante citometria a flusso. Una sospensione monodispersa del totale delle cellule PP è stato sottoposto a citometria a flusso utilizzando un FACSCallibur BD. (A) Esempio di preparazione cellulare buona. La stragrande maggioranza delle cellule dimostrano alta forward scatter (FSC), un indicatore di volume cellulare alta, e disperdere lato basso (SSC), un indicatore di granularità delle cellule basso. Queste cellule sono in scatola in R1. Cellule con alta e bassa FSC SSC, situato fuori del cancello R1, sono considerati morti o morenti cellule. (B) Esempio di preparazione cellulare povero, in cui la maggior parte delle cellule sono fuori dal cancelloR1 a causa della bassa e alta FSC SSC.

    Figura 3
    Figura 3. Analisi di citometria di flusso rappresentativi di linfociti PP. Sospensioni monodisperse di cellule totali PP incubate con anticorpi primari fluoroforo-coniugati e quindi sottoposti a citometria di flusso. (A) etichettatura CD19 e B220 di PP cellule B. (BC) doppio etichettatura di popolazioni cellulari totali con CD3 e CD4 (B) o CD8 (C) per enumerare specifici sottogruppi di cellule T. (D) a doppia etichettatura delle popolazioni di cellule totali per B220 (marcatore delle cellule B) e CD11c (marcatore DC). (E) Confronto B220, CD3 , CD4 e la colorazione CD11c su cellule PP da BALB / c e topi C57B / 6.

    Figura 4
    Figura 4. Citometria a flusso di dati fuorvianti a causa di poveri preparazioni di cellule PP. Buona (pannelli a sinistra) e poveri (pannelli a destra) preparazioni cellulari PP sono state colorate con (A) gli anticorpi anti CD3 e B220 per differenziare delle cellule B e T o (B) anticorpi a B220 e CD4 per differenziare le cellule B da un sottogruppo di cellule T. Ci sono generalmente molto poche cellule di cellule che macchiano B220 positive per CD4 e CD3 o, come mostrato nei pannelli di sinistra. Al contrario, in preparazioni di cellule doppio positive povere cellule costituiscono circa il 20% delle cellule totali. Vedere il testo per ulteriori informazioni su ciò che costituisce una preparazione "povero" cella.

    Figura 5
    Figura 5. Rappresentante H & E-colorate sezioni PP. Incluse in paraffina sezioni (A, B) o criosezioni (C) di PP ileales sono state colorate con H & E e visualizzati mediante microscopia ottica. Notare che le zone chiare e scure dei follicoli linfoidi sono facilmente delimitati nelle criosezioni, rispetto alle sezioni in paraffina. Abbreviazioni: V, villosi, FAE, follicolo-associato epitelio, SED, sub-epiteliale cupola, LF, follicolo linfoide.

    Figura 6
    Figura 6. Etichettatura immunofluorescenza di murini criosezioni PP. Appena tagliata sezioni di tessuto di un mouse PP erano essiccato all'aria, acetone-fisso, e colorati con (A) FITC-coniugati anti-CD3 anticorpi per marcare le cellule T nei inter-follicolari regioni e lamina propria, (B) PE-coniugati anti-CD11c anticorpi per evidenziare controller del SED, e (C) APC-coniugati anti-B220 anticorpi per evidenziare le cellule B (D) Un composito o.f le immagini in pannelli AC generati utilizzando il software Fiji. Bar Scala è ~ 100 micron.

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    Discussion

    In questo articolo, abbiamo fornito protocolli paralleli per la preparazione di PP preparazioni di cellule singole per l'analisi di citometria a flusso e funzionale e criosezioni per immunostaining. Entrambi i metodi sono altamente riproducibili e facilmente accessibile, fornito un citofluorimetro e criostato sono disponibili. Per investigatori prima volta è opportuno sottolineare che, rispetto alla milza, produzioni di cellule totali di PP sono relativamente scarse. Tuttavia, il protocollo delineiamo generalmente rendimenti tra 0,8-1,2 x 10 6 cellule totali PP da un mouse. Scale-up è possibile, anche se in genere non più di 20-25 piscina PP, perché, nella nostra esperienza, l'aggregazione si verifica e raccolta di cellule (e la redditività) declino notevolmente. D'altra parte, non è consigliabile utilizzare meno di 15 PPs per questo protocollo, come una massa critica occorre effettuare correttamente le cellule attraverso l'intera procedura di isolamento. Se la vitalità cellulare è una priorità massima per la valle funzionalesaggi, si consiglia di un piccolo campione di cellule isolate essere sottoposto a colorazione con ioduro di propidio per consentire gating più accurata è la piscina vitale delle cellule del totale popolazione di cellule PP. Infine, va rilevato che il nostro metodo è suscettibile di applicazione sorting cella se un sottoinsieme cella specifica è desiderata per il trasferimento adottivo o analisi in vitro, per esempio.

    La collezione di PP per criosezionamento è relativamente semplice, anche se il sezionamento effettiva dei tessuti PP può essere impegnativo. È imperativo, per esempio, che i tessuti PP sono correttamente orientata in stampi (cioè perpendicolare alla base dello stampo) per assicurare che le sezioni trasversali si ottengono veri. Proponiamo snap-congelamento tessuti PP e sottoponendo poi i criosezioni a precipitare fissativi come acetone o metanolo preservare reattività anticorpale ("antigenicità"), anche se la precipitazione fissativi risultato in una diminuzione complessiva resolo cellulare e subcellulareution. Se la conservazione antigenicità non è un problema particolare, quindi si consiglia l'uso di reticolazione fissativi come paraformaldeide (PFA), che si traducono in una migliore conservazione di strutture cellulari e sub-cellulari. Infatti, PFA può essere utilizzato per fissare i tessuti prima criosezionamento. Basta immergere freschi PP asportati in grandi quantità del 4% PFA per> 2 ore, lavare il tessuto con PBS per rimuovere fissativo in eccesso, equilibrare tessuto in saccarosio (15%) se lo si desidera, e poi incorporare in OCT, come descritto in precedenza. Il tessuto può essere cryosectioned, ma deve essere bloccato con soluzione di glicina (0,1 M in PBS per 15 min) per spegnere residuo reattivo PFA prima dell'immunocolorazione.

    Infine, mentre abbiamo descritto i protocolli per l'etichettatura di immunofluorescenza criosezioni PP, queste stesse sezioni sono suscettibili di immunoistochimica (IHC) utilizzando i kit disponibili in commercio (ad esempio IHC Vector Labs, Burlingame, CA). Per IHC, è indispensabile prevedere una perossidasi blocco o QuEnching passo nel protocollo, come perossidasi endogene sono altamente prevalenti nella mucosa intestinale. Altri hanno notato che per IHC, perfusione cardiaca dei topi con paraformaldeide al 4% in PBS migliora la conservazione dei tessuti.

    In sintesi, abbiamo fornito protocolli paralleli e complementari per l'analisi quantitativa e funzionale di cellule murine PP, tra cui linfociti e DC. La preparazione di sospensioni di cellule singole consente quantitativa e funzionale in vitro analisi dei principali tipi di cellule in PP, mentre immunomarcatura di criosezioni fornisce informazioni relative alla localizzazione dei tipi cellulari specifici, nonché interazioni cellulari che esistono in situ. Il limite principale di entrambi questi approcci è che non rappresenta "real time" visualizzazione di PP interazioni cellula-cellula. Per il momento almeno, PP si sono dimostrati impermeabili a intravitale imaging, una tecnica che ha rivoluzionato la comprensione di linfociti dinamicamentecs nei linfonodi periferici. Fino a quando le barriere tecniche che limitano l'imaging intravitale di PP sono superati, i protocolli descritta in questo articolo per la preparazione di PP preparazioni di cellule singole per l'analisi di citometria a flusso e funzionale e criosezioni PP per immunostaining rimane il mezzo principale di indagare e comprendere le funzioni immunologiche di sub specifici -popolazioni di cellule in SPA, i siti primari induttivi di tessuto linfoide associato.

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    Disclosures

    Nessun conflitto di interessi dichiarati.

    Acknowledgements

    Ringraziamo canzone Renjie (Wadsworth Nucleo Centro Citometria di flusso) per l'assistenza in analisi di cellule e Helen Johnson (Wadsworth Centro Animal Istopatologia Core) per la preparazione delle sezioni di paraffina. Ringraziamo il Dott. Richard A. Cole (Wadsworth Core Light Centro di microscopia) per l'assistenza con la microscopia confocale e raccolta di immagini. Vorremmo riconoscere Andy Bentley (Wadsworth Center Foto e Illustrazione) per l'assistenza con le animazioni.

    MDJ è supportato dal Life Sciences Research Foundation, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Fellowship. SA è supportato da un Centro di Salute-borsa Wadsworth Research Inc. intramurale post-dottorato. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni NIH HD061916 e GM082978.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    OCT Compound Tissue-Tek 4583
    7x7x5 mm Base Molds Fisherbrand 22-363-552
    ImmEdge Pen Vector Labs H-4000
    Superfrost Plus Slides Thermo Scientific 4951
    Edge Rite Blade Thermo Scientific 4280L
    Anti-Mouse CD11c-PE eBioscience 17-0114-82
    Anti-Mouse CD45R/B220-APC BD Pharmigen 553092
    Anti-Mouse CD3-FITC BD Pharmigen 561798
    Anti-Mouse CD4-PE BD Pharmigen 553652
    Anti- Mouse CD8-PE BD Pharmigen 553032
    Anti-Mouse CD19-PercP BioLegend 115531
    Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red Fisher Scientific 14175-079
    70 μm cell strainer BD Falcon 352350
    Spleen Dissociation Medium Stem Cell Technologies 7915
    Goat serum Invitrogen 16210-072
    Fc Block ATCC 2.4.G2 HB-197 Supes obtained from cell line 2.4.G2
    Curved Scissor F.S.T 14061-09
    Cryostat Leica 3050S
    FACS Calibur BD
    Countess Cell Counter Invitrogen
    Hematoxylin Richard Allan 7211
    Eosin Richard Allan 71304
    Formalin Starplex Scientific 3661

    Table 1. Reagents and equipment used in this study.

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    References

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