القبض في وقت واحد في الوقت الحقيقي الصور في قناتين الانبعاثات باستخدام نظام تقسيم كاميرا مزدوجة الانبعاثات: تطبيقات لخلية التصاق

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

نظم تقسيم الانبعاثات كاميرا مزدوجة للاللونين مضان المجهري توليد تسلسلات الصور في الوقت الحقيقي مع دقة بصرية والزماني استثنائية، وهو شرط لبعض المقايسات الخلية الحية بما في ذلك بالتوازي المقايسات غرفة تدفق وحة التصاق. عندما يعمل البرنامج لدمج الصور من القنوات الانبعاثات المكتسبة في وقت واحد، ويتم إنتاج تسلسلات الصور pseudocolored.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Carlson, G. E., Martin, E. W., Burdick, M. M. Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion. J. Vis. Exp. (79), e50604, doi:10.3791/50604 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

متعددة الألوان المناعي المجهري للكشف عن جزيئات معينة في غشاء الخلية يمكن أن يقترن مع المقايسات غرفة تدفق موازية لوحة للتحقيق في الآليات التي تحكم التصاق الخلية في ظل ظروف تدفق الحيوية. على سبيل المثال، وسرطان الخلايا المسمى مع fluorophores متعددة يمكن perfused على ركيزة يحتمل رد الفعل لنمذجة آليات الانبثاث السرطان. ومع ذلك، متعدد القنوات أنظمة كاميرا واحدة ولون الكاميرات أوجه القصور المعرض في الحصول على الصور في الوقت الحقيقي للتحليل الخلية الحية. للتغلب على هذه القيود، استخدمنا كاميرا الانبعاثات نظام تقسيم مزدوجة في وقت واحد لالتقاط تسلسل الصور في الوقت الحقيقي من الخلايا fluorescently المسمى في غرفة التدفق. ويتراوح الطول الموجي مرشح أنظمة تقسيم الانبعاثات كاميرا مزدوجة محددة في اثنين من الكاميرات أحادية اللون اتفاقية مكافحة التصحر، وبالتالي التقاط صور متطابقة في وقت واحد اثنين مكانيا ولكن fluorophore محددة. بعد ذلك، يتم الجمع بين psuedocolored الصور قناة واحدة الى واحدفي الوقت الحقيقي اندمجت تسلسل التي يمكن أن تكشف عن العديد من الجزيئات المستهدفة على خلايا تتحرك بسرعة عبر منطقة الفائدة.

Introduction

طرق لتحليل جزيئات على سطح الخلية، مثل المناعية، وتوظيف تحقيقات التي مترافق كيميائيا لfluorophores، مما يسمح للكشف عن الجزيئات المستهدفة. وعادة ما يتم تسجيل التصوير الخلية الحية والهيدروديناميكية فحوصات التصاق الخلية المستندة إلى تدفق مع الكاميرات أحادية اللون CCD صمم للقبض على العمليات الفسيولوجية على المستوى الخلوي و / أو الجزيئية 1، 2. هذه الكاميرات هي حساسة للغاية، وتقديم معدلات الإطار بسرعة (أكبر من 30 لقطة في الثانية الواحدة)، وتقديم القرار الزماني استثنائية (بسبب معدلات الإطار بسرعة ومرات التعرض القصير). ومع ذلك، يمكن للكاميرات التقاط أحادية اللون فقط قناة واحدة الانبعاثات (الكشف عن fluorophore واحد) لجمع الصور. ويمكن إدراج نظم تقسيم الانبعاثات كاميرا واحدة لالتقاط القنوات الانبعاثات متعددة ولكن غالبا ما يقلل من مجال الرؤية وتتطلب الوقت نفسه التعرض لتصوير جميع القنوات. لالتقاط ألوان الطيف الكامل من الخلايا المسمى مع multipلو fluorophores، وكاميرا اللون يمكن استخدامها كبديل. ومع ذلك، والكاميرات اللون ليست قادرة عموما على تقديم القرار الزماني المطلوب لتصوير الخلايا الحية في بعض التطبيقات. هناك حاجة إلى جهاز التصوير أخرى للتطبيقات الذي هو مفيد لصورة الخلايا الحية في موجات متعددة مع الحفاظ على القرار الزماني عالية. تطبيق تجريبي رئيس هو مواز لوحة غرفة تدفق التصاق الفحص، التي و perfused الخلايا في الظروف ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية على ركيزة يحتمل رد الفعل 1، 3. الخلايا في تدفق التي تعبر عن جزيئات محددة سطح الخلية قد تلتزم ولفة على الركيزة، مثل أحادي الطبقة الخلية التعبير عن جزيئات الالتصاق أو البروتينات المصفوفة خارج الخلية، كثف السطح 4، 5. الخلايا المتداول قد تخضع حركة دورانية ومتعدية في أجزاء من الثانية. الميزات الجزيئية على المتداول والخلايا الملتصقة، مثل مجموعات من جزيئات سطح الخلية، وأيضا potentiالقاعدة لإعادة تنظيم الخضوع نشطة على سطح الخلية. وبالتالي، يجب نظم التصوير يوفر القرار الزماني استثنائية (30 لقطة في الثانية أو أكثر و"قريبة من الصفر" مرات التعرض) لإنشاء تسلسل الصور التي توضح تطور خطوة بخطوة من الخلايا المتداول 6، 7. نظم تقسيم الانبعاثات كاميرا مزدوجة قادرون على تلبية هذه المطالب لتصوير الخلايا المسمى مع fluorophores متعددة.

تقسيم نظم تقسيم الانبعاثات كاميرا مزدوجة وقنوات مرشح مضان في اثنين من الكاميرات مماثلة لالتقاط الصور في وقت واحد اثنين متطابقة مكانيا ولكن fluorophore محددة مع الإبقاء على حقل كامل من الرأي. هذه التكنولوجيا تمكن المقارنة المباشرة من الصورة التي تم التقاطها في الوقت الحقيقي في كل قناة، وتتيح للمستخدم التبديل بسرعة بين نماذج الكاميرا مع قدرات التصوير المختلفة. هذه الميزة مفيدة لإجراء تعديلات على إعدادات التقاط الصور في كاميرا واحدة التي تسمح أفضل نظام لالتقاطfluorophores مع كثافات مختلفة، عمر، ومعاملات الانقراض 8. إلى جانب برامج التصوير، ونظم تقسيم الانبعاثات كاميرا مزدوجة تسمح للتسجيل في الوقت الحقيقي من فحوصات التصوير الخلية الحية في موجات متعددة، ويمكن أن تعزز في المختبر المقايسات التي تستخدم مضان لدراسة سلوك الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تركيب البرمجيات

  1. شراء StreamPix 5 متعدد كاميرا البرنامج مع وحدة SimulPix أو برامج التصوير الأخرى قادرة على جمع والجمع بين الصور الملتقطة بواسطة الكاميرات أحادية اللون اتفاقية مكافحة التصحر.
  2. الحد الأدنى لمتطلبات StreamPix 5 ما يلي: A PC مجهزة كور 2 ديو 2.4 غيغاهرتز مع أو أفضل مع 2 غيغابايت من ذاكرة الوصول العشوائي أو أعلى. كاميرا الرقمية أو التناظرية IEEE بدعم ومتوافقة الإطار المختطف. نوافذ XP/7/Vista 32 أو 64 بت. ورصد دعم القرار 1،024 × 768 أو أعلى. (ينصح OCU التعبير عن 16X أو أفضل) ألف محول الرسومات مع أداء 2D جيدة ومحرك القرص الثابت 7،200 لفة في الدقيقة لتسجيل مع RAID-O التكوين.

2. تركيب نظام كاميرا مزدوجة قادرة على اثنين من لون في وقت واحد التصوير في الوقت الحقيقي

  1. ربط الخائن DC2 Photometrics الانبعاثات، أو ما شابه ذلك الجهاز كاميرا مزدوجة تقسيم الانبعاثات، إلى المجهر عن طريق تحريك محول DC2 C-جبل بمنفذ الفيديو من ميكرoscope ان هذه المساكن من مزدوج اللون على الجهاز يمكن الوصول إليها.
  2. إدراج اثنين من الكاميرات أحادية اللون اتفاقية مكافحة التصحر في الإناث C-جبل 1 والإناث C-جبل 2. كاميرات متطابقة هي الأفضل. يمكن استخدام كاميرات مماثلة، ولكن التوافق تعتمد على الأجهزة الداخلية، والأهم من مستشعر الصورة CCD.
  3. استخدام برامج التصوير لعرض الصور من كل من الكاميرات. تطبيق - (2.3.4 2.3.1) لStreamPix 5 مع وحدة SimulPix ويجب أن تتكيف لغيرها من برامج التصوير كاميرا متعددة الخطوات التالية.
    1. مفتوحة StreamPix 5 وحدد "مساحة العمل" في الشريط المهمة.
    2. مفتوحة "مدير مساحة العمل" التي تقع في أقصى اليمين من الشاشة وحدد "مساحة عمل جديدة".
    3. بعد تسمية كاميرا، اتبع البرنامج يطالبك لاختيار المختطف من قائمة ما قبل بالسكان. حدد المختطف مطابقة طراز الكاميرا وتكرار لمساحة الكاميرا الثانية. لمساحة المدمجة، كرر مرة أخرى ولكن "جميع الكاميرات قيد الاستخدام" خطأ مessage سوف تظهر. هذه الرسالة أمر طبيعي.
    4. مرة واحدة يتم تحميل مساحة العمل المدمجة، تعيين الكاميرات من مساحة العمل 1 و 2 مساحة العمل إلى مساحة العمل المدمجة في لوحة لرسو السفن تقع على الجانب الأيمن من الشاشة المشاهدة.
  4. محاذاة الكاميرات في الكاميرا نظام تقسيم الانبعاثات المزدوجة.
    1. محاذاة الكاميرات في حقل مشرق أو الطوري مع شبكة المعايرة المقدمة من قبل الشركة المصنعة باستخدام الهدف 40X PlanApo (أو أكبر).
    2. إرسال الضوء على العدسات المجهر، ووضع معايرة الشبكة المعدنية المغلفة التي تم توفيرها من قبل الشركة المصنعة على المسرح المجهر، وساحة الشبكة على المسرح المجهر.
    3. جلب الشبكة إلى التركيز.
    4. تهجير، ولكن لا تقم بإزالة والإسكان مزدوج اللون لمحاذاة الكاميرا 1 (الكاميرا الالتفافية). عرض الشبكة دون binning ودون autoscaling. تركيز الصورة باستخدام قرص ضبط التركيز على ميناء جبل C-1.
    5. دفع السكن مزدوج اللون في CHANNE المزدوجل الجهاز الاستحواذ بالكامل، بحيث يتم تقسيم الصورة من قبل مزدوج اللون إلى كل من الكاميرات.
    6. ترخي الثلاثة 5/64 "مجموعة مسامير وتدوير الكاميرا الثانية على الأنثى C-جبل 2 حتى توجه الشبكة هو متطابقة في كل من الصور. عن طريق الاتصال الهاتفي التكيف التركيز على C-جبل الميناء 2، وجلب الصورة من الكاميرا 2 في التركيز.
    7. وضع اللمسات الأخيرة على تشكيلة باستخدام الصورة جنبا إلى جنب في مساحة العمل المدمجة من برامج التصوير. هذا يسمح لأحد أن يرى في الوقت الحقيقي pseudocolor تراكب الصورتين من الشبكة المعايرة. توفيق أوضاع صورة مجتمعة فقط باستخدام R / L مقبض الباب على الجانب الأيمن من DC2. ضبط هذا المقبض حتى يتم محاذاة الحدود العمودية يمين / يسار الصور بدقة.
    8. استخدام مقبض U / D لضبط المحاذاة لأعلى / أسفل الصورة الثانية حتى يتم محاذاة قضبان أفقية الشبكة بشكل صحيح.
    9. إذا خلال محاذاة لأعلى / أسفل كاميرا دوران طفيف يحدث، صحيح هذه القضية من خلال تخفيف 5/64 "بوصة شاش ثلاثةWS للكاميرا 2 وتدوير حتى يتم محاذاة الصورة المعروضة بشكل صحيح.

3. إعداد خلايا سرطان لوحة الموازي تدفق غرفة التصاق الفحص

  1. ثقافة BT-20 خلايا سرطان الثدي في الحد الأدنى الضروري المتوسطة (MEM) تستكمل لإكمال المتوسطة مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين الستربتوميسين عند 37 درجة مئوية و 5.0٪ CO 2 كما سبق وصفه 2.
  2. الخلايا السرطانية الحصاد مع العلاج المخفف التربسين وعدد الخلايا مع عدادة الكريات.
  3. غسل وتعليق الخلايا في 10 7 خلية / مل في 0.1٪ الزلال من المصل البقري (BSA) في DPBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم (DPBS +).
  4. تمييع الأجسام المضادة الأولية، والماوس المنقى CD24 مكافحة الفئران والإنسان النقي HECA-452 (المستضدات مكافحة sialofucosylated)، إلى تركيز الأمثل محددة سلفا في 0.1٪ BSA DPBS +. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة 9، 10.
  5. خلايا الطرد المركزي في 1،200 دورة في الدقيقة للحصول على بيليه الخلية. ASPIمعدل الأجسام المضادة الأولية، وغسل الخلايا مرتين مع 0.1٪ BSA DBPS +.
  6. تمييع الأجسام المضادة الثانوية، الماعز المضادة للماوس مفتش AlexaFluor 568 (الانبعاثات كحد أقصى، 603 نانومتر)، والماعز لمكافحة الفئران الغلوبولين المناعي AlexaFluor 488 (الانبعاثات كحد أقصى، 519 نانومتر)، إلى تركيز الأمثل محددة سلفا في 0.1٪ BSA DPBS +. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة.
  7. غسل الخلايا مرتين ووقف في 0.1٪ BSA DPBS + في 10 6 خلية / مل في 0.1٪ BSA DPBS +.

4. إعداد رد الفعل الركيزة لوحة الموازي تدفق غرفة التصاق الفحص

  1. ربط اثنين من أنابيب منفصلة أطوال إلى مدخل ومخرج موانئ غرفة تدفق موازية لوحة التي تناسبها داخل 35 مم الأنسجة طبق الثقافة. واحد أنبوب الاتصال الخزان من الخلايا المسمى علقت في 0.1٪ BSA DPBS + والآخر إلى ضخ حقنة، والتي سوف تسحب السوائل بمعدل تدفق محدد.
  2. توصيل خط فراغ إلى غرفة التدفق 1.
  3. وضع غرفة تدفق أكثر من 35 ملم زراعة الأنسجة ديركلات الترجيح التي تحتوي على أحادي الطبقة من الخلايا المبيض الهامستر الصيني معربا عن E-selectin (CHO-E). وقد نمت الخلايا CHO-E في MEM المتوسطة كاملة عند 37 درجة مئوية و 5.0٪ CO 2 2.
  4. ضبط غرفة التدفق و / أو تدفق غرفة طوقا لضمان وجود ختم فراغ كاف 1.
  5. سحب السائل من الخزان، ورصد التجمع غرفة تدفق لختم الصحيح وأي دليل مرئي لتشكيل فقاعة الهواء 1.
  6. وضع تدفق التجمع الغرفة على المجهر (لايكا 6000B DMI) 1.

5. اللونين الحصول على صورة

  1. السلطة مصدر الضوء المدمجة لايكا EL-6000، أو جهاز مماثل، لتوليد ضوء ارتفاع كثافة وزوجين قبل أن تتحول إلى دليل ضوء. استخدام مجهر مقلوب لتمرير هذا الضوء من خلال مرشح مزيج مكعب، أي G / R (أخضر / أحمر) مرشح مكعب، لإثارة fluorophores من المطلوب اللون / الشدة.
  2. ضمان السكن مزدوج اللون هو في وضع التشغيل الصحيح (الاكتئاب) وليس في وضع الالتفافية.
  3. تعمل المجهر مضان في وضع وتحديد السليم مكعب مرشح مضان (أخضر / أحمر).
  4. تحديد وقت التعرض وزيادة في كاميرا 1 (الحمراء؛ 620 ± 60 نانومتر) وكاميرا 2 (الأخضر؛ 535 ± 40 نانومتر).
    1. كساد مزدوج اللون للحصول على صور في القنوات الانبعاثات الحمراء والخضراء على حد سواء. استخدام مقايسة غرفة التدفق مع الخلايا المسمى مع fluorophore الحمراء فقط، والحصول على صورة في القناة الحمراء عن طريق ضبط وقت التعرض للكاميرا 1 في "إعدادات الحية" من برامج التصوير.
    2. تطابق وقت التعرض للكاميرا 2 إلى وقت التعرض للكاميرا 1. إذا لوحظ حدوث الصورة في قناة خضراء، والتحف تنزف من خلال وجود وزمن التعرض في كل من الكاميرات يحتاج إلى خفضها.
    3. الحفاظ على وقت التعرض ما يعادلها في الكاميرا وكاميرا 2 1، والحد من فترة التعرض حتى قطعة أثرية، من خلال تنزف لم تعد مرئية في قناة خضراء. ضبط كسب كاميرا 1 لتحسين صورة visibilitذ في القناة الحمراء إذا لزم الأمر.
    4. كرر الخطوات من 5.4.1 - 5.4.3 مع الخلايا المسمى مع fluorophore الخضراء فقط، ولكن تحديد زمن التعرض مع كاميرا 2 إلى خلايا الصورة في قناة خضراء دون التحف تنزف من خلال في القناة الحمراء التي جمعتها كاميرا 1.
    5. الأجسام المضادة Retitrate إذا التحف تنزف من خلال لا يمكن القضاء عليها 11، أو إذا مرات التعرض للكاميرا 1 كاميرا 2 وتختلف اختلافا كبيرا بحيث اندمجت قد تكون الصور المنحرفة زمنيا.
  5. استخدام برامج التصوير لعرض الصور التي تم التقاطها في وقت واحد من اثنين من الكاميرات أحادية اللون اتفاقية مكافحة التصحر في التجربة غرفة التدفق.
  6. دمج الصور التي تم جمعها من كل من الكاميرات باستخدام وحدة SimulPix من Streampix 5 أو حزمة برامج بديلة.
  7. استخدام التعديلات التصحيح الرقمي في SimulPix أو برامج بديلة لمحاذاة مكانيا الصور المدمجة، إذا لزم الأمر. يمكن تصحيح الصور مع وحدة لSimulPix الأفقي والرأسي، والتسويات التناوب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم استخدام غرفة تدفق موازية لوحة التصاق مقايسة ليبرهن على وجود نظام مزدوج تقسيم الانبعاثات الكاميرا التي استولت في وقت واحد تسلسلات الصور في الوقت الحقيقي في قنوات الانبعاثات اثنين (الشكل 1). الكشف عن الكاميرا الانبعاثات نظام تقسيم مزدوج BT-20 الخلايا التي تم fluorescently المسمى مع CD24 مكافحة الإنسان وHECA-452 (كشف المستضدات sialofucosylated) الاجسام المضادة والأجسام المضادة الثانوية المناسبة (الشكل 2). بعض الخلايا المتداول عرض الإشارات الحمراء (CD24) بعد إشارات خضراء لا يمكن الكشف عنها (HECA-452)، والبعض الآخر عرض إشارات خضراء وإشارات حمراء لا يمكن الكشف عنها، وبعد عرض كل من الخلايا الأخرى إشارات حمراء وخضراء (الشكل 2). كشفت قنوات الانبعاثات دمج التوزيع وcolocalization من CD24 والجزيئات sialofucosylated على سطح BT-20 زنزانة (4 أرقام 3 و) المتداول على والانضمام إلى الطبقات الوحيدة CHO-E. الكاميرا المزدوجة spli الانبعاثاتنظام tting كان في الأصل خطأ طفيف محاذاة الصورة بسبب المحاذاة من الكاميرات، ولكن تم تصحيح هذا الخطأ مع تعديلات رقمية (الشكل 5) باستخدام وحدة SimulPix من StreamPix 5. تماما، الكاميرا الانبعاثات نظام تقسيم مزدوج لديه القرار المكانية والزمانية، والبصرية اللازمة للكشف عن ميزات الخلوية والجزيئية في تطبيقات مثل فحوصات التصاق غرفة التدفق، في الخلايا التي تتحرك بسرعة من خلال مجال الرؤية.

الشكل 1
الشكل 1. التوضيح من كاميرا الانبعاثات نظام تقسيم مزدوج للحصول على الصور في غرفة تدفق موازية لوحة التصاق الفحص. يتم استخدام مضخة حقنة ليروي الخلايا على الركيزة في غرفة تدفق موازية لوحة. نظام تقسيم الانبعاثات كاميرا مزدوجة متصلة المجهر Epifluorescence مقلوب مزدوج اللون يستخدم لمirror وتصفية مكعبات لتقسيم وتصفية قنوات الانبعاثات في اثنين من الكاميرات. هذه الكاميرات التقاط اثنين متطابقة مكانيا ولكن fluorophore محددة تسلسلات الصور في وقت واحد. ويستخدم الكمبيوتر مجهزة برامج التصوير كاميرا متعددة لدمج وسجل تسلسلات الصور من كل قناة الانبعاثات.

الرقم 2
الشكل 2. تم استخدام الكاميرا الانبعاثات نظام تقسيم مزدوج في الوقت الحقيقي التصوير في وقت واحد مواز لوحة غرفة تدفق التصاق الفحص. BT-20 الخلايا المسمى مع (1) CD24 مكافحة الإنسان ومكافحة فأر مفتش AlexaFluor 568 (pseudocolored الحمراء، الانبعاثات كحد أقصى، 603 نانومتر؛ الكاميرا 1، 620 ± 60 نانومتر) و (2) HECA-452 ومكافحة الفئران الغلوبولين المناعي AlexaFluor 488 (pseudocolored الخضراء، الحد الأقصى للانبعاثات 519 نانومتر، كاميرا 2، 535 ± 40 نانومتر) وperfused أكثر من أحادي الطبقة CHO-E في إجهاد القص الجدار = 1 داين / سم 2. كاميرا مزدوجة اندمجت طالسحراء تكشف عن عدم التجانس بين السكان الخلية المتداول، ويمكن استخدامها لتوصيف سلوكيات المتداول على أساس التعبير عن جزيئات سطح الخلية. مقياس شريط = 100 ميكرون. الصورة المكتسبة مع الهدف 10X.

الرقم 3
الرقم 3. تسلسل زمني من الصور المدمجة التي استولت عليها نظام تقسيم الانبعاثات كاميرا مزدوجة تظهر BT-20 الخلايا معربا عن CD24 (pseudocolored الحمراء)، والجزيئات sialofucosylated (pseudocolored الأخضر) المتداول على أحادي الطبقة CHO-E في إجهاد القص الجدار = 1 داين / سم 2. حافظت الكاميرات القرار البصرية والزماني لتعقب ملامح خلية على خلية تراجع "انهاء أكثر من نهاية" كما توالت على الركيزة رد الفعل في اتجاه التدفق. السهام البيضاء تدل على وجود كتلة تعقب جزيئات سطح الخلية. تم pseudocolored إشارات الانبعاثات في كل قناة واندمجت في طبرامج maging. نلاحظ أن إشارات تظهر colocalized أصفر / برتقالي. لا تزال الصور التي تم تصديرها من تسلسلات الصور في الوقت الحقيقي في نقاط زمنية مبين. مقياس بار = 10 ميكرون. الصور المكتسبة مع الهدف 40X.

الرقم 4
الشكل 4. نظام تقسيم الانبعاثات كاميرا مزدوجة يكشف colocalization من CD24 (pseudocolored الحمراء) والجزيئات sialofucosylated (pseudocolored الأخضر) أعرب ممثل BT-20 خلية سرطان الثدي المتداول على أحادي الطبقة CHO-E. التعبير غير المتجانسة من (A) CD24 و (ب) sialofucosylated وأكد جزيئات على سطح الخلية في كل صورة. (C) Colocalization من الجزيئات يبدو كما pseudocolored أصفر / برتقالي البقع عندما يتم دمج القنوات الانبعاثات pseudocolored الأحمر والأخضر. قطر خلية حوالي 10 ميكرون. واي الصور المكتسبةعشر هدفا 40X.

الرقم 5
يمكن 5.Adjustments الرقم إلى الإعدادات المكانية الأفقي والرأسي، والتناوب من الصور التي تم التقاطها في كاميرا 1 كاميرا 2 وتحسين المواءمة المكاني في الصورة المدمجة. المحاذاة المناسبة أمر بالغ الأهمية لتصوير بدقة كيف يتم التمسك الخلايا والمتداول في مقايسة التصاق . (A) والمنحرفة صورة المدمجة من واحد BT-20 خلية بسبب الكاميرا لتحديد المواقع. (ب) تحسين المواءمة المكانية مع تعديلات البرامج في وحدة SimulPix من StreamPix 5. (C) تعديلات البرامج وعلاوة على ذلك تحقيق المواءمة شبه مثالية. شريط النطاق = 2 ميكرون. الصور المكتسبة مع الهدف 40X.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الكاميرا الانبعاثات نظام تقسيم مزدوج لديه القرار المكانية والزمانية، والبصرية اللازمة لالتقاط صور ذات جودة عالية في التطبيقات حيث الخلية أو الحركة الجزيئية سريع. في توليد نتائج ممثل، تم الأمثل المعلمات في النظام المزدوج تقسيم الانبعاثات الكاميرا، بما في ذلك إعدادات البرامج وإعدادات الكاميرا، للحصول على تسلسل الصور المدمجة التي كانت المتداول والخلايا الملتصقة مكانيا وزمانيا الانحياز. هذه الخطوة الأمثل أمر بالغ الأهمية، كما يمكن أن يؤدي اختلالها في الصور التي لا ينقل ظاهرة فيزيائية صحيح قيد التحقيق، مثل خلية واحدة لاحظ للفة في كل من قنوات خضراء وحمراء قد تظهر خليتين المتداول في مساحة العمل المدمجة. وينبغي تحقيق المواءمة المكانية في الإعداد للكاميرا نظام تقسيم الانبعاثات المزدوجة عندما يتم محاذاة الكاميرات جسديا كما هو موضح في الخطوة 2.4 من البروتوكول. تصويبات الرقمية إلى محاذاة المكانية من الصور الكابتنمحكم من قبل الكاميرات يمكن تطبيقها لالأفقي والرأسي، أو تعويض التناوب (ق) من خلال إعدادات التوافق الرقمي في برامج التصوير (الخطوة 5.7 والشكل 5).

ويمكن تحقيق المواءمة الزمنية بين الصور التي تم التقاطها بواسطة الكاميرا وكاميرا 2 1 عن طريق ضبط "إعدادات الحية" من الكاميرات: وقت التعرض، والإزاحة، وكسب. كسب وتعويض يمكن تعديلها دون التأثير على المواءمة الزمنية من الصور المدمجة، ولكن الانحرافات في وقت التعرض المعرفة بين الكاميرات يمكن أن يؤدي إلى اختلالها. وبالتالي تحقيق مكاسب يمكن تعديلها للتعويض عن الاختلافات بين مرات التعرض المستخدمة في جمع الصور في كل كاميرا. من الناحية المثالية، ينبغي أن يسمح للاختلافات في وقت التعرض بين الكاميرات فقط عندما تظهر التعديلات مكسب كبير لتقديم تنازلات جودة الصورة. بدلا من ذلك، والتجارب الضد المعايرة يمكن القيام بها لتحسين وضع العلامات خلية للتعويض عن الاختلافات في وقت التعرض المطلوبة من قبل كل كاميرا (أ) نظرا لخصائص المتأصلة في كل fluorophore أو (ب) وذلك بسبب الاختلافات في مستويات التعبير الجزيئية الكشف عن الأجسام المضادة من قبل كل / fluorophore. ومع ذلك، تجدر الإشارة أيضا إلى أن التجارب الضد المعايرة هي أفضل الممارسات لمنع القطع الأثرية تنزف من خلال (الخطوة 5.4.5) 11.

على الرغم من أن الكاميرا الانبعاثات نظام تقسيم المزدوج كان يستخدم في وقت واحد لصورة اثنين الجزيئات المستهدفة في قنوات منفصلة الانبعاثات والتكنولوجيات البديلة هي قادرة على التقاط الصور في وقت واحد في قنوات متعددة الانبعاثات. وتتراوح هذه النظم التصوير من كاميرات لون واحد لالمجاهر متحد البؤر، ولكل منها مزاياه وعيوبه بالنسبة لجودة الصورة، والسرعة، وتكلف 12-17. على وجه الخصوص، للدولة من بين الفن المجاهر المسح الضوئي ليزر متحد البؤر التي تضم الماسحات الضوئية الرنانة هي أنظمة التصوير متعددة الأطياف مؤثرة قادرة على الحصول على الصور في مئات من لقطة في الثانية. هذه الأنظمة متحد البؤر هي قوية للغاية،ولكن تكلفتها قد تحد من عدد من الباحثين أن يكون الوصول إلى هذه النظم من خلال المرافق الأساسية. في نهاية المطاف، والاحتياجات والموارد الفحص كل مختبر إملاء أي نظام التصوير متعدد القنوات هي الأكثر ملاءمة.

الأساليب الموصوفة هنا شرح كيفية الحصول على تسلسلات الصور في الوقت الحقيقي في قنوات الانبعاثات اثنين باستخدام كاميرا الانبعاثات نظام تقسيم مزدوج وبرامج التصوير. محاذاة المكانية والزمانية من الصور التي تم التقاطها في قنوات مماثلة من قبل اثنين من الانبعاثات الكاميرات أحادية اللون اتفاقية مكافحة التصحر هي ضرورية لإنتاج عالية الجودة في الوقت الحقيقي تسلسلات الصور اندمجت التي تكشف في نفس الوقت متعددة الجزيئات المستهدفة في الخلايا. وتشمل التطبيقات للكاميرا الانبعاثات نظام تقسيم مزدوج أي اللونين تحليل الخلية الحية التي تتطلب دقة بصرية والزماني استثنائية من حقل الكامل للعرض، مثل فحوصات تدفق، إزفاء من الجزيئات سطح الخلية، وإعادة عرض هيكل الخلية، النقل الحويصلي، والجسيمات 3D تتبع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

الكتاب أود أن أشكر الدكتور دوغلاس جويتز (قسم هندسة الكيميائية والبيولوجية، جامعة ولاية أوهايو) والدكتور فابيان Benencia (قسم العلوم الطبية الحيوية، جامعة ولاية أوهايو) لإجراء مناقشات الثاقبة ومراجعة مخطوطة. نشكر أيضا الدكتور كريستوفر Huppenbauer لإجراء مناقشات تقنية مفيدة (دبليو Nuhsbaum شركة). وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المؤسسة الوطنية للعلوم (CBET-1106118)، والمعاهد الوطنية للصحة (1R15CA161830-01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
BT-20 cells ATCC HTB-19
CHO-E cells Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School)
MEM Thermo Scientific SH30024.01
FBS Thermo Scientific SH30396.03
Penicillin-streptomycin Thermo Scientific SV30010
0.25% Trypsin / 0.1% EDTA Thermo Scientific SV30031.01
DPBS Thermo Scientific SH30028.02
DPBS+ Life Technologies 14080-055
BSA Sigma A9647
HECA-452 monoclonal antibody BD Biosciences 555946
Anti-human CD24 monoclonal antibody BD Biosciences 555426
Anti-rat IgM AlexaFluor 488 Invitrogen A21212
Anti-mouse IgG AlexaFluor 568 Invitrogen A11004
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera Q Imaging EXI-BLU-R-F-M-14-C
Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera Q Imaging RET-EXi-F-M-12-C
DC2 Emission Splitter Photometrics DC2
Inverted Fluorescence Microscope Leica DMI6000 B
Streampix 5 software Norpix

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
  2. Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. Mac-2 binding protein is a novel e-selectin ligand expressed by breast cancer cells. PLoS One. 7, (9), e44529 (2012).
  3. Burdick, M. M., McCaffery, J. M., Kim, Y. S., Bochner, B. S., Colon Konstantopoulos, K. carcinoma cell glycolipids, integrins, and other glycoproteins mediate adhesion to HUVECs under flow. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, (4), C977-C987 (2003).
  4. Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions. J. Biol. Chem. 283, (23), 15816-15824 (2008).
  5. Shirure, V. S., Henson, K. A., Schnaar, R. L., Nimrichter, L., Burdick, M. M. Gangliosides expressed on breast cancer cells are E-selectin ligands. Biochem Biophys. Res. Commun. 406, (3), 423-429 (2011).
  6. Tees, D. F., Goetz, D. J. Leukocyte adhesion: an exquisite balance of hydrodynamic and molecular forces. News Physiol. Sci. 18, 186-190 (2003).
  7. Chang, K. C., Tees, D. F., Hammer, D. A. The state diagram for cell adhesion under flow: leukocyte rolling and firm adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, (21), 11262-11267 (2000).
  8. Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nat. Methods. 2, (12), 910-919 (2005).
  9. Kummitha, C. M., Shirure, V. S., Delgadillo, L. F., Deosarkar, S. P., Tees, D. F., Burdick, M. M., Goetz, D. J. HECA-452 is a non-function blocking antibody for isolated sialyl Lewis x adhesion to endothelial expressed E-selectin under flow conditions. J. Immunol. Methods. 384, (1-2), 43-50 (2012).
  10. Burdick, M. M., Henson, K. A., Delgadillo, L. F., Choi, Y. E., Goetz, D. J., Tees, D. F., Benencia, F. Expression of E-selectin ligands on circulating tumor cells: cross-regulation with cancer stem cell regulatory pathways? Front. Oncol. 2, 103 (2012).
  11. Hoffman, G. E., Le, W. W., Sita, L. V. The Importance of Titrating Antibodies for Immunocytochemical Methods. Current Protocols in Neuroscience. John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  12. Weinberg, S., Lipke, E. A., Tung, L. In vitro electrophysiological mapping of stem cells. Methods Mol. Biol. 660, 215-237 (2010).
  13. Kong, K. V., Leong, W. K., Lim, L. H. Osmium carbonyl clusters containing labile ligands hyperstabilize microtubules. Chem. Res. Toxicol. 22, (6), 1116-1122 (2009).
  14. Vermot, J., Fraser, S. E., Liebling, M. Fast fluorescence microscopy for imaging the dynamics of embryonic development. HFSP J. 2, (3), 143-155 (2008).
  15. Bullen, A., Friedman, R. S., Krummel, M. F. Two-photon imaging of the immune system: a custom technology platform for high-speed, multicolor tissue imaging of immune responses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 334, 1-29 (2009).
  16. Worth, D. C., Parsons, M. Advances in imaging cell-matrix adhesions. J. Cell Sci. 123, 3629-3638 (2010).
  17. Xiao, Z., Visentin, G. P., Dayananda, K. M., Neelamegham, S. Immune complexes formed following the binding of anti-platelet factor 4 (CXCL4) antibodies to CXCL4 stimulate human neutrophil activation and cell adhesion. Blood. 112, (4), 1091-1100 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics