Investigação de polarização de macrófagos Usando medula macrófagos derivados

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Immunology and Infection

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Summary

O artigo descreve a adaptação prontamente fácil

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Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (76), e50323, doi:10.3791/50323 (2013).

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Abstract

O artigo descreve um prontamente adaptável fácil modelo in vitro para investigar a polarização de macrófagos. Na presença de GM-CSF/M-CSF, as células estaminais / progenitoras hematopoiéticas da medula óssea são dirigidos para diferenciação monocítica, seguido por estimulação M1 ou M2. O status de ativação pode ser rastreado por mudanças em antígenos de superfície celular, expressão gênica e de vias de sinalização celular.

Introduction

Distinta de respostas inflamatórias clássicos, macrófagos que infiltram os tecidos muitas vezes exibir o status de ativação polarizada que desempenha um papel crucial na regulação das funções fisiológicas do tecido hospedeiro 1-8. Após a estimulação, a ativação dos macrófagos podem ser classificados em clássico (M1) e alternativos (M2) a ativação 2, 4, 9. M1 activação macrófago depende receptores do tipo Toll (TLR) e a activação do factor nuclear kappa B (NFkB) / c-Jun N-terminal quinase 1 (JNK1), levando à produção de citoquinas inflamatórias, tais como TNF-e IL-α 1β e activação da iNOS, que resulta num aumento da produção de espécies de oxigénio reactivas, como o óxido de nitreto de (NO), 10, 11. Em contraste, os macrófagos M2 recrutas activação de PPARy, PPARô, ou IL-4-STAT6 caminhos, conduzindo a, anti-inflamatórios activação alternativa (M2), que está associado com a sobre-regulação do receptor de manose de CD206, e arginase 1 (Arg1) 6, 12 - 14 </ Sup>.

Macrófagos derivados de medula óssea (BMDM) apresentam um ideal modelo in vitro para entender os mecanismos que controlam a polarização de macrófagos ativados 15. Especificamente, a activação de macrófagos M1 pode ser induzida por lipopolissacáridos (LPS) de estimulação, enquanto M2 polarização de macrófagos pode ser induzida por IL-4 e / ou IL-13. Osso maduro macrófagos derivados da medula e macrófagos activados podem ser identificados através de análise de citometria de fluxo para a expressão de antigénios de superfície, incluindo CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 e CD86 9, 16, 17. Além disso, as alterações na produção de citoquinas e as vias de sinalização celulares associados com a polarização de macrófagos pode ser medida por RT-PCR quantitativo e Western blotting, respectivamente. Em resumo, rato macrófagos derivados de medula óssea pode servir como um modelo relevante para estudar a polarização de macrófagos in vitro.

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Protocol

1. Isolamento de Células de Medula Óssea

  1. Isolar fêmur e dos ossos da tíbia 6-8 semanas de idade, enxaguar o cabelo e, em seguida, cortado o osso.
  2. Use uma agulha de 21G e seringa de 10 ml para expulsar medula em frio PBS 2% inactivado pelo calor soro fetal bovino (FBS) (3-5 ml / mouse).
  3. Passa medula através de uma agulha 21G 4-6 vezes para dissociar as células.
  4. Passa células através de um coador de 70 mM para remover aglomerados de células, células ósseas, cabelo e outras células / tecidos.
  5. Adicionar 3 volumes de solução de NH4CI (solução de NH 4 Cl, Stemcell Tecnologia 0,8%), e incubar em gelo durante 10 min para remover os glóbulos vermelhos.
  6. Girar as células a 500 xg por 5 min a 4 ° C.
  7. Ressuspender o sedimento celular em PBS frio 2% de FBS (20-50 ml, dependendo da quantidade de células).

2. Indução Formação BMDM

  1. Ressuspender as células de medula óssea isoladas em meio de crescimento BMDM (2x10 6 células / ml).

BMDM meio de crescimento:

Meio de Dulbecco Modificado por Iscove (IMDM) + FBS a 10% + 15% de filtrado (0,2 um), L-929 de células (ATCC, CCL-1), sobrenadante de cultura (contendo monócitos factor estimulador de colónias, o M-CSF) ou 10 ng / ml M -CSF.

Nota: L-929 contém sobrenadante celular M-CSF 18. Para assegurar a actividade eficaz do meio condicionado, 5 x 10 5 células L-929 foram semeadas em 2 frascos T75 cm por 6-7 dias, o meio condicionado é recolhido e passado através de um filtro de 0,45 um antes da utilização. Aliquotas de meio pode ser utilizado imediatamente ou armazenado em -80 ° C durante 1-2 meses.

  1. Células de sementes em placas de 6 ou 12 poços (de cultura de tecidos, dependendo do desenho experimental) (Corning Costar).
  2. Alterar meio de crescimento BMDM fresco no dia 3.
  3. No dia 7, a formação de BMDM madura é avaliada utilizando análise de citometria de fluxoe anticorpos conjugados com fluoróforo para detectar células que expressam CD11b e F4/80.

3. BMDM Ativação Polarizada

  1. No dia 7, mudar para meio de estimulação fresco: para a activação M1, utilizar IMDM contendo FBS a 10% e 100 ng / ml de LPS ou 100 ng / ml de LPS de 50 ng / mL de IFN-y, para a activação M2, utilizar IMDM contendo 10% de FBS com 10 ng / ml de IL-4 e / ou 10 ng / ml de IL-13.
  2. Recolhe BMDMs estimuladas por separá-las a partir do prato quente usando tripsina a 0,05%, seguido por lavagem das células duas vezes com PBS contendo 10% de FBS.

Nota: Para separar e voltar a suspender os macrófagos maduros, após diferenciação, solução de tripsina a 0,05% (contendo EDTA 0,48 mM, Invitrogen) ou 2-5 mM em EDTA-Ca e Mg livre de PBS ou tampão de equilibrada de Hank (HBSS) pode ser usado. Quando utilizando o meio digestivo contendo tripsina, as células são tratadas a 37 ° C durante menos de 10 minutos para evitar a perda de surcara proteínas devido ao excesso de digestão.

  1. Utilização de anticorpos para detectar a expressão de antigénios de superfície celular, incluindo a de CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 ou CD86 em diferentes pontos de tempo, utilizando procedimentos de coloração de citometria de fluxo convencionais.
  2. Determinar a expressão dos genes característicos de macrófagos M1 e M2 activados incluindo IL-1β, TNF-α e IL-6 (activação M1) ou IL-10, IL-13, arginase1 e PPARy (activação M2) utilizando qRT-PCR. Determinar a activação de vias de sinalização celular envolvidas na ativação dos macrófagos M1 ou M2 por Western blotting.

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Representative Results

Uma descrição esquemática do procedimento BMDM geração é apresentada (Figura 1). Alta pureza dos macrófagos maduros podem ser observados no dia 7, quando eles representam 95 a 99% das células CD11b + F4/80 + (Figura 2). Macrófagos polarizados podem ser examinados usando anticorpos contra CD11b, F4/80, CD11c e CD206 seguido por análise de citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 3, os macrófagos M1 são detectados como F4/80 + CD11b + CD11c-CD206 células + (Q2), enquanto que M2 macrófagos F4/80 são CD11b + CD11c-CD206 + + (células T4). O estado de activação BMDM pode ser confirmado pelo aumento no tamanho celular (Figura 4A, deslocamento para a direita no FSC-A) e aumento da abundância de antigénios de superfície CD69, CD80 ou CD86 em macrófagos (Gate: F4/80 + CD11b +), conforme mostrado na figura 4B. A produção de citocinas, a expressão do gene e de activação da via de sinalização celular nos macrófagos M1 ou M2 pode ser avaliada usando RT-PCR quantitativo ou transferência de western. As mostrado na Figura 5, a arginase 1 (Arg1) e os níveis de PPARy foram aumentados em macrófagos M2 em 10 ng / ml de IL-4 da estimulação, ao passo que a produção de IL-1β e TNFa foram aumentados em macrófagos (M1), estimuladas com 100 ng / ml de LPS , que é acompanhado por activação p65 (Figura 6).

Figura 1
Figura 1. Esquema para o isolamento, a estimulação da formação e BMDMs rato. Passo a passo dos procedimentos estão descritos no texto. Em suma, fêmur e tíbia são coletadas 6-8 semanas camundongos e células da medula óssea lavada com PBS suplementado com 2% de calor FBS inativado. Após as células vermelhas do sangue são lisadas com uma solução de NH4Cl, as células são cultivadas em meio de crescimento BMDM durante 7 dias, seguido de maturação e de análise para a pureza da população celular. Para a análise dos macrófagos po larização, as células foram estimuladas com LPS ou LPS + IFN-y para M1, ou IL-4 e / ou IL-13 para a activação M2. Macrófagos polarizados pode ser avaliada com base nas alterações na morfologia celular, a superfície de apresentação do marcador, produção de citocinas e da via de sinalização de células activadas.

Figura 2
Figura 2. A análise de citometria de fluxo de formação BMDM. (A) foram primeiro BMDMs fechado em FSC e SSC para remover detritos e conjugados. (B) BMDMs maturos foram definidos como F4/80 + CD11b + subpopulações (à direita) com a pureza apresentado como percentagem do população pai fechado em FSC / SSC.

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Figura 3. . Análise da polarização de macrófagos de tecido macrófagos infiltrados são definidas como células CD11b + F4/80 +, macrófagos M1 são CD11b + F4/80 + CD11c células-CD206 +, enquanto os macrófagos M2 são + F4/80 CD11c-CD206 células CD11b + +.

Figura 4
Figura 4. A análise de activação de macrófagos por citometria de fluxo. (D) Após a activação, o tamanho dos macrófagos aumentar como evidenciado pela mudança do FSC-A de M1 ou M2 macrófagos às 24 horas após o estímulo em comparação com M0 (sem tratamento), os macrófagos. (B) A activação marcadores de superfície relacionadas foram analisadas por citometria de fluxo depois de IL4 ou de estimulação por LPS. Os primeiros marcadores CD69 respondendo foi avaliado em 5 ou 24 horas após a estimulação, CD80 e CD86 mercrs foram analisados ​​em 48 horas após a estimulação. Clique aqui para ver a figura maior .

Figura 5
Figura 5. Activação de macrófagos alternativa. Macrófagos estimulados com 10 ng / ml de IL-4 durante 24 horas foram recolhidas e o ARN total extraído. Arginase Cima 1 (Arg1) e PPARy expressão foi detectada em macrófagos M2, em comparação com os macrófagos não tratados utilizando análise RT-PCR quantitativa.

Figura 6
Figura 6. Clássica activação dos macrófagos. (A) RNA total foi extraído a partir de macrófagos estimulados com 100 ng / ml de LPS durante 24 h e utilizado nas análises RT-PCR quantitativa. A expressão de citoquinas pró-inflamatórias, incluindo a IL-1β e TNFa aumentados em macrófagos M1. (B), a activação da via de NFkB foi induzida por LPS, conforme determinado utilizando anticorpos para p65 e p65 fosforilada em análises de transferência Western.

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Discussion

Descrevemos aqui um processo simples e facilmente adaptável in vitro para induzir a activação dos macrófagos derivados de células progenitoras da medula óssea. Este procedimento pode ser utilizado para a investigação dos mecanismos responsáveis ​​pela polarização dos macrófagos. A pureza dos macrófagos maduros obtidos utilizando este protocolo médias de 95-99%, e não há procedimentos de purificação adicionais são necessários. Para investigar a função de genes específicos de interesse no contexto da polarização de macrófagos, a expressão ectópica ou knockdown gene específico pode ser realizada a seguir à transfecção das células no 7o dia. Este protocolo também irá proporcionar uma janela de cultura de 7 dias para investigar os efeitos de determinados genes ou os factores que afectam a formação, maturação e fenótipo de macrófagos.

Macrófagos ativados exibir perfis moleculares e celulares complicados com grande plasticidade em resposta a vários estímulos 3, 9, 19. Paraexemplo, M1 LPS provoca respostas pró-inflamatórias potentes que podem ser ainda mais melhorada na presença de IFN-y ou factor de necrose tumoral (TNF) e IL-4 e IL-13 estimular a activação tanto M2, no entanto, os perfis de activação não se sobrepõem completamente 3, 4, 9, 15, 19, 20. Os resultados apresentados neste protocolo só representam resultados típicos de experimentos com macrófagos derivados de medula óssea analisados ​​por citometria de fluxo, quantitativo RT-PCR e western blotting. Apresentação de antígenos de superfície e vias de sinalização celular associado com a ativação dos macrófagos variam conforme observado na extensa literatura sobre macrófagos polarização 1-8.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela American Heart Association (BGIA 7.850.037 para Beiyan Dr. Zhou).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IMDM Thermo Scientific SH30259.01
Fetal bovine serum Invitrogen 10438-026
Murine GM-CSF PeproTech 315-03
NH4Cl StemCell Technologies 7850
L-929 ATCC CCL-1
70 μm cell strainer BD Biosciences 352350
10 x PBS Thermo Scientific AP-9009-10
Anti-mouse CD11b-APC eBioscience 17-0112-81
Anti-mouse F4/80-FITC eBioscience 11-4801-81
Anti-mouse CD69-PE eBioscience 12-0691-81
Anti-mouse CD86-PE eBioscience 12-0862-81
Propidium Iodine Invitrogen P3566

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Comments

2 Comments

  1. When harvesting the macrophages how many do you usually obtain from 1 10 cm plate?
    As stated in the article I used prewarmed 0.05% trypsin and have obtained a maximum of 1.5 million cells per plate (for the M0 as well as the other differentiated subsets) with several cells still attached to the plate.

    Reply
    Posted by: Mia K.
    February 9, 2016 - 11:55 AM
  2. Hi, We usually can collect at least 4-5 million cells from 1 10cm dish using trypsin. To detach the cells, you can use EDTA solution on ice for 40 min, it should remove most of cells.

    Reply
    Posted by: Beiyan Z.
    February 9, 2016 - 12:37 PM

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