Isoleren En Immunokleuring Lymfocyten en dendritische cellen uit Patches Murine Peyer

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Er is een toenemende belangstelling voor het begrijpen van de immunologische functies van specifieke subpopulaties van cellen in platen van Peyer (PP), de primaire inductieve plaatsen van darm-geassocieerd lymfeweefsel. Hier schetsen we parallel protocollen voor de voorbereiding van PP enkele cel voorbereidingen voor flowcytometrische analyse en PP cryocoupes voor immunokleuring.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches. J. Vis. Exp. (73), e50167, doi:10.3791/50167 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Plaques van Peyer (PP) zijn integrale componenten van het darm-geassocieerd lymfeweefsel (GALT) en spelen een centrale rol in de darm immunosurveillance en homeostase. Particulate antigenen en microben in het darmlumen worden continu bemonsterd door PP M cellen in de follikel-geassocieerde epitheel (FAE) en naar een onderliggende netwerk van dendritische cellen (DCs), macrofagen en lymfocyten. In dit artikel beschrijven we protocollen die zijn murine PP (i) gedissocieerd in enkele celsuspensies en onderworpen aan flowcytometrie en (ii) bereid voor cryosectioning en immunokleuring. Voor flowcytometrie, PPs mechanisch gedissocieerd en daarna gefiltreerd door membranen 70 urn tot enkele celsuspensies zonder epitheelcellen en grof vuil genereren. Beginnen met 20-25 PP (van vier muizen), deze snelle en reproduceerbare methode levert een populatie van> 2,5 x 10 6 cellen met> 90% levensvatbaarheid van de cellen. Voor cryosectioning, versely geïsoleerde PP worden ondergedompeld in Optimale Cutting Temperatuur (LGO) medium, snap-ingevroren in vloeibare stikstof, en dan coupes met behulp van een cryomicrotoom. Weefselcoupes (5-12 um) de lucht gedroogd, gefixeerd met aceton of methanol, en vervolgens onderworpen aan immunokleuring.

Introduction

Peyer's Patches (PP) zijn macroscopische aggregaten georganiseerde lymfoïde follikels aanwezig in de dunne darm van mensen en muizen (figuur 1) en het primaire plaatsen waar mucosale immuunresponsen ingeleid dieet antigenen, commensale bacteriën, pathogene micro-organismen en orale vaccins 1-4. In tegenstelling tot andere perifere lymfoïde weefsels zoals de mesenteriale lymfeklieren, PPs missen afferente lymfevaten. Als zodanig adaptieve immuunreacties in PP worden aangedreven in reactie op antigenen uit het darmkanaal. De bemonstering van luminale antigenen wordt uitgevoerd door het de follikel-geassocieerde epitheel (FAE), die bestaat uit zowel enterocyten en antigen-sampling cellen bekend als M cellen. Onder de FAE, in de sub-epitheliale dome (SED) gebied, ligt een netwerk van dendritische cellen (DCs) vermengd met macrofagen, B-cellen en CD4 + T-cellen 5-9. Aan de basis van elk PP lymfoïde follicle zijn folliculaire dendritische cellen (FDC) en een B cel-rijk centrale kiemcentrum, geflankeerd door T cellenrijke interfolliculaire zones. Antigen bemonstering door PP resulteert in de ontwikkeling van IgA + B cel plasmablasten en CD4 + effector en geheugencellen dat zaad de omringende lamina propria en bieden weerstand tegen een breed scala aan mucosale indringers.

Opheldering van de complexe immunologische afspraken verbonden aan antigeen sampling, verwerking en presentatie in PP's is een moeilijke taak, gezien het feit dat PP cellen slechts een fractie van de totale lymfoïde cellen in het darmslijmvlies vormen. Om in de steun in vitro karakterisatie van cellen in deze omgeving, bieden wij een protocol voor het bereiden van het totaal muis PP cellen voor flowcytometrische en functionele analyse, evenals een protocol voor de bereiding PP cryocoupes voor immunofluorescentie microscopie en immunohistologie. Ons protocol voor de isolatie, karakterisering, en immunokleuring van mouse PP cellen is niet nieuw op zich, zoals blijkt uit het feit dat er tal van verwijzingen dateren van meer dan 25 jaar dat noemen deze technieken 5,6,9-11. Integendeel, ons protocol biedt een gestroomlijnde (en visuele) methode voor onderzoekers verzamelen PPs voor de eerste keer. De technieken beschrijven we gemakkelijk beheerst en gemakkelijk grote aantallen cellen leveren met> 90% levensvatbaarheid van de cellen. De cryosectioning protocol levert zeer reproduceerbare seriecoupes ideaal voor immunofluorescentiekleuring en confocale beeldvorming. Verder is onze protocol vormt een aanvulling op twee andere recente Jove artikelen. De eerste door Fukuda en collega's beschrijven het gebruik van geligeerde ileal loop assays om de verspreiding van pathogene bacteriën te beoordelen door PP M cellen 12. De andere, door Geem en collega's, beschrijft de isolatie en karakterisering van DCs en macrofagen van de muis darmslijmvlies, maar uitdrukkelijk uitgesloten PP's uit hun analyse 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De dieren werden gehuisvest onder conventionele, specifieke pathogeen-vrije omstandigheden en werden behandeld in volledige overeenstemming met Institutionele Animal Care het Wadsworth Center en gebruik Comite (IACUC) richtlijnen.

1. Orale sondevoeding

  1. (Optioneel) Gavage muizenstam van keuze met een antigeen of microben van belang met behulp van een 22 G x 1,5-in. blunt-end voeding naald (Popper Scientific, New Hyde Park, NY). Levering volumes mag niet meer dan 400 ul per muis.

2. Isolatie van PP cellen voor flowcytometrie

  1. Euthanaseren muizen door CO 2 stikken, volgens de institutionele dierlijke zorg en gebruik comite (IACUC) richtlijnen.
  2. Reinig de buik met 70% ethanol of betadine voorafgaand aan de operatie. Voer een standaard laparotomie dat een (1 cm) incisie met chirurgische kwaliteit schaar langs de middellijn begin ongeveer 1,5 cm van de basis van de ribbenkast omvat. Expose de peritoneal holte en identificeren van de blindedarm. Knip de terminal dunne darm aan het ileum-cecal kruising en verwijder voorzichtig de darm in zijn geheel. Zorg ervoor dat u het darmweefsel hyperextend als het wordt verwijderd uit de peritoneale holte.
  3. Leg de dunne darm op een bedje van vochtige papieren handdoeken of Kimwipes. Bevochtig de dunne darm voorzichtig met een zoutoplossing om weefsel uitdroging te voorkomen. Visueel herkennen individuele PP op de anti-mesenteriale zijde van de darm (figuur 1). Typisch, een muis 5-10 zichtbare PP die gelijkmatig van de twaalfvingerige darm (proximale) verdeeld ileum (distaal). Gemiddeld zal vier muizen opleveren 23 PP's.
  4. Met gebogen chirurgische schaar voorzichtig accijns individuele PP en plaats ze in Balanced Salt Solution koude Hank's (HBSS). Note moet de schaar geplaatst curve naar boven boven het PP en vervolgens voorzichtig op het weefsel. Accijns alleen de PP (niet surrounding weefsel) en transfer naar koud HBSS.
    Opmerking: Alle incubaties en centrifugeren steenworp afstand van dit punt naar voren in paragraaf 2 moet worden gedaan bij 4 ° C tot levensvatbaarheid van de cellen te behouden.
  5. Breng PPs in 5 ml Spleen Dissociation Medium en incubeer gedurende 15-20 min bij 37 ° C krachtig schudden bij 250 rpm. Langere incubatietijd zal een negatieve invloed hebben op levensvatbaarheid van de cellen.
  6. Een enkele celsuspensie plaats PP op een steriele (autoclaaf) 70 pm nylon celzeef mesh genereren en geweld het weefsel malen in de maas met de basis van een plunjer van een 1 cc spuit. Als alternatief, sandwich PPs tussen twee frosted steriele glazen objectglaasjes (geautoclaveerd in enveloppen) en voorzichtig weefsels grind met een heen en weer beweging. Een steriele pipet om de celsuspensie over in een 5 ml Falcon buis.
  7. Voeg EDTA tot een uiteindelijke concentratie van 1 mM aan de celsuspensie. Incubeer op een tuimelschakelaar voor5 min bij kamertemperatuur.
  8. Decanteren celsuspensie door middel van een tweede 70 pm cel zeef om alle resterende cellulaire aggregaten of weefsel vuil te verwijderen. Verzamel cellen in een 15 of 50 ml conische buis.
  9. Onderworpen cellen voorzichtig centrifugeren (5 minuten bij 500 xg). Decanteer supernatant en resuspendeer cellen in flow buffer, die fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) die 1% foetaal kalf serum (FCS).
  10. Om het aantal cellen en levensvatbaarheid te bepalen, verdund 1:10 in cellen trypan blauw en visueel cellen behulp van een lichtmicroscoop en een hemocytometer. Als alternatief kan een Countess celteller (Invitrogen) of iets dergelijks worden gebruikt om automatisch sommen aantal cellen en levensvatbaarheid.
    Beginnend met 20-25 PP, moet dit protocol opleveren> 2,5 x 10 6 cellen totaal. Dit komt overeen ~ 0,8-1,2 x 10 6 cellen per muis.

Antilichaam Labeling van cellen voor flowcytometrie

<ol start = "11">
  • Doseer cellen (10 5 per well) in putjes van een 96 putjes met ronde bodemplaat.
  • Onderworpen plaat zachte centrifugatie (5 min bij 1.000 xg) en decanteer supernatant voorzichtig omkeren van de plaat.
  • Resuspendeer cellen in Fc blokbuffer en incubeer op ijs gedurende 15 minuten. Hoewel er een aantal commercieel verkrijgbare Fc block buffers (bijvoorbeeld rat anti-muis CD16/CD32, BD Biosciences), brachten we gewoon medium van een rat B cel hybridoma (ATCC 2.4.G2) die een monoklonaal IgG 1 uitscheidt muriene Fcy receptoren voor deze stap.
  • Onderworpen plaat zachte centrifugatie (5 min bij 1000 xg) als hierboven en decanteer supernatant voorzichtig omkeren van de plaat.
  • Rechtstreeks toevoegen fluorofoor-geconjugeerde antilichamen tegen celsuspensies op gewenste verdunning, en incubeer op ijs gedurende 30 min onder voortdurend schudden.
  • Onderworpen plaat zachte centrifugatie (5 min bij 1.000 xg) en decanterenSupernatant door voorzichtig omkeren van de plaat.
  • Was de cellen met 100 pl buffer stroom.
  • Centrifugeer plaat bij 1000 xg gedurende 5 minuten en giet supernatant voorzichtig omkeren van de plaat.
  • Hersuspendeer cellen 400 ui fixatie buffer, die bestaat uit 300 ul buffer stroom en 100 pi 1% paraformaldehyde in PHEM-buffer (60 mM PIPES, 25 mM HEPES, 10 mM EGTA, 4 mM MgCl2 bij pH 6).
  • Onderworpen cellen cytometrie met een FACSCalibur of gelijkwaardige stromen. Analyseer de resultaten met behulp van Cell Quest Pro-software versie 5.2.
  • 3. Bereiding van PP Weefsel secties

    1. Vooruitlopend op weefsel verzamelen, voeg Optimale Cutting Temperatuur (OCT) verbinding om 7x7x5 mm plastic basis vormen. Maken ook een pool van vloeibare stikstof (> 750 ml) in een dewar of emmer.
    2. Euthanaseren muis en uitvoeren van een laparotamy, zoals hierboven beschreven. Verwijder darm en plaats op natte papieren handdoeken.
    3. Naarisoleren PPs voor cyrosectioning gesneden 0,5 cm dwars segmenten van de dunne darm met een PP en overdracht weefsel een petrischaal met PBS. Spoel het lumen van deze segmenten met PBS om ongewenste fecale vuil te verwijderen.
    4. Plaats darmweefsel segmenten verticaal in basis-vormen met oktober Dompel de mallen in vloeibare stikstof en laat volledig bevriezen weefsel (1-2 min). De kleur van de LGO zal veranderen van helder tot wit wanneer het weefsel volledig is bevroren. . Voor een meer geleidelijke afkoeling (bijvoorbeeld het verminderen van het kraken van de LGO), dompel schimmel in een bad van isopentaan gekoeld met vloeibare stikstof dampen Opmerking: Draag geschikte veiligheidsbril bij het ​​werken met vloeibare stikstof.
    5. Verwijder bevroren base mallen van de vloeibare stikstof met forceps en laat de mal op kamertemperatuur lang genoeg (~ 10-15 sec) om de randen van de LGO blok te verzachten. Om het diepgevroren blok van de LGO en verwijder uitde mal, verwissel dan de mal en voorzichtig op de achterkant om het blok uit te werpen op een schone 4 x 4 cm stuk aluminiumfolie op. Onmiddellijk wikkel het weefsel in de folie en in een gelabelde monster zak opgeslagen in vloeibare stikstof of droog ijs. Alternatief: breng weefsel in een vriezer (<-20 ° C). Gebruik het weefsel binnen een week, anders blokken bros met de leeftijd.

    Cryosectioning

    1. Cryosection het weefsel met behulp van een Leica CM3050S cryomicrotoom of gelijkwaardig. De kamertemperatuur van de cryostaat worden ingesteld op -21 ° C.
    2. Streef naar secties die zijn 12 tot 14 micrometer dik.
    3. Verzamel secties op Fisher SuperFrost Plus (of gelijkwaardig) glas microscoopglaasjes en inspecteer visueel met behulp van een standaard laag vermogen lichtmicroscoop. Als er meerdere secties worden verzameld op een dia, ervoor te zorgen dat deze worden geclusterd voor downstream kleuringstoepassingen.
    4. Store thij glijdt bij kamertemperatuur in een dia doos en, idealiter, gebruik ze binnen een paar dagen.

    Antilichaam Etikettering van Weefsel secties en confocale microscopie Analyse

    1. Dompel de objectglaasjes in aceton (of methanol) in weefselkleuring pot of rekken gedurende 2 minuten. Langdurige incubatie kan weefsel los te maken van de dia.
    2. Transfer objectglaasjes nieuwe kleuring pot en was 3 maal met PBS-T (1X PBS met 0,05% Tween-20) gedurende 3 min elk.
    3. Omcirkel de secties met een ImmEdge hydrofobe pen. Dit zal ervoor zorgen dat de reagentia en antilichamen zullen blijven beperkt tot dat gebied tijdens de incubaties.
    4. Incubeer slides in blokbuffer (2% geitenserum in PBS) gedurende 30 min bij 37 ° C in een bevochtigde kamer, beschermd tegen licht.
    5. Incubeer slides met Fc block buffer (zie hierboven) gedurende 10 min bij 37 ° C.
    6. Dip dia's in PBS-T en droge gebied rond secties met behulp van Kimwipes of ander absorberend weefsel.Zorg ervoor dat u de werkelijke weefselcoupes aan te raken.
    7. Overlay weefselsecties met primair antilichaam oplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C in een bevochtigde kamer. Primair antilichaam wordt gewoonlijk verdund in blok buffer tot een eindconcentratie van 20 ug / ml. Het gebruik van direct-gelabelde primaire antilichamen is wenselijk omdat zelfs drie antilichamen kunnen direct worden gecombineerd in deze stap. Direct gemerkte antilichamen ook overbodig additioneel antilichaam incubatiestappen.
    8. Wash schuift 3 keer (5 min elk) door onderdompeling in PBS.
    9. Eventueel incubate dia relevante secundaire antilichamen gedurende 30 min bij 37 ° C in een vochtige kamer.
    10. Wash schuift 3 keer (5 min elk) door onderdompeling in PBS.
    11. Incubeer dia's voor 4 min in 1% paraformaldehyde in PHEM-buffer, zoals hierboven beschreven.
    12. Spoel de objectglaasjes met PBS gedurende 1 min.
    13. Droge omgeving van secties met behulp van Kimwipes of andere absorberenent weefsel. Zorg ervoor dat u de werkelijke weefselcoupes aan te raken. Met behulp van een pipet of druppelaar, plaats voorzichtig een druppel direct Verleng Gold montage medium op de sectie. Breng een glazen dekglaasje op het fixeermiddel zorg om luchtbellen te vermijden. Gebruik vloeipapier om overtollig fixeermiddel absorberen.
    14. Seal dekglaasjes te microscoopglaasjes met commerciële nagellak en laat aan de lucht drogen.
    15. Bekijk dia's met een Leica TCS SP5 of gelijkwaardig confocale microscoop.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Flowcytometrische analyse van monodisperse suspensies van het totaal PP cellen blijkt dat er een duidelijk onderscheid tussen goede en slechte celpreparaten. In goede celpreparaten met meer dan 80% levensvatbaarheid, de overgrote meerderheid van de cellen aan te tonen een hoge voorwaartse verstrooiing (FSC), een indicator van hoge celvolume, en lage zijwaartse verstrooiing (SSC), een indicator van lage cel granulariteit (Figuur 2A). In dit experiment ook opzettelijk heeft een "arme celpreparaat" door incubatie PP cellen gedurende de isolatiestappen bij kamertemperatuur (in plaats van op ijs) en, in de laatste stap, het incuberen van cellen met PBS plus 1% FCS (in plaats van PHEM buffer). In deze arme celpreparaten de meerderheid van de cellen vertonen een lage FSC en SSC hoge en buiten de aangegeven poort R1 (Figuur 2B). Deze cellen zijn waarschijnlijk apoptose ondergaan en / of necrose.

    Figuur 3 toont het gebruik van een cocktail van maximaal vier diandere kleur heeft fluorofoor-geconjugeerde monoklonale antilichamen uit een verscheidenheid aan celtypen discrimineren PP enkel-celsuspensies. Labeling met cluster van differentiatie (CD) markers CD19 en B220 onthullen dat B cellen ~ 60% van de celpopulatie gated PP (Figuur 3A) vormen. Specifieke T-cel subsets kunnen gemakkelijk worden opgesomd door dubbele labeling met antilichamen tegen CD3 en CD4 (figuur 3B) of CD3 en CD8 (Figuur 3C). CD4 + en CD8 + T cellen vormen ~ ~ 23% en 9% van het totale PP cellen. DCs Subsets gemerkte CD11c + (Figuur 3D) en CD103 + (niet weergegeven) kan ook worden geteld door deze methode. CD11c + DC's bijdragen aan ongeveer 8% van de totale gated bevolking, die is ongeveer gelijk aan 10.000 DCs per PP. Dit stemt precies overeen met het aantal DCs door anderen waargenomen 14.

    Onder de bevolking van CD11c + +. Soortgelijke resultaten worden verkregen wanneer PP cellen vanuit C57B / 6 muizen (figuur 3E).

    "Poor" celpreparaten kan leiden tot zeer misleidende resultaten, vooral omdat dode of stervende cellen hebben de neiging om antilichamen binden niet-specifiek. Zoals getoond in figuur 4, de populatie van cellen die positief kleuren voor zowel de B-cel marker (B220) en de T-cel markers (CD3, panel A, CD4, panel B) kan variëren van meer dan 3-voudige tussen een goed en slechte celpreparaat. Figuur 4 toont een oververtegenwoordiging van B220 + en CD3 + dubbele positieve cellen (Panel A) en B220 + B-cellen en CD4 + T-cellen dubbele positieve cellen (Panel B) in slechte celpreparaten. Zoals hierboven vermeld, het verschil in relatieve B en T cel aantallen in goed tegen arm wordt waarschijnlijk veroorzaakt door niet-specifieke binding van antilichamen stervende cellen.

    Onze protocol toont ook aan dat PP muis cryosecties vatbaar zijn voor histopathologische analyse, en immunokleuring. Figuur 5 vergelijkt H & E kleuring van muis PPs paraffine (panelen A, B) en ingevroren secties (panel C). Terwijl de paraffine secties bevatten meer resolutie op cellulair niveau wanneer gekleurd door H & E, de lichte en donkere zones van PP germinale centra zijn gemakkelijker afgebakend in cryosection secties (Afbeelding 5A-C). H & E-gekleurde cryosecties zijn nuttig voor side-by-side vergelijking met immunolabeled cryosecties. Een typische PP cryosection gekleurd met anti-CD3 antilichamen tegen de T-cellen, anti-antilichamen CD11c etiket DCs en anti-B220 antilichamen te markeren B cellen te markeren is weergegeven in figuur 6.

    Figuur 1
    Figuur 1. Muis Peyer patches. Afbeelding van een vers uitgesneden muis dunne darm met drie zichtbare PP (witte pijlen). De PP weergegeven als blister structuren (5 x 5 mm) op de anti-mesenteriale zijde van de intestinale serosa.

    Figuur 2
    Figuur 2. Totale PP cellen geanalyseerd door flowcytometrie. Een suspensie van monodisperse totale PP cellen werd onderworpen aan flowcytometrie met een BD FACSCallibur. (A) Voorbeeld van een goede celpreparaat. De overgrote meerderheid van de cellen aan te tonen een hoge voorwaartse verstrooiing (FSC), een indicator van hoge celvolume, en lage zijwaartse verstrooiing (SSC), een indicator van lage cel granulariteit. Deze cellen zijn ingesloten R1. Cellen met lage en hoge FSC SSC, zich buiten R1 poort beschouwd dode of stervende cellen. (B) Voorbeeld van een slechte celpreparaat, waarin de meerderheid van de cellen buiten de gateR1 als gevolg van lage FSC en hoge SSC.

    Figuur 3
    Figuur 3. Representatieve flowcytometrische analyse van PP lymfocyten. Monodisperse suspensies totale PP cellen geïncubeerd met fluorofoor-geconjugeerde primaire antilichamen en onderworpen aan flowcytometrie. (A) CD19 en B220 kenmerken van PP B-cellen. (BC) Dubbele labeling van de totale celpopulaties met CD3 en CD4 (B) of CD8 (C) specifieke T-cel subsets te sommen. (D) Dubbele labeling van de totale celpopulaties voor B220 (B-cel merker) en CD11c (DC marker). (E) Vergelijking B220, CD3 , CD4 en CD11c kleuring op PP cellen van BALB / c en C57B / 6 muizen.

    Figuur 4
    Figuur 4. Misleidende data flowcytometrie als gevolg van slechte PP celpreparaten. Good (linker panelen) en slechte (rechter panelen) PP celpreparaten werden gekleurd met (A) antilichamen tegen B220 en CD3 van B en T cel populaties of (B) antilichamen differentiëren om B220 en CD4 aan B-cellen te onderscheiden van een subset van T-cellen. Er over het algemeen weinig cellen cellen die positief kleuren voor B220 en CD3 of CD4, zoals in de linker panels. Daarentegen in slechte celpreparaten dubbele positieve cellen vormen bijna 20% van de totale cellen. Zie tekst voor meer informatie over wat een "slecht" celpreparaat.

    Figuur 5
    Figuur 5. Representatieve H & E-gekleurde secties PP. Paraffine ingebedde secties (A, B) of cryosecties (C) van ileal PPs werden gekleurd met H & E en gevisualiseerd door middel van lichtmicroscopie. Merk op dat de lichte en donkere zones van de lymfoïde follikels gemakkelijk afgebakend in de cryosecties ten opzichte van de paraffine secties. Afkortingen: V, villous, FAE, follikel-geassocieerde epitheel, SED, sub-epitheliale koepel; LF, lymfoïde follikel.

    Figuur 6
    Figuur 6. Immunofluorescente kenmerken van murine PP cryosecties. Vers gesneden weefselcoupes van een muis PP werden aan de lucht gedroogd, aceton gefixeerd en gekleurd met (A) FITC-geconjugeerd anti-CD3 antilichamen tegen de T-cellen label in de inter-folliculaire regio en lamina propria; (B) PE-geconjugeerd anti-CD11c antilichamen tegen DCs in de SED markeren, en (C) APC-geconjugeerd anti-B220 antilichamen tegen B-cellen te markeren (D) een samengestelde o.f beelden in panels AC opgewekt met Fiji software. Schaalstaaf is ~ 100 urn.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    In dit artikel, hebben we parallel protocollen voor de voorbereiding van PP enkele cel voorbereidingen voor flowcytometrische en functionele analyse en vriescoupes voor immunokleuring. Beide methoden zijn zeer reproduceerbaar en gemakkelijk toegankelijke, ontvangen een flowcytometer en cryostaat zijn. Voor de eerste keer onderzoekers moet worden opgemerkt dat in vergelijking met de milt, totale cel opbrengsten van PP's zijn relatief gering. Niettemin, het protocol schetsen we het algemeen rendementen tussen 0,8-1,2 x 10 6 totale PP cellen van een muis. Scale-up is mogelijk, hoewel we meestal niet zwembad meer dan 20-25 PP's, omdat in onze ervaring, aggregatie optreedt en cel opbrengsten (en levensvatbaarheid) daling aanzienlijk. Aan de andere kant, raden wij het gebruik van minder dan 15 PP's voor dit protocol, als een kritische massa nodig is om met succes de cellen te voeren door het gehele isolatie procedure. Als maximale levensvatbaarheid van de cellen is een prioriteit voor downstream-functioneleassays, adviseren wij een kleine steekproef van geïsoleerde cellen worden blootgesteld aan propidiumjodide kleuring toe te staan ​​voor een nauwkeurigere poorten van de levensvatbare pool van cellen van de totale PP celpopulatie. Tenslotte moet worden opgemerkt dat onze methode vatbaar is voor celsortering toepassingen als een specifieke cel subsets gewenst voor adoptieve overdracht of in vitro analyse, bijvoorbeeld.

    De collectie van PPs voor cryosectioning is relatief eenvoudig, hoewel de werkelijke snijden van PP weefsels kan een uitdaging zijn. Het is noodzakelijk, dat bijvoorbeeld PP weefsels juiste oriëntatie vormen (dus loodrecht op de bodem van de vorm) te waarborgen dat true dwarsdoorsneden verkregen. Wij stellen snap-freezing PP weefsels en daarna de cryosecties te precipiteren fixeermiddelen zoals aceton of methanol antilichaamreactiviteit ("antigeniciteit") behouden, terwijl neerslaan fixeermiddelen resulteren in een daling van de totale cellulaire en sub-cellulaire resolution. Als het behoud van antigeniciteit is niet een bepaalde zorg, dan adviseren wij het gebruik van cross-linking fixatieven zoals paraformaldehyde (PFA), die resulteren in een beter behoud van cellulaire en sub-cellulaire structuren. Inderdaad, PFA worden gebruikt om weefsel vast vóór cryosectioning. Eenvoudig onderdompelen gekloneerde PP overvloedig met 4% PFA gedurende> 2 uur, gewassen met PBS tissue om overtollige lijm te verwijderen weefsel in evenwicht sucrose (15%) desgewenst en in OCT insluiten, zoals hierboven beschreven. Het weefsel kan dan cryosectioned, maar moet worden geblokkeerd met glycine oplossing (0,1 M in PBS gedurende 15 min) om resterende reactieve PFA demping voor immunokleuring.

    Tenslotte, terwijl wij hebben beschreven protocollen voor immunofluorescentie etikettering van PP cryosecties, dezelfde onderdelen zijn vatbaar voor immunohistochemie (IHC) gebruikmaking van commercieel verkrijgbare kits IHC (bijv. Vector Labs, Burlingame, CA). Voor IHC, is het noodzakelijk om over een peroxidase blokkeren of QuEncHing stap in het protocol, als endogeen peroxidase veel voorkomen in het darmslijmvlies. Anderen hebben opgemerkt dat voor IHC, cardiale perfusie van de muizen met 4% paraformaldehyde in PBS weefsel behoud verbetert.

    Samengevat hebben we ontvangen geflankeerd protocollen voor kwantitatieve en functionele analyse van murine PP cellen, inclusief lymfocyten en DCs. De bereiding van eencellige suspensies maakt kwantitatieve en functionele in vitro analyse van de belangrijkste celtypen in het PP, terwijl immunokleuring van cryosecties verschaft informatie over de lokalisatie van specifieke celtypen, en cel-cel interacties die bestaan ​​in situ. De belangrijkste beperking van beide benaderingen is dat geen "real time" visualisatie van PP cel-cel interacties vertegenwoordigt. Op dit moment in ieder geval, hebben PPs bewezen ongevoelig voor intravitale imaging, een techniek die een revolutie in begrip van de lymfocyten Dynamics in perifere lymfeknopen. Tot de technische belemmeringen beperken intravitale beeldvorming van PP's worden overwonnen, de protocollen die in dit artikel voor het bereiden van PP enkele cel voorbereidingen voor flowcytometrische en functionele analyse en PP cryocoupes voor immunokleuring zal het belangrijkste middel van het onderzoeken en begrijpen van de immunologische functies van specifieke sub blijven -populaties van cellen in PP, de primaire inductieve plaatsen van darm-geassocieerd lymfeweefsel.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Geen belangenconflicten verklaard.

    Acknowledgements

    Wij danken Renjie Song (Wadsworth Center Flowcytometrie Core) voor hulp bij het cel-analyse en Helen Johnson (Wadsworth Center Animal histopathologie Core) voor de bereiding van paraffine secties. Wij danken dr. Richard A. Cole (Wadsworth Center Licht Microscopy Core) voor hulp bij confocale microscopie en fotocollectie. We willen graag Andy Bentley (Wadsworth Foto en Illustratie) erkennen voor hulp met animaties.

    MDJ wordt ondersteund door de Life Sciences Research Foundation, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Fellowship. SA wordt ondersteund door een Wadsworth Center-Health Research Inc intramurale postdoctoraal fellowship. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH subsidie ​​HD061916 en GM082978.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    OCT Compound Tissue-Tek 4583
    7x7x5 mm Base Molds Fisherbrand 22-363-552
    ImmEdge Pen Vector Labs H-4000
    Superfrost Plus Slides Thermo Scientific 4951
    Edge Rite Blade Thermo Scientific 4280L
    Anti-Mouse CD11c-PE eBioscience 17-0114-82
    Anti-Mouse CD45R/B220-APC BD Pharmigen 553092
    Anti-Mouse CD3-FITC BD Pharmigen 561798
    Anti-Mouse CD4-PE BD Pharmigen 553652
    Anti- Mouse CD8-PE BD Pharmigen 553032
    Anti-Mouse CD19-PercP BioLegend 115531
    Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red Fisher Scientific 14175-079
    70 μm cell strainer BD Falcon 352350
    Spleen Dissociation Medium Stem Cell Technologies 7915
    Goat serum Invitrogen 16210-072
    Fc Block ATCC 2.4.G2 HB-197 Supes obtained from cell line 2.4.G2
    Curved Scissor F.S.T 14061-09
    Cryostat Leica 3050S
    FACS Calibur BD
    Countess Cell Counter Invitrogen
    Hematoxylin Richard Allan 7211
    Eosin Richard Allan 71304
    Formalin Starplex Scientific 3661

    Table 1. Reagents and equipment used in this study.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. Secretory IgA's complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut. Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).
    2. Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue. Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).
    3. Rescigno, M., Sabatino, A. D. i Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease. J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).
    4. Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis. Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).
    5. Iwasaki, A., Kelsall, B. L. Localization of distinct Peyer's patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine. Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).
    6. Iwasaki, A. Mucosal dendritic cells. Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).
    7. Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. Peyer's Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores. Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).
    8. Lelouard, H., et al. Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer's patch dendritic cells that express lysozyme. Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).
    9. Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches. Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).
    10. Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses. J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).
    11. Kelsall, B. L., Strober, W. Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer's patch. J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).
    12. Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer's Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).
    13. Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).
    14. Lopez-Guerrero, D. V., et al. Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer's patches in adult mice. J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics