चूहा केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में Immunohistochemical विश्लेषण और परिधीय लिम्फ नोड ऊतक वर्गों

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Adzemovic, M. Z., Zeitelhofer, M., Leisser, M., Köck, U., Kury, A., Olsson, T. Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections. J. Vis. Exp. (117), e50425, doi:10.3791/50425 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Immunohistochemistry (आईएचसी) अत्यधिक, विशिष्ट विश्वसनीय और आकर्षक प्रोटीन दृश्य प्रदान करता है। सही प्रदर्शन और एक आईएचसी आधारित बहुरंगा लेबलिंग की व्याख्या चुनौतीपूर्ण है, खासकर जब इस तरह के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के रूप में एक उच्च वसा सामग्री के साथ ऊतक में लक्ष्य प्रोटीन के बीच interrelations का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है।

हमारी प्रोटोकॉल मानक immunolabeling तकनीक विशेष रूप से चूहे सीएनएस और परिधीय लिम्फ नोड्स (एल.एन.) neuroinflammation से प्रभावित दोनों में संरचनात्मक और घुलनशील प्रोटीन का पता लगाने के लिए समायोजित का शोधन का प्रतिनिधित्व करता है। बहरहाल, के साथ या बिना आगे संशोधनों, हमारे प्रोटोकॉल की संभावना अन्य संबंधित प्रोटीन लक्ष्य का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता अन्य अंगों और प्रजातियों यहाँ प्रस्तुत की तुलना में भी।

Introduction

उन्नत उच्च throughput के उपयोग methylome, transcriptome या यहां तक ​​कि proteome स्तर पर प्रदर्शन विश्लेषण के बावजूद, immunostaining ऊतक का नमूना, सेल संस्कृति में सीधे प्रोटीन का पता लगाने या एक सेल धब्बा के लिए स्वर्ण मानक बनी हुई है। स्थानीयकरण / वितरण पैटर्न का खुलासा करके, immunohistochemistry (आईएचसी) रिश्तेदार अनुपात और लक्ष्य प्रोटीन की स्थलाकृतिक interrelations का आकलन कर सकते हैं, और यहां तक ​​कि उनके जैविक गतिविधियों का संकेत मिलता है। इसलिए, आईएचसी व्यापक रूप से नैदानिक और अनुसंधान प्रयोजनों, जैसे, निदान के लिए, उपचार मूल्यांकन, रोग तंत्र, पशु मॉडल में कार्यात्मक और phenotypical परिवर्तन, आदि के अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है

अनिवार्य रूप से शामिल ऊतक विज्ञान, विकृति विज्ञान, जैव रसायन और इम्यूनोलॉजी, आईएचसी काफी 1941, जब fluorescently लेबल एंटीबॉडी पहली बार संक्रमित ऊतक 1 में न्यूमोकोकल एंटीजन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया के बाद से उन्नत है। वीसेलुलर उत्पादों और आईएचसी द्वारा घटकों के isualization उनकी विशिष्ट प्रतिजन (एजी) के लिए एंटीबॉडी (पेट) के बंधन पर आधारित है। Fluorophore टैग एंटीबॉडी का उपयोग कर इसके अलावा, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं भी peroxidase 2,3 या alkaline फॉस्फेट 4 की तरह एंजाइमों का उपयोग करके देखे जा सकते हैं। इसके अलावा, कोलाइडयन सोने टैग एंटीबॉडी 5, दोनों प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा विशिष्ट प्रतिजन प्रतिरक्षी बातचीत का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है, जबकि रेडियोधर्मी लेबलों autoradiography द्वारा कल्पना कर रहे हैं।

एजी-AB immunoreaction प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष तरीकों के माध्यम से पता लगाया जा सकता है। प्रत्यक्ष विधि अनिवार्य रूप से तेज और सरल है, क्योंकि यह सीधे प्राथमिक पेट 6 लेबल का उपयोग करता है। हालांकि, संवेदनशीलता के महत्वपूर्ण कमी के कारण, अप्रत्यक्ष तरीकों प्रत्यक्ष वालों को पसंद कर रहे हैं। दो कदम अप्रत्यक्ष पता लगाने प्रक्रियाओं प्राथमिक पेट लेबल नहीं किया गया आवश्यकता होती है, पहले के रूप में, और लेबल प्राथमिक पेट के खिलाफ निर्देशित माध्यमिक पेट, दूसरी परत के रूप में 7।संकेत प्रवर्धन आगे को शामिल करके हासिल किया जा सकता है, एंजाइम से मिलकर तृतीयक एबी (तीन कदम अप्रत्यक्ष विधि) माध्यमिक Ab को बांधता है। आमतौर पर इस्तेमाल अप्रत्यक्ष तरीकों का पता लगाने avidin बायोटिन और peroxidase-antiperoxidase (पीएपी) कर रहे हैं। वैकल्पिक रूप से, alkaline फॉस्फेट-antialkaline फॉस्फेट (APAAP) जटिल पीएपी विधि के बजाय प्रयोग किया जा सकता है। विशेष रूप से, alkaline फॉस्फेट (एपी) तरीकों immunoperoxidase तरीकों की तुलना में 4 और भी अधिक संवेदनशील होना दिखाई देते हैं। Avidin बायोटिन परिसर (एबीसी) विधि या तो साथ लेबल avidin बायोटिन परिसर (एलएबी) संयोजन में biotinylated माध्यमिक Ab उपयोग करता है, या streptavidin बायोटिन जटिल (स्लैब) लेबल। संवेदनशीलता का पता लगाने के लिए आगे peroxidase या alkaline फॉस्फेट 8 के साथ लेबल avidin को शामिल करके बढ़ाया जा सकता है। उपयोग में अन्य तरीकों का पता लगाने बहुलक लेबलिंग, tyramine प्रवर्धन और इम्युनो-रोलिंग चक्र 9 रहे हैं। विशेष रूप से, अलग अलग तरीकों का पता लगाने में एक ही ऊतक में कई एजी का पता लगाने के लिए जोड़ा जा सकता हैनमूना है, जो 1978 4। एक साथ डबल यहाँ प्रस्तुत immunostaining में पहली बार बताया गया peroxidase ही सीमित है और एपी संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी, क्रमशः का उपयोग कर formalin तय, आयल एम्बेडेड चूहे सीएनएस और एलएन ऊतक वर्गों में प्रदर्शन किया गया था। संकेतों को क्रमश 3,3'-diaminobencidine (थपका) वर्णकोत्पादक और फास्ट नीले रंग का उपयोग (एफबी) APAAP जटिल, कल्पना थे।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

एथिकल वक्तव्य
वर्तमान अध्ययन प्रयोगशाला पशु के लिए स्वीडिश नेशनल बोर्ड और यूरोपीय समुदाय परिषद निर्देशक से दिशा निर्देशों के अनुसार किया जाता है (86/609 / EEC) नैतिक परमिट के तहत N338 / 09, N15 / 10 और n65 / 10, द्वारा अनुमोदित किया गया है जिसमें उत्तर स्टॉकहोम पशु आचार समिति।

1. ऊतक तैयार

  1. छिड़काव व निर्धारण
    1. isoflurane साथ पशु anesthetize बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से transcardial छिड़काव करते हैं। फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ vasculature की rinsing आरंभ 0.1 एम पीबीएस (पीएफए) में रक्त घटकों, 4% paraformaldehyde के द्वारा पीछा हटा दें।
    2. पीएफए ​​में डुबो कर विच्छेदित दिमाग, रीढ़ की हड्डी डोरियों और परिधीय एल.एन. ऊतक fixate। 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के बाद, आगे की प्रक्रिया जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में पीएफए ​​से ऊतक और दुकान हस्तांतरण। वाणिज्यिक पीबीएस के लिए वैकल्पिक रूप से, 250 मिलीलीटर एस एंड में 9 ग्राम सोडियम क्लोराइड भंग# 246; rensen बफर और 750 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी जोड़ने (DH 2 हे); 2.5 एल DH 2 ओ में 0.2 एम Sörensen बफर (7.4 पीएच) को भंग 13.8 छ नः 4 एक्स 1H 2 हे और 71.2 छ ना 2 4 एक्स 2H 2 हे तैयार करने के लिए 2 पीओ HPO
  2. निर्जलीकरण और embedding
    1. एक रेजर ब्लेड का उपयोग करके लगभग 5 मिमी मोटी भागों में ऊतक में कटौती।
    2. ऊतक टेक वीआईपी वैक्यूम घुसपैठ प्रोसेसर (मानक इथेनॉल के आरोही सांद्रता में डुबकी के आधार पर प्रक्रिया, xylene और अंत में पैराफिन (तालिका 1) के बाद का उपयोग करके ऊतक सख्त प्रक्रिया (निर्जलीकरण) आरंभ करें।
    3. एक सांचे में ऊतक प्लेस और एक "आयल ब्लॉक" के लिए फार्म का नमूना आसपास तरल पैराफिन में डालना। लंबी अवधि के भंडारण कमरे के तापमान (आरटी) की आवश्यकता है। हालांकि, सेक्शनिंग करने से पहले, यह ब्लॉक शांत करने के लिए सिफ़ारिश (ओ / एन) 4 डिग्री सेल्सियस पर है, उदाहरण के लिए, रात भर।

2. सेक्शनिंग

  1. पैराफिन ब्लॉक स्लेज microtome की एक निश्चित धारक, जो पीछे और आगे चाकू भर में स्थानांतरित कर सकते हैं में रखें। ब्लॉक और microtome चाकू (चाकू कि ज्यामिति पर निर्भर करता है, लेकिन यह भी कटौती की गति और तकनीक पर) के बीच इष्टतम कोण समायोजित करें।
  2. पैराफिन ब्लॉक से 5 माइक्रोन मोटी पार वर्गों - 3 कट।
  3. एक पानी कंटेनर में बस कट खंड स्थानांतरण और गिलास स्लाइड पर पानी से इसे बाद में माउंट।
  4. अवशिष्ट पानी और संभावित हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए एक कागज तौलिया के खिलाफ मुहिम शुरू की सावधानी से खंड दबाएँ। व्यावसायिक रूप से पूर्व लेपित चिपकने वाला गिलास स्लाइड सिफ़ारिश कर रहे हैं।
  5. 60 डिग्री सेल्सियस - सूखी 50 पर एक स्टोव में कुछ घंटों के लिए स्लाइड मुहिम शुरू की।

3. Deparaffinization (पुनर्जलपूरण और अवरूध्द अंतर्जात Peroxidase)

  1. विसर्जित स्लाइड xylene में 2x (वैकल्पिक xylene स्थानापन्नXEM-200), प्रत्येक समय 15 - 20 '।
  2. 99% इथेनॉल में कुल्ला।
  3. अंतर्जात peroxidase गतिविधि को ब्लॉक करने के लिए, मेथनॉल 0.25% हाइड्रोजन पेरोक्साइड युक्त समाधान में 30 के लिए 'वर्गों सेते हैं।
  4. पानी की मात्रा (99%, 70% बढ़ रही है, आसुत जल में समाप्त होने के साथ इथेनॉल का उपयोग करके पुनर्जलीकरण जारी रखें।
  5. कवर के बढ़ते जब तक इस बिंदु से निकल जाता है वर्गों नम रखा जाना है।

4. प्रतिजन पुनर्प्राप्ति

  1. काम के तैयार करने के लिए, एक प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान में स्लाइड्स उबलते 60 के लिए '(इस मामले EDTA पीएच 8.5 बफर में) के लिए एक खाद्य स्टीमर का उपयोग करें (EDTA बफर स्टॉक समाधान 1.21 छ Tris और 0.37 ग्राम EDTA DH 2 हे 50 मिलीलीटर में भंग होता है 47.5 मिलीलीटर DH 2 हे) में समाधान पतला 2.5ml EDTA स्टॉक समाधान।
  2. लगभग लिए आरटी पर स्लाइड शांत हो जाओ। 1 घंटा और फिर कुल्ला 3 - 5x Tris साथ खारा (टीबीएस, वैकल्पिक रूप से पीबीएस का उपयोग करें) 0.05 एम Tris और 0.15 एम NaCl से मिलकर बफर; पीएच 7.5 से समायोजित वाईवें एचसीएल। वैकल्पिक रूप से वाणिज्यिक टीबीएस का उपयोग करें।

5. unspecific बंधन साइटों को अवरुद्ध

  1. unspecific पृष्ठभूमि प्रतिक्रियाओं से बचने के लिए अवरुद्ध समाधान 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) और 90% DAKO बफर युक्त '30 के लिए आरटी पर वर्गों सेते हैं।

6. डबल immunolabeling: प्राथमिक पेट के साथ एक साथ ऊष्मायन

  1. अवरुद्ध समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए आवश्यक राशि पतला और ओ / एन 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। α-Cd68 साथ (ED1; 1: 1,000): डबल immunostaining के लिए α-eotaxin (300 1 Ccl11) गठबंधन या α-Iba1 (Aif1, 1: 1,000) या α-Cd8α (बैल-8, 1: 200) ।
  2. स्लाइड टीबीएस बफर के साथ 3-5x रिंस (वैकल्पिक 10x पतला DAKO बफर का उपयोग करें)।
  3. अवरुद्ध समाधान में और आरटी पर 1 घंटा सेते: माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए आवश्यक राशि (200 biotinylated विरोधी बकरी और एपी संयुग्मित विरोधी माउस, दोनों 1) पतला।
  4. स्लाइड 3 कुल्ला - टीबीएस बफर के साथ 5x (अमेरिकाई वैकल्पिक 10x DAKO बफर पतला)।
  5. avidin-हॉर्सरैडिश peroxidase जटिल (एचआरपी) आरटी पर 1 घंटे के लिए अवरुद्ध समाधान में पतला के साथ स्लाइड्स सेते हैं।
  6. स्लाइड 3 कुल्ला - टीबीएस बफर (वैकल्पिक 10x पतला DAKO बफर का उपयोग) के साथ 5x।

7. दृश्य

  1. बाध्य एपी लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के दृश्य
    1. 1 एल DH 2 हे में 12.1 छ Tris भंग द्वारा 0.1 एम Tris एचसीएल बफर तैयार है और एचसीएल का उपयोग करके पीएच को समायोजित करें। 1 एम levamisole समाधान तैयार करने के लिए एक ही Tris एचसीएल बफर का प्रयोग करें। DH 2 ओ में हौसले से 4% नैनो 2 समाधान तैयार
    2. फास्ट ब्लू (एफबी) सब्सट्रेट (मात्रा एक मानक कांच क्युवेट के लिए आवश्यक) ग्लास ट्यूब में 312.5 μl DMF में भंग 6.25 मिलीग्राम Naphtol-AS-MX-फास्फेट और पूर्व गर्म के 50 मिलीलीटर में हलचल की 50 मिलीलीटर प्राप्त करने के लिए (37 डिग्री सेल्सियस) Tris एचसीएल बफर। 312.5 μl 2 एन एचसीएल में 12.5 मिलीग्राम अमेरिकन प्लान आरआर नमक को भंग करने के लिए पहले के 312.5 μl जोड़ने prepaलाल 4% नैनो 2 समाधान और पूर्व गर्म Tris एचसीएल बफर के ही 50 मिलीलीटर में मिश्रण हलचल। हल्के से हिला तक पीला तरल स्पष्ट हो जाता है और अंत में पहले से तैयार 1 एम Levamisole समाधान के 77 μl जोड़ें। छानना मिश्रण प्राप्त की और कांच क्युवेट में रखा स्लाइड पर डालना।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन आरंभ और लगभग प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत प्रक्रिया के विकास को नियंत्रित। हर 15 - 30 मिनट। अगर फजी मोड़, ताजा मिश्रण के साथ अमेरिकन प्लान समाधान की जगह।
    4. 5x पीबीएस बफर में टीबीएस बफर और हस्तांतरण बाद में साथ - स्लाइड 3 कुल्ला।
  2. बाध्य biotinylated माध्यमिक एंटीबॉडी के दृश्य
    1. थपका / एच 22 49 मिलीलीटर पीबीएस में 1 मिलीलीटर थपका शेयर समाधान (25 1 मिलीलीटर पीबीएस प्रति मिलीग्राम थपका) गिराए द्वारा समाधान विकसित करने को तैयार है। 16.5 μl एच 22 और छानना से पहले डालने का कार्य वर्गों पर जोड़ें।
    2. precipitating माथे में वर्णकोत्पादक थपका का रूपांतरणn वर्णक तत्काल हो सकता है। प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत विकासशील प्रक्रिया नियंत्रण (सेकंड अब ऊष्मायन के भी जोड़े को एक उच्च पृष्ठभूमि बढ़ाने के लिए और विशिष्ट संकेत मुखौटा हो सकता है)।
    3. भूरे रंग वेग की तीव्रता वैकल्पिक रूप से 5 के लिए '2% कॉपर सल्फेट और 0.9% सोडियम क्लोराइड से मिलकर समाधान में ऊष्मायन के द्वारा बढ़ाया जा सकता है।
    4. स्लाइड 3 कुल्ला - पीबीएस के साथ 5x और अंत में DH 2 हे के साथ, वैकल्पिक रूप से नल का पानी का उपयोग करें।
    5. स्लाइड माउंट के साथ कवर जलीय GelTol बढ़ते मध्यम का उपयोग करके पानी से सीधे निकल जाता है। हवा के बुलबुले बनाने से बचें।
    6. बढ़ते मध्यम की पूरी सुखाने, जैसे, ओ / n में 4 डिग्री सेल्सियस की अनुमति दें। स्टोर आरटी पर स्लाइड सूख गया।
1। % इथेनॉल 20 ' 40 डिग्री सेल्सियस
2। % इथेनॉल 60 और# 39; 40 डिग्री सेल्सियस
3। % इथेनॉल 90 ' 40 डिग्री सेल्सियस
4। % इथेनॉल 60 ' 40 डिग्री सेल्सियस
5। % इथेनॉल 90 ' 40 डिग्री सेल्सियस
6। % इथेनॉल 60 ' 40 डिग्री सेल्सियस
7। % इथेनॉल 90 ' 40 डिग्री सेल्सियस
8। % इथेनॉल 120 ' 40 डिग्री सेल्सियस
9। XYLOL 30 ' 40 डिग्री सेल्सियस
10। XYLOL 60 ' 40 डिग्री सेल्सियस
1 1। तेल 60 ' 60 डिग्री सेल्सियस
12। तेल 60 ' 60 डिग्री सेल्सियस
13। तेल 60 ' 60 डिग्री सेल्सियस
14। तेल 120 ' 60 डिग्री सेल्सियस

तालिका 1. ऊतक टेक वीआईपी वैक्यूम घुसपैठ प्रोसेसर से ऊतक प्रसंस्करण।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

डबल immunostainings (सह stainings) formalin तय, आयल एम्बेडेड चूहे सीएनएस और एलएन वर्गों में प्रदर्शन किया गया। 3-5 माइक्रोन मोटी स्लाइस ऊतक एक स्लेज microtome का उपयोग कर काट रहे थे, पूर्व लेपित चिपकने वाला कांच स्लाइड पर बाद में मुहिम शुरू की और जैसा कि पहले 10,11,12 वर्णित इलाज किया। संक्षेप में, deparaffinizing, ऊतक पुनर्जलीकरण और अंतर्जात peroxidase निष्क्रियता के बाद, वर्गों प्रतिजन पुनर्प्राप्ति प्रक्रिया के लिए, एक अवरुद्ध कदम unspecific बाध्यकारी साइटों को खत्म करने के द्वारा पीछा किए थे। सह-stainings निम्नलिखित संयोजनों में प्रदर्शन किया गया: i) Ccl11 / आईबीए-1, द्वितीय) Ccl11 / ED1 और iii) Ccl11 / सीडी 8। प्राथमिक प्रत्येक सह धुंधला के लिए इस्तेमाल पेट में दो अलग अलग प्रजातियों (बकरी और माउस, क्रमशः) है, जो उनके एक साथ ऊष्मायन सक्षम में उठाए गए थे। Ccl11, भूरे रंग के peroxidase प्रतिक्रिया उत्पाद से कल्पना की गई थी, जबकि मोबाइल -1, ED1 और सीडी 8, नीले एपी संकेत द्वारा कल्पना थे।

10 तरह मल्टिपल स्क्लेरोसिस (एमएस) में Ccl11 केमोकाइन की भूमिका के बारे में हमारे हाल के एक अध्ययन में एक व्यापक संदर्भ में वर्णित किया गया है। आईएचसी को चूहे सीएनएस में प्रदर्शन विश्लेषण अनुसार, Ccl11 pericarya, dendrites और रीढ़ की हड्डी में ग्रे मैटर (चित्रा 1 ए और बी) के उदर सींग में स्थित न्यूरॉन्स की एक्सोन में मौजूद था। इसके अलावा, एकल Ccl11 + प्लाज्मा कोशिकाओं को एक ही ऊतक वर्गों (चित्रा 1 ए) में detectable है, साथ ही थे एकल Ccl11 + / ED1 + मैक्रोफेज और मस्तिष्क निवासी microglia सूजन स्थल पर मनाया (नहीं दिखाया डेटा; ED1 लाइसोसोमल प्रोटीन का एक मार्कर है सक्रिय मैक्रोफेज और microglia 13) में। विशेष रूप से, Ccl11 केमोकाइन मोबाइल-1 + मैक्रोफेज और मस्तिष्क निवासी microglia (1 ए के साथ सह-स्थानीयकृत नहीं मिला था, मोबाइल -1 सीए 2 + आयनित -bindi पता लगाने के लिए एक मार्कर है एनजी प्रोटीन 14)।

आईएचसी आधारित प्रोटीन परिधीय चूहे एल.एन. ED1 (चित्रा 2 बी) के साथ प्रदर्शन किया Ccl11 प्रोटीन सह स्थानीयकरण में प्रदर्शन को निशाना। हालांकि, कोई Ccl11 स्रावित सीडी 8 + टी lymphocytes एक ही ऊतक वर्गों में पहचाने जाने थे (चित्रा 2A; सीडी 8 + कोशिकाओं विरोधी Cd8α, मुख्य रूप से साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं है कि MHC वर्ग के लिए बाध्य के लिए मार्कर मैं अणुओं 15 का उपयोग कर पाया गया)। दौरान ओ / एन अवरुद्ध समाधान में ऊष्मायन प्राथमिक पेट को छोड़ते हुए के अलावा, नियंत्रण वर्गों प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में इलाज किया गया। लक्ष्य प्रोटीन की कोई पता लगाने के संकेतों (आंकड़े 1 ए, बी और 2A में प्रस्तुत के रूप में, बी) सीएनएस और एलएन नियंत्रण वर्गों (चित्रा 1C और -2 सी, क्रमशः) में मनाया गया।

एस / ftp_upload / 50425 / 50425fig1.jpg "/>
चित्रा 1 ए, बी: चूहा एलएन में डबल Immunostaining। प्राथमिक या तो α-सीडी 8 (ए) या ED1 (बी) के साथ संयोजन में Ccl11 केमोकाइन के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी। । Ccl11 का पता लगाने के संकेत (ब्राउन) मैक्रोफेज में एक लाइसोसोमल प्रोटीन के लिए मार्कर (ED1, नीला) के साथ सह-स्थानीयकृत: एक ही कोशिका के भीतर नहीं सह स्थानीयकरण के लिए Ccl11 + (ब्राउन) और सीडी 8 + कोशिकाओं (ब्लू) बी मनाया गया। सी: नकारात्मक नियंत्रण; परिधीय एलएन में लेबल हटाया गया निवासी कोशिकाओं दिखा एक विस्तार। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 ए, बी: चूहा एस में डबल Immunostainingपीनल कॉर्ड। न्यूरोनल pericarya, dendrites और axons में Ccl11 प्रदर्शन ग्रे बात के उदर सींग (ब्राउन) के साथ सह दाग या तो मोबाइल-1 + (ए, नीले) या ED1 + (बी, नीला) मैक्रोफेज / microglia कोशिकाओं सी:। नकारात्मक नियंत्रण; रीढ़ की हड्डी ग्रे बात के उदर सींग में लेबल हटाया गया निवासी कोशिकाओं दिखा एक विस्तार। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

स्टैंडर्ड आईएचसी प्रक्रियाओं अक्सर एक इष्टतम परिणाम है, जो आमतौर पर व्यापक अनुभव है लेकिन यह भी "परीक्षण और त्रुटि" दृष्टिकोण का तात्पर्य प्राप्त करने के लिए विशिष्ट समायोजन की आवश्यकता है। ऊतक तैयारी से लक्ष्य तक दृश्य, प्रोटोकॉल में लगभग हर कदम को व्यक्तिगत रूप से अंतिम परिणाम में सुधार करने के लिए डिज़ाइन किया गया संशोधनों के अधीन किया जा सकता है। डबल धुंधला यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक मिसाल है आईएचसी आधारित प्रोटीन को निशाना विशेष रूप से formalin तय, आयल एम्बेडेड चूहे सीएनएस और एलएन ऊतक neuroinflammation से प्रभावित वर्गों में हमारी रुचि का लक्ष्य प्रोटीन के बीच interrelations का आकलन करने के लिए समायोजित। जैसे, यह आईएचसी की तकनीक सीखने के लिए एक ट्यूटोरियल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह भी अधिक उन्नत परीक्षण के लिए प्रेरणा का एक स्रोत के रूप में। हालांकि, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि अन्य प्रोटीन और / या यहाँ प्रस्तुत की तुलना में सबऑप्टिमल परिणाम उत्पन्न हो सकती है अन्य ऊतकों में लक्षित करने के लिए इस प्रोटोकॉल का एक मात्र प्रजनन।

बगल में संकरण का उपयोग कर बंद कर दिया न्यूक्लिक एसिड (LNA) riboprobe के खिलाफ Ccl11 congenic चूहा तनाव की 10 सीएनएस में संबंधित mRNA स्तर की upregulation प्रदर्शन किया। यह निष्कर्ष qPCR द्वारा पुष्टि की गई विश्लेषण करती है। इसके अलावा, qPCR congenic परिधीय एलएन में भी Ccl11 अपरेगुलेशन जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) तनाव के साथ तुलना में पता चला। अंत में, वेस्टर्न ब्लाट (पश्चिम बंगाल) रोग की रक्षा की congenic चूहा तनाव 10 के दोनों लक्ष्य ऊतकों में Ccl11 प्रोटीन की महत्वपूर्ण अपरेगुलेशन दिखाया। इसलिए, हम लक्ष्य ऊतकों में सीधे इस केमोकाइन की उत्पत्ति की जांच करने के उद्देश्य से, और उस उद्देश्य के लिए हम यहाँ वर्णित डबल धुंधला प्रोटोकॉल विकसित की है।

पोस्टमार्टम विच्छेदन और बाद के निर्धारण विकैल्सीकरण दौरान ऊतक के यांत्रिक हानिकारक से बचने के अलावा, ऊतक सेक्शनिंग काफी चुनौतीपूर्ण प्रकट हो सकता है। सेक्शनिंग आमतौर पर कौशल और अभ्यास की आवश्यकता है। टुकड़ा की गुणवत्ता कई पहलुओं रों पर निर्भर हैuch आदेश काटने के दौरान दबाव नमूना पर लागू कम करने के लिए ऊतक ब्लॉक और चाकू के बीच एक सही कोण समायोजन के रूप में, काटने की गति, आदि आयल एम्बेडेड ऊतक स्लेज microtome द्वारा उत्पादित स्लाइस की मोटाई 2 से 50 माइक्रोन के लिए भिन्न हो सकते हैं। कट पैराफिन ऊतक स्लाइस गिलास स्लाइड अधिमानतः व्यावसायिक रूप से इस तरह के पाली एल लाइसिन या aminopropyltriethoxysilane (APTS) के रूप में एक चिपकने के साथ लेपित पर एक गर्म पानी से स्नान से बढ़ रहे हैं की मांग धुंधला प्रक्रिया के दौरान एक बेहतर पकड़ सुनिश्चित करने के लिए। इसके विपरीत ऊतक वर्गों, जिस पर लगभग cryomicrotome का उपयोग कर काट रहे हैं -20 डिग्री सेल्सियस और आरटी पर सूखे धुंधला करने से पहले क्रायो करने के लिए, ठंडा पैराफिन ब्लॉकों आरटी पर कटा कर रहे हैं, और बाद में deparaffinization करने से पहले 50 से 60 डिग्री सेल्सियस पर सूख गया।

अति संरक्षित ऊतक वास्तुकला, सेल आकृति विज्ञान और लक्ष्य epitopes स्थानीयकरण और लक्ष्य प्रोटीन के आपसी संबंध का आकलन करने के लिए आवश्यक हैं। आदेश में इष्टतम ऊतक preser प्राप्त करने के लिएछुपा, नमूने ठीक से तय होने के लिए या तो coagulating या पार से जोड़ने fixatives का उपयोग किया है। इथेनॉल जैसे coagulating fixatives, अधिक बार cryopreservation के लिए उपयोग किया जाता है। प्रोटीन इथेनॉल का उपयोग विकृतीकरण ऊतक निर्जलीकरण 9 के माध्यम से हासिल की है, अपर्याप्त सेलुलर संरक्षण 16 में परिणाम सकता है। Coagulating fixatives के विपरीत, formaldehyde के एक पार से जोड़ने लगानेवाला जो सबसे अक्सर दिनचर्या ऊतक विज्ञान और आईएचसी 9 में इस्तेमाल किया जाता है दोनों cryo- और आयल ऊतक संरक्षण के लिए। हम विकैल्सीकरण और बाद आयल एम्बेडिंग करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए formaldehyde के समाधान में डुबो कर चूहे सीएनएस और एलएन के लिए एक इष्टतम निर्धारण हासिल किया है। बड़े अणुओं की रचना में गहरा परिवर्तन होने के बावजूद, इस अर्द्ध प्रतिवर्ती, सहसंयोजक अभिकर्मक उच्च योग्यता को सीधे प्रदान करता है (formaldehyde अर्थात् methylene पुलों कि प्रोटीन crosslink और इस तरह एंटीजन, जो एंटीबॉडी के विशिष्ट बंधन रोक सकता मुखौटा रूपों)अल्पसंख्यक ऊतक संरक्षण। विशेष रूप से, तापमान और निर्धारण की अवधि पार से जोड़ने अभिकर्मकों के साथ इस तरह, सेक्शनिंग मिलान का पता लगाने के लिए और भी पार जेट के रूप में आईएचसी के कई पहलुओं को प्रभावित कर सकता है। इस प्रकार दोनों के तहत निर्धारण और ओवर-निर्धारण formaldehyde जैसे एल्डिहाइड आधारित अभिकर्मकों का उपयोग कलाकृतियों कि मुख्य रूप से autolysis या अत्यधिक पार से लिंक करने के लिए 17 कारण हैं, क्रमशः कारण बन सकता है। फिर भी, एक unspecific पृष्ठभूमि धुंधला कारण हाइड्रोफोबिक प्रोटीन को overfixation द्वारा मनाया बंधन कम नमकीन nonionic डिटर्जेंट युक्त buffers का उपयोग कम किया जा सकता है, या जब पॉलीक्लोनल पेट 18 का उपयोग कर कमजोर पड़ने बफर का पीएच को ऊपर उठाने के द्वारा। हालांकि, एक unspecific पृष्ठभूमि धुंधला (शोर) आयनिक और इलेक्ट्रोस्टैटिक प्रोटीन बातचीत की वजह से उच्च ईओण ताकत है, जो एक ही समय में हाइड्रोफोबिक प्रोटीन बाध्यकारी 18 की वजह से शोर बढ़ सकती है साथ मंदक buffers का उपयोग कम किया जा सकता है। यह लक्ष्य epitopes का पता लगाने के लिए आता है, formaldehyde-मैंप्रोटीन की तृतीयक संरचना के nduced परिवर्तन, हो सकता है, हालांकि पूरी तरह से नहीं, प्रतिजन पुनर्प्राप्ति 19 से उलट: i) हीटिंग द्वारा विभिन्न पीएच मान (गर्मी प्रेरित मिलान पुनर्प्राप्ति (Hier) के साथ बफ़र्स में, द्वितीय) enzymatic गिरावट से (प्रोटीज प्रेरित मिलान पुनर्प्राप्ति (घाट; 20)), iii) मजबूत क्षारीय या एसिड समाधान है, या सुक्रोज 21 में ऊष्मायन, 22 से या IIII) केंद्रित फार्मिक एसिड 23 के साथ इलाज से। Hier सुविधाजनक प्रतीत होता है लक्ष्य के बहुमत के लिए 19 epitopes। हीटिंग अवधि इसके अलावा, इस तरह के EDTA (पीएच 5.5, 8.5 या 9.0) या सोडियम साइट्रेट बफर (पीएच 6.0- 6.2) के रूप में समाधान का पीएच मान Hier के परिणाम के लिए आवश्यक हो सकता है। विशेष रूप से, हमारे अध्ययन में सबसे अधिक संतोषजनक परिणाम पीएच मान 8.5 के साथ EDTA समाधान में 1 के लिए नमूने गुस्से से हासिल की थी।

हालांकि एंटीबॉडी रियायत के तौर पर उनकी विशिष्ट epitopes, अविशिष्ट के लिए आकर्षण करने के लिए बाध्य, आत्मीय एजी के लिए समान रूप से बाध्यकारीसाइटों, पूरी तरह से बाहर नहीं किया जा सकता है। विशेष रूप से, पृष्ठभूमि धुंधला को कम करने के लिए शायद सबसे कारगर तरीका (हमारे अध्ययन में इस्तेमाल जैसे एफसीएस) प्रोटीन प्राथमिक पेट 9 का आवेदन करने से पहले रोकने में ऊष्मायन है। मोनोक्लोनल प्राथमिक पेट किसी भी तरह उच्च विशिष्टता और इस तरह कम हो unspecific पृष्ठभूमि संकेत के कारण पॉलीक्लोनल पेट से अधिक पसंद कर रहे हैं। फिर भी, पार जेट अभी भी प्रकट हो सकता है के रूप में मोनोक्लोनल पेट आमतौर पर अमीनो एसिड की एक छोटी संख्या है, जो कुछ अन्य (unspecific) प्रोटीन 24 का एक हिस्सा हो सकता है से मिलकर epitopes के खिलाफ निर्देशित कर रहे हैं। मोनोक्लोनल के विपरीत, पॉलीक्लोनल पेट लक्ष्य प्रोटीन के कई isoforms पहचानने का एक उच्च मौका है। मैं) एक पॉलीक्लोनल बकरी में उठाया और ii) एक मोनोक्लोनल माउस में उठाया: हम शुरू में Ccl11 पता लगाने के लिए दो अलग-अलग प्राथमिक पेट इस्तेमाल किया। हमारे हाथ में, दोनों उत्पादों लक्ष्य केमोकाइन के लिए एक ही धुंधला पैटर्न का प्रदर्शन किया। आदेश में एक साथ सह-धुंधला करने के लिए, हम बकरी-विरोधी चूहा Ccl1 इस्तेमाल कियामोबाइल -1, ED1 और सीडी 8, क्रमशः के खिलाफ एंटीबॉडी, जो सभी माउस में तैयार किए गए के साथ संयोजन में 1 Ab। फिर भी, इसके अलावा एक साथ, डबल immunostaining भी क्रमिक रूप से 25 के रूप में एक ही प्रजाति में उत्पादन प्राथमिक पेट के सह-लेबलिंग के लिए आवश्यक किया जा सकता है।

हमारे अध्ययन में इस्तेमाल पेट के इष्टतम काम एकाग्रता विशिष्ट संकेत की तीव्रता और पृष्ठभूमि शोर के बीच एक इष्टतम अनुपात के रूप में परीक्षण कमजोर पड़ने श्रृंखला के माध्यम से अनुमान लगाया गया था। हालांकि, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए ही एंटीबॉडी के एक इष्टतम काम एकाग्रता कभी कभी अंगों, प्रजाति, पृष्ठभूमि विकृति, आदि विशेष रूप से, permeabilization एम्बेडेड पैराफिन में प्रदर्शन हमारे धुंधला प्रक्रिया में आवश्यक नहीं था के बीच भिन्न हो सकते हैं कि, 3-5 माइक्रोन मोटी ऊतक वर्गों, तथापि, ट्राइटन X-100 की तरह डिटर्जेंट अभी भी सतह तनाव कम करने के लिए इस प्रकार प्रतिजन और एंटीबॉडी के बीच बाध्यकारी की सुविधा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। परइसके विपरीत, अब प्रवेश की मध्यस्थता permeabilization- सुधार सामान्यतः संवर्धित कोशिकाओं या सेल निलंबन (immunocytochemistry (आईसीसी)) में प्रोटीन का पता लगाने के लिए आवश्यक है, immunofluorescence के लिए (यदि) क्रायो वर्गों और में आईएचसी / अगर ताजा (मोटी, vibratome कटौती) में फ्री- चल ऊतक स्लाइस।

कई नियंत्रण विशिष्ट / विश्वसनीय immunotargeting पैदा करने के लिए अनिवार्य रूप से महत्वपूर्ण हैं। एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, हम अस्थमा के एक चूहे मॉडल है, जहां हम Ccl11 + eosinophils पता लगा सकता है फेफड़ों से इस्तेमाल किया। नकारात्मक नियंत्रण प्राथमिक पेट के अभाव में 4 डिग्री सेल्सियस पर केवल अवरुद्ध समाधान ओ में incubated / n थे।

हम पहले से ही एक पृष्ठभूमि संकेत की कमी के लिए कुछ कारणों और संभावित उपचार का उल्लेख किया है। एक unspecific immunostaining उत्पाद भी माइलॉयड कोशिकाओं 26 की लाल रक्त कोशिकाओं के थपका के बीच प्रतिक्रिया और pseudoperoxidase और peroxidase के रूप में हो सकता है। , बस शोर caus के रूप में इन एंजाइमों की गतिविधिअंतर्जात बायोटिन द्वारा एड या एपी पहले से ही formalin-निर्धारण के दौरान कम हो गया है। हालांकि, मेथनॉल / एच 22 के साथ pretreatment उनके आगे या पूर्ण निष्क्रियता 27, 28। पृष्ठभूमि स्तनधारी ऊतकों में एपी गतिविधि की वजह से धुंधला आगे levamisole 29 से हिचकते जा सकता है, या एसिटिक एसिड 29 के लिए आवश्यक है। Avidin और oppositely आरोप लगाया सेलुलर अणुओं 30 के बीच आयनिक आकर्षण के परिणाम के रूप unspecific बाध्यकारी streptavidin के साथ अंडे का सफेद से avidin प्रतिस्थापन से Streptomyces avidinii 31 से बचा जा सकता है।

थपका शायद आईएचसी में सबसे अक्सर इस्तेमाल किया वर्णकोत्पादक है। थपका (भूरे रंग प्रतिक्रिया उत्पाद) इसके अलावा, उपयोग में अन्य peroxidase chromogens 3-अमीनो-9-ethylcarbazole (एईसी, लाल) कर रहे हैं, 4-Chlor-1-naphthol (सीएन, नीला) और tetramethylbenzidine (TMB, नीला)। आमतौर पर चुना एपी chromogens अमेरिकन प्लान, फास्ट लाल (एफआर), नई fuchsin कर रहे हैं और 5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3-indolylphosphate / नाइट्रो बीएलUE tetrazolium क्लोराइड (BCIP / एनबीटी)। एंजाइमों और chromogens के चुनाव मूल रूप से व्यक्तिगत पसंद की बात यह इस तरह के स्थानीयकरण, अभिव्यक्ति पैटर्न के रूप में लक्ष्य सुविधाओं से चलाया जा सकता है, लेकिन यह भी अंतर्जात पिगमेंट (मेलेनिन, hemosiderin), 32 की मौजूदगी से है, लेकिन। Counterstain आईएचसी प्रक्रिया में पिछले है, ऐच्छिक कदम आमतौर पर hematoxylin, परमाणु तेजी से लाल या हरी मिथाइल 18 का उपयोग किया जाता है। आम तौर पर एक लेबलिंग के लिए अधिक उपयुक्त है, counterstain ऊतक आकृति विज्ञान की व्याख्या की सुविधा है और यह आसानी से वर्णकोत्पादक वेग के साथ किसी भी हस्तक्षेप से बचने के लिए विकसित किया जाना चाहिए।

धुंधला प्रक्रिया ऊतक वर्गों के पूरा होने पर ध्यान से एक coverslip एक बढ़ते माध्यम का उपयोग कर के साथ मुहिम शुरू की जानी चाहिए। हवा के बुलबुले के गठन से परहेज किया जाना चाहिए। भौतिक सुरक्षा के अलावा, बढ़ते मध्यम दृश्य और इमेजिंग की गुणवत्ता में सुधार। या तो जैविक / हाइड्रोफोबिक या जलीय / हाइड्रोफिलिक, चौधरीबढ़ते मध्यम के OICE कार्बनिक विलायक में अंत उत्पाद की घुलनशीलता पर निर्भर करता है। एक toluene- आधारित बढ़ते मध्यम उपयुक्त है, जैसे, थपका के लिए होगा, जलीय बढ़ते मध्यम प्रतिदीप्ति लेबलिंग सहित सभी एंजाइमी chromogens के लिए लागू किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O) Baxter 1001936060 Eye irradiation. Probably influences fertility and damages baby in uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing environment.
Sodiumchloride (NaCl) Merck 1.0604
Phosphate Buffer Saline (PBS), tablet Sigma-Aldrich P4417
Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% in 1x PBS Apl pharma 34 24 28 Health hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity.
Ethanol ≥99.5%, absolute (CH3CH2OH) Sigma-Aldrich 459844-1L Flamable.
Xylene (Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 Sigma-Aldrich 534056 Flamable. Acute toxicity.
Histo-Comp Paraffin Wax Tissue-Tek V0-5-1001
Adhesive Microscope Slides Starfrost MIC-1040-W
Xylol substitute XEM-200 Vogel GmbH ND-HS-200 Respiratory sensitization. Carcinogenicity.
α-CD8 (Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody AbD Serotec MCA48G
α-Iba1 (AIF1) mouse anti-rat, primary antibody Millipore MABN92
α-CD68 (ED1) mouse anti-rat, primary antibody AbD Serotec MCA341R
α-eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody Santa Cruz BT SC-6181
Alkaline phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody Dakopatts, Denmark D0314
Biotinylated secondary antibody Amersham Biotech RPN1025
Avidin- horseradish peroxidase complex (HRP) Sigma-Aldrich A3151
Naphthol AS-MX phosphate (C19H18NO5P) Sigma-Aldrich N4875-1G Acute toxicity.
Fast Blue RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) Sigma-Aldrich FBS25
Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S) Sigma-Aldrich 31742 Acute toxicity.
3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen) DAKO S3000 Highly flammable. Toxic.
Copper sulphate (CuSO4) Merck 1.02791 Acute toxicity. Environmental hazzard.
GelTol Aqueous Mounting Medium Thermo Electron Corporation 230100
Hydrogen peroxide, 30% (H2O2) Merck 107210 Acute toxicity.
Methanol (CH3OH) Fluka 65543 Acute toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable.
Tris (hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 ) AppliChem A1379 Skin and eye irritation.
Tris Buffered Saline (TBS), tablet Sigma-Aldrich T5030
Di- Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 x 2H2O) Merck 1.0658
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 x 1H2O) Merck 1.06346
Fetal calf serum (FCS) Cambrex BioScience DE-14-802F
DAKO cytomation wash buffer 10x DAKO S3006 Should be stored at 2-8 °C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming.
N,N-Dimethylformamide; DMF (C3H7NO) Fluka 40250 Flammable. Acute toxicity.
Glas coverslips 24 x 36 mm Menzel-Gläser BB024036A1
Hydrochloric acid, conc. (HCl) Sigma-Aldrich 30721 Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic.
Hydrochloric acid solution volumetric, 2 M HCl (2 N) Fluka 71826 Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic.
Sodium nitrite, ReagentPlus, ≥99.0% (NaNO2) Sigma-Aldrich S2252 Oxidant. Toxic. Dangerous for the environment.
Ethylenedinitrilotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) Merck 1.08454 Oral exposures may cause reproductive and developmental effects.
Equipment
Tissue-TekV.I.P Vacuum Infiltration Processor Sakura 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz
Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome Hacker instruments
Household food steamer Braun MultiGourmet FS 20
Light microscope Leica Polyvar 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
  2. Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
  3. Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545 (1966).
  4. Mason, D. Y., Sammons, R. Rapid preparation of peroxidase: anti-peroxidase complexes for immunocytochemical use. Journal of immunological. 20, 317-324 (1978).
  5. Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  6. Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of experimental medicine. 91, 1-13 (1950).
  7. Polak, J. M., Van Noorden, S. Introduction to immunocytochemistry. Bios Scientific Publishers Ltd. Oxford, UK. (2003).
  8. Elias, J. M., Margiotta, M., Gaborc, D. Sensitivity and detection efficiency of the peroxidase antiperoxidase (PAP), avidin-biotin peroxidase complex (ABC), and peroxidase-labeled avidin-biotin (LAB) methods. American journal of clinical pathology. 92, 62-67 (1989).
  9. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Vet Pathol. 42, 405-426 (2005).
  10. Adzemovic, M. Z., et al. Expression of Ccl11 associates with immune response modulation and protection against neuroinflammation in rats. PloS one. 7, 39794 (2012).
  11. Bauer, J., et al. Endoplasmic reticulum stress in PLP-overexpressing transgenic rats: gray matter oligodendrocytes are more vulnerable than white matter oligodendrocytes. Journal of neuropathology and experimental neurology. 61, 12-22 (2002).
  12. Bradl, M., Bauer, J., Flugel, A., Wekerle, H., Lassmann, H. Complementary contribution of CD4 and CD8 T lymphocytes to T-cell infiltration of the intact and the degenerative spinal cord. The American journal of pathology. 166, 1441-1450 (2005).
  13. Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Experimental eye research. 81, 700-709 (2005).
  14. Hirasawa, T., et al. Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice. Journal of neuroscience research. 81, 357-362 (2005).
  15. Norment, A. M., Salter, R. D., Parham, P., Engelhard, V. H., Littman, D. R. Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules. Nature. 336, 79-81 (1988).
  16. Hoetelmans, R. W., van Slooten, H. J., Keijzer, R., Jvan de Velde, C. J., van Dierendonck, J. H. Routine formaldehyde fixation irreversibly reduces immunoreactivity of Bcl-2 in the nuclear compartment of breast cancer cells, but not in the cytoplasm. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 74-80 (2001).
  17. Hayat, M. Microscopy, Immunohistochemistry and antigen retrieval methods for light and electron microscopy. Kluwer Academic. New York. (2002).
  18. Boenisch, T. Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 176-179 (2001).
  19. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 741-748 (1991).
  20. Huang, S. N. Immunohistochemical demonstration of hepatitis B core and surface antigens in paraffin sections. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 33, 88-95 (1975).
  21. Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 45, 327-343 (1997).
  22. Taylor, C. R., Shi, S. R. Antigen retrieval: call for a return to first principles. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 8, 173-174 (2000).
  23. Kitamoto, T., Ogomori, K., Tateishi, J., Prusiner, S. B. Formic acid pretreatment enhances immunostaining of cerebral and systemic amyloids. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 57, 230-236 (1987).
  24. Nelson, P. N., et al. Monoclonal antibodies. Molecular pathology : MP. 53, 111-117 (2000).
  25. Van der Loos, C. Immunoenzyme multiple staining methods. Bios Scientifc publishers Ltd. New York. (1999).
  26. Elias, J. Immunohistopathology. A practical approach to diagnosis. ASCP Press. Chicago. (2003).
  27. Straus, W. Letter: Cleavage of heme from horseradish peroxidase by methanol with inhibition of enzymic activity. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 908-911 (1974).
  28. Streefkerk, J. G. Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 20, 829-831 (1972).
  29. Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).
  30. Petrelli, F., Coderoni, S., Moretti, P., Paparelli, M. Effect of biotin on phosphorylation, acetylation, methylation of rat liver histones. Molecular biology reports. 4, 87-92 (1978).
  31. Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells. The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).
  32. Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics