Capture simultanément en temps réel des images en deux canaux d'émission en utilisant un système de fractionnement double caméra émission: Applications à l'adhésion cellulaire

Bioengineering

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Summary

Émissions des systèmes de séparation à double caméra pour deux couleurs microscopie à fluorescence générer en temps réel des séquences d'images avec une résolution optique et temporelle exceptionnelle, une exigence de certains tests cellulaires en direct, y compris des essais parallèles chambre d'écoulement de la plaque d'adhérence. Lorsque le logiciel est utilisé pour fusionner des images de canaux d'émission acquis simultanément, des séquences d'images pseudocolored sont produites.

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Carlson, G. E., Martin, E. W., Burdick, M. M. Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion. J. Vis. Exp. (79), e50604, doi:10.3791/50604 (2013).

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Abstract

Multi-color microscopie par immunofluorescence pour détecter des molécules spécifiques dans la membrane cellulaire peut être couplé avec des dosages en parallèle de la chambre d'écoulement de la plaque pour étudier les mécanismes qui régissent l'adhérence cellulaire dans des conditions d'écoulement dynamique. Par exemple, les cellules cancéreuses marquées avec des fluorophores multiples peuvent être perfusées sur un substrat potentiellement réactifs pour modéliser les mécanismes de la métastase cancéreuse. Cependant, multi-canaux systèmes de caméras et appareils photo unique de couleur présentent des lacunes dans l'acquisition d'image pour analyse en temps réel des cellules vivantes. Pour surmonter ces limitations, nous avons utilisé un système de séparation des émissions de double caméra pour capturer simultanément en temps réel des séquences d'images de cellules marquées par fluorescence dans la chambre d'écoulement. Longueur d'onde filtre des systèmes de séparation d'émission de l'appareil photo à double sens varie en deux caméras CCD monochrome, capturant ainsi simultanément deux images identiques mais spatialement spécifique fluorophores. Par la suite, psuedocolored images d'un canal sont combinés en un seulen temps réel a fusionné la séquence qui peut révéler de multiples molécules cibles sur des cellules se déplaçant rapidement à travers une région d'intérêt.

Introduction

Des procédés pour l'analyse de molécules sur la surface des cellules, telles que l'immunocoloration, emploient des sondes qui sont chimiquement conjugués à des fluorophores, ce qui permet la détection de molécules cibles. Imagerie des cellules vivantes et hydrodynamiques des essais d'adhérence des cellules basées sur les flux sont généralement enregistrés avec des caméras CCD monochrome conçus pour capturer les processus physiologiques au niveau cellulaire et / ou moléculaire 1, 2. Ces caméras sont très sensibles, offrir des taux de trame rapides (plus de 30 images par seconde), et de fournir une résolution temporelle exceptionnelle (en raison de taux de trame rapides et des temps d'exposition court). Toutefois, les caméras monochromes ne peuvent capturer un canal d'émission unique (détection d'un seul fluorophore) pour recueillir des images. Simples systèmes caméra émission de séparation peuvent être incorporés à capturer plusieurs canaux d'émission mais réduisent souvent le champ de vision et nécessitent le même temps d'exposition pour l'imagerie de tous les canaux. Pour capturer le spectre complet des couleurs de cellules marquées par multiparele fluorophores, une caméra couleur peut être utilisé comme une alternative. Cependant, les caméras couleurs ne sont généralement pas capables de fournir la résolution temporelle souhaitée pour l'imagerie des cellules vivantes dans certaines applications. Un autre dispositif de formation d'image est nécessaire pour les applications dans lesquelles il est avantageux de l'image des cellules vivantes dans des longueurs d'ondes multiples tout en conservant une haute résolution temporelle. Une application expérimentale de choix est l'analyse de l'adhérence de la chambre d'écoulement à plaques parallèles, dans lequel les cellules sont perfusées dans des conditions physiologiquement pertinentes sur un substrat potentiellement réactif 1, 3. Les cellules dans le flux qui expriment des molécules de surface spécifiques de cellules peuvent adhérer et roulent sur ​​le substrat, par exemple une monocouche de cellules exprimant des molécules d'adhésion ou des protéines de surface adsorbé extracellulaires matricielles 4, 5. Cellules de roulement peuvent subir un mouvement de rotation et de translation en une fraction de seconde. Les caractéristiques moléculaires et de laminage sur les cellules adhérentes, telles que des grappes de molécules de surface cellulaire, ont également le potentiomètreal à subir une réorganisation active sur la surface de la cellule. Ainsi, les systèmes d'imagerie doivent fournir une résolution temporelle exceptionnel (30 images par seconde ou plus, et "proche de zéro" temps d'exposition) pour générer une séquence d'images qui illustre la progression étape par étape de la cellule de roulement 6, 7. Systèmes de séparation double caméra d'émission sont capables de répondre à ces exigences pour l'imagerie de cellules marquées avec des fluorophores multiples.

Systèmes de séparation double caméra d'émission répartis et canaux de fluorescence de filtre en deux caméras semblables à capturer simultanément deux images identiques mais spatialement spécifique fluorophores tout en conservant la totalité du champ de vue. Cette technologie permet la comparaison directe de l'image capturée en temps réel dans chaque canal et permet à l'utilisateur de basculer rapidement entre les modèles d'appareil photo avec différentes capacités d'imagerie. Cette fonction est utile pour faire des ajustements aux paramètres de capture d'image dans un appareil photo qui mieux permettre au système de capturefluorophores avec différentes intensités, durées de vie, et des coefficients d'extinction 8. Couplée avec un logiciel d'imagerie, des systèmes de séparation d'émission de caméra double permet l'enregistrement en temps réel en direct des dosages d'imagerie des cellules dans les longueurs d'onde multiples et peuvent améliorer les essais in vitro qui utilisent la fluorescence pour étudier le comportement des cellules.

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Protocol

Une. Installation du logiciel

  1. Achetez Streampix 5 logiciels multi-caméras avec module SimulPix ou un autre logiciel d'imagerie capable de collecter et combiner des images captées par les caméras CCD monochrome.
  2. Exigences minimales pour Streampix 5 comprennent: Un PC équipé Core 2 Duo 2,4 GHz ou mieux avec 2 Go de RAM ou plus. Une caméra IEEE soutenu numérique ou analogique et d'acquisition d'images compatible. Fenêtres XP/7/Vista 32 ou 64 bits. Un moniteur supportant une résolution de 1024 x 768 ou supérieure. Une carte graphique avec de bonnes performances 2D (UCO express 16x ou plus est recommandé) et 7200 RPM disque dur pour l'enregistrement avec configuration RAID-O.

2. Installation d'un système de double caméra Capable de deux couleurs simultanée d'imagerie en temps réel

  1. Connectez le séparateur DC2 Photometrics d'émission, ou dispositif d'émission de fractionnement double caméra similaire, au microscope en faisant glisser l'adaptateur DC2 monture C dans le port vidéo de la MICRoscope de telle sorte que le logement de la dichroïque sur le dispositif est accessible.
  2. Insérez deux caméras CCD monochrome en femelle monture C 1 et C-femme monter 2. Caméras identiques sont préférables. Caméras similaires peuvent être utilisés, mais dépend de la compatibilité matérielle interne, le plus important au capteur d'image CCD.
  3. Utilisez le logiciel d'imagerie pour afficher les images des deux caméras. Les étapes suivantes (2.3.1 - 2.3.4) s'appliquent à Streampix 5 avec module SimulPix et doivent être adaptés à d'autres logiciels d'imagerie multi-caméra.
    1. Ouvrir Streampix 5 et sélectionnez "espace de travail" dans le ruban de la tâche.
    2. Ouvrir "gestionnaire d'espace de travail», situé à l'extrême droite de l'écran et sélectionnez «nouvel espace de travail".
    3. Après la nomination d'un appareil photo, suivez le logiciel demande de sélectionner une carte d'acquisition d'une liste pré-remplie. Sélectionnez la carte d'acquisition correspondant au modèle de l'appareil et répétez l'opération pour le deuxième espace de travail de la caméra. Pour l'espace de travail fusionnée, répéter une fois de plus, mais «toutes les caméras sont en cours d'utilisation" erreur message s'affiche. Ce message est normal.
    4. Une fois l'espace de travail fusionnée est chargé, affecter les caméras de l'espace de travail et espace de travail 1 2 à l'espace de travail fusionnée dans le panneau d'accueil situé sur le côté droit de l'écran de visualisation.
  4. Alignez les caméras dans le système de séparation des émissions de double caméra.
    1. Alignez les caméras dans le champ lumineux ou contraste de phase avec la grille de calibrage fourni par le fabricant en utilisant un objectif Planapo 40X (ou plus).
    2. Envoyer lumière pour les oculaires du microscope, placer la grille de calibrage revêtus de métal qui a été fourni par le fabricant sur la platine du microscope et de la place de la grille sur la platine du microscope.
    3. Apportez la grille dans le foyer.
    4. Déplacer, mais ne pas retirer le boîtier dichroïque pour aligner la caméra 1 (caméra de dérivation). Afficher la grille sans binning et sans le redimensionnement. Concentrer l'image en utilisant la molette de réglage de mise au point sur le port monture C 1.
    5. Poussez le boîtier dichroïque dans le double Channel dispositif d'acquisition entièrement, de sorte que l'image est divisée par le dichroïque à deux caméras.
    6. Desserrer les trois 5/64 "set vis et tourner la deuxième caméra sur la femelle monture C 2 jusqu'à ce que l'orientation de la grille est identique dans les deux images. Utilisation de la molette de réglage de mise au point sur le C-monter le port 2, amener l'image de la caméra 2 dans le foyer.
    7. Achever l'alignement de l'aide de l'image combinée dans l'espace de travail fusionnée du logiciel d'imagerie. Cela permet de voir un pseudo-superposition en temps réel des deux images de la grille d'étalonnage. Ajuster les positions d'image combinées en utilisant uniquement le système R / L bouton sur le côté droit de la DC2. Réglez ce bouton jusqu'à ce que droite / gauche limite verticale des images est précisément aligné.
    8. Utilisez le bouton U / D pour régler l'alignement haut / bas de la deuxième image jusqu'à ce que les barres horizontales de la grille sont correctement alignés.
    9. Si lors de l'alignement vers le haut / vers le bas une légère rotation de la caméra se produit, Corriger cette question en desserrant les trois 5/64 "scre poucesws pour appareil photo 2 et tourner jusqu'à ce que l'image affichée est correctement aligné.

3. Préparation des cellules cancéreuses pour plaques parallèles Chambre de circulation Essai d'adhésion

  1. Culture BT-20 des cellules de cancer du sein dans un milieu essentiel minimum (MEM) additionné de milieu complet avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine à 37 ° C et 5,0% de CO 2, comme précédemment décrit 2.
  2. Récolte des cellules cancéreuses avec un traitement à la trypsine diluée et compter les cellules avec un hémocytomètre.
  3. Laver et suspendre les cellules à 10 7 cellules / ml dans 0,1% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans du DPBS avec calcium et magnésium (DPBS +).
  4. Diluer les anticorps primaires, les souris purifié anti-CD24 humain et de rat purifiée HECA-452 (les antigènes anti-sialofucosylated), à une concentration optimale prédéterminée dans 0,1% de BSA DPBS +. Incuber les cellules pendant 30 min 9, 10.
  5. Centrifuger les cellules à 1200 rpm pour obtenir un culot cellulaire. Aspiévaluer anticorps primaire, et laver les cellules deux fois avec 0,1% de BSA SPD +.
  6. Diluer anticorps secondaires, de chèvre anti-IgG de souris AlexaFluor 568 (émission max, 603 nm), et de chèvre anti-IgM de rat AlexaFluor 488 (émission max, 519 nm), à une concentration optimale prédéterminée dans 0,1% de BSA DPBS +. Incuber les cellules pendant 30 min.
  7. Laver les cellules deux fois et suspendre dans 0,1% de BSA DPBS + à 10 6 cellules / ml dans 0,1% de BSA DPBS +.

4. Préparation du réactif Substrat pour plaque parallèle Chambre de circulation Essai d'adhésion

  1. Relier deux longueurs de tube séparées pour les ports de la chambre d'écoulement parallèle de la plaque qui s'adapte à l'intérieur d'une boîte de culture tissulaire de 35 mm entrée et de sortie. Un tube se connecte au réservoir de cellules marquées en suspension dans 0,1% de BSA DPBS + et l'autre à la pompe à seringue, qui va retirer du fluide à un débit spécifié.
  2. Connexion à une ligne vide à la chambre d'écoulement 1.
  3. Placez la chambre d'écoulement sur le 35 mm culture de tissus dish contenant une monocouche de cellules d'ovaire de hamster chinois exprimant la sélectine E (CHO-E). Des cellules CHO-E ont été cultivées dans du milieu MEM complet à 37 ° C et 5,0% de CO 2 2.
  4. Ajuster la chambre d'écoulement et / ou le joint de la chambre d'écoulement afin d'assurer un joint étanche au vide suffisant 1.
  5. Retirer du fluide depuis le réservoir, le contrôle de l'assemblage de la chambre d'écoulement pour une bonne étanchéité, et aucune preuve visuelle de la formation de bulles d'air 1.
  6. Placer l'assemblage de la chambre d'écoulement sur ​​le microscope (Leica DMI 6000B) 1.

5. Deux couleurs d'acquisition de l'image

  1. Puissance d'une source Leica EL-6000 lumière compact, ou un dispositif similaire, pour générer une lumière de forte intensité et deux dans un guide de lumière. Utilisez un microscope inversé à passer cette lumière à travers un filtre de combinaison cube, soit G / R (vert / rouge) filtre cube, pour exciter des fluorophores de couleur / intensité souhaitée.
  2. Assurez logements dichroïque est en position de fonctionnement correct (déprimé) etn'est pas en mode de dérivation.
  3. Fonctionner en mode microscope de fluorescence et sélectionnez bon cube de filtre de fluorescence (vert / rouge).
  4. Déterminer le temps d'exposition et le gain en appareil photo 1 (rouge, 620 ± 60 nm) et un appareil photo 2 (vert, 535 ± 40 nm).
    1. Appuyez sur la dichroïque pour obtenir des images dans les deux canaux d'émission rouge et vert. Utilisation d'un dosage de la chambre d'écoulement avec des cellules marquées avec le fluorochrome rouge seulement, et obtenir une image dans le canal rouge en ajustant le temps d'exposition de la caméra 1 en "direct" paramètres du logiciel d'imagerie.
    2. Correspondre à la durée d'exposition de l'appareil photo 2 à la durée d'exposition de la caméra 1. Si une image est observée dans le canal vert, les artefacts de purge-through sont présents et la durée d'exposition dans les deux appareils doit être réduite.
    3. Garder le temps d'exposition équivalent à huis clos et une caméra 2, de réduire le temps d'exposition jusqu'à ce que l'artefact de purge par n'est plus visible dans le canal vert. Réglez le gain de la caméra 1 pour améliorer l'image visibility dans le canal rouge, si nécessaire.
    4. Répétez les étapes 5.4.1 - 5.4.3 avec des cellules marquées avec le fluorophore vert seulement, mais de définir le temps d'exposition avec un appareil photo 2 cellules d'image dans le canal vert sans artefacts purge travers du canal rouge recueillies par la caméra 1.
    5. Anticorps Retitrate si artefacts purge par ne peuvent être éliminés 11, ou si le temps d'exposition de la caméra 1 et la caméra 2 sont sensiblement différents, tels que la fusion des images peuvent être temporellement alignées.
  5. Utilisez le logiciel d'imagerie pour visualiser les images capturées simultanément à partir de deux caméras CCD monochrome dans l'expérience de la chambre d'écoulement.
  6. Fusionner des images recueillies par les deux caméras en utilisant le module de SimulPix Streampix 5 ou un logiciel alternatif.
  7. Utiliser les ajustements de correction numériques en SimulPix ou logiciel alternatif pour aligner spatialement les images fusionnées, le cas échéant. Les images peuvent être corrigées avec le module SimulPix pour horizontal, verticalet les ajustements de rotation.

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Representative Results

Un essai d'adhérence à la chambre d'écoulement à plaques parallèles a été utilisé pour démontrer un système de fractionnement appareil d'émission double qui a capturé simultanément en temps réel de séquences d'images en deux voies d'émission (figure 1). Le système de division de l'émission de la caméra double détecté BT-20 cellules qui ont été marquées par fluorescence avec CD24 anti-humain et HECA-452 (détection des antigènes sialofucosylated) des anticorps monoclonaux et des anticorps secondaires appropriés (figure 2). Certaines cellules de roulement affichés signaux rouges (CD24) pour le moment signaux verts indétectables (HECA-452), d'autres signaux affichés verts et rouges signaux indétectables, et encore d'autres cellules affichés à la fois des signaux rouge et vert (Figure 2). Canaux d'émission fusionnées ont révélé la distribution et la co-localisation de CD24 et des molécules sialofucosylated sur la surface de cellules BT-20 roule sur et adhérant à des cellules CHO-E monocouches (figures 3 et 4). L'émission de la caméra double splisystème de tting avait à l'origine une légère erreur d'alignement d'image en raison de l'alignement des caméras, mais cette erreur a été corrigée avec des ajustements numériques (figure 5) en utilisant le module de SimulPix Streampix 5. Au total, le système de fractionnement de l'émission de la caméra a la double résolution spatiale, temporelle, et les caractéristiques optiques nécessaires pour révéler cellulaires et moléculaires dans des applications telles que les tests d'adhésion de la chambre d'écoulement, dans laquelle les cellules se déplacent rapidement à travers le champ de vision.

Figure 1
Figure 1. L'illustration d'un système de séparation à deux caméras d'émission pour l'acquisition d'images dans un dosage chambre d'écoulement de la plaque d'adhérence parallèle. Une pompe à seringue est utilisée pour perfuser les cellules sur le substrat dans la chambre d'écoulement à plaques parallèles. Le système de séparation caméra émission double relié à un microscope inversé à épifluorescence utilise un dichroïque miroir et filtres cubes de diviser et de filtrer les canaux d'émission en deux caméras. Ces caméras captent simultanément deux séquences d'images spatialement identiques mais spécifique fluorophores. Un ordinateur équipé d'un logiciel d'imagerie multi-caméra est utilisée pour fusionner et enregistrer des séquences d'images de chaque canal d'émission.

Figure 2
Figure 2. Un système de fractionnement d'émission de caméra double a été utilisé pour l'imagerie en temps réel simultanée d'une analyse de l'adhérence de la chambre d'écoulement à plaques parallèles. BT-20 cellules marquées avec (1) CD24 anti-humain et anti-IgG de souris AlexaFluor 568 (pseudocolored rouge, d'émission maximum, 603 nm; caméra 1, 620 ± 60 nm) et (2) HECA-452 et anti-IgM de rat AlexaFluor 488 (pseudocolored vert, émission max 519 nm; appareil photo de 2, 535 ± 40 nm) ont été perfusé sur une monocouche CHO-E à une contrainte de cisaillement de paroi = 1 dyne / cm 2. Double caméra fusionné images révèlent l'hétérogénéité au sein d'une population de cellules de roulement et peuvent être utilisés pour caractériser les comportements de roulement sur la base de l'expression de molécules de la surface cellulaire. Barre d'échelle = 100 um. Image acquise avec un objectif 10X.

Figure 3
Figure 3. Une séquence temporelle d'images fusionnées capturées par un système de fractionnement caméra émission double montrant BT-20 cellules exprimant CD24 molécules (rouge pseudocolored) et sialofucosylated (pseudocolored vert) roulant sur ​​une monocouche CHO-E à la contrainte de cisaillement de paroi = 1 dyne / cm 2. caméras maintenu la résolution optique et temporelle pour suivre les caractéristiques de la cellule sur une cellule de tumbling "sens dessus dessous" en roulant sur le substrat réactif dans la direction d'écoulement. Les flèches blanches indiquent une grappe suivis de molécules de la surface cellulaire. signaux d'émission dans chaque canal ont été pseudocolored et fusionnés dans le ilogiciel de forgemagie. Notez que les signaux colocalisés apparaissent en jaune / orange. Les images fixes ont été exportées en temps réel de séquences d'images à des moments indiqués. Barre d'échelle = 10 um. Les images acquises avec un objectif 40X.

Figure 4
Figure 4. Système de séparation double caméra émission révèle colocalisation de CD24 (pseudocolored rouge) et des molécules sialofucosylated (pseudocolored vert) exprimées par un représentant BT-20 cellules de cancer du sein roulant sur ​​une monocouche CHO-E. Expression hétérogène de (A) CD24 et (B) sialofucosylated molécules sur la surface cellulaire est soulignée dans chaque image. (C) La colocalisation de molécules apparaît comme jaune / orange pseudocolored points lorsque les canaux pseudocolored rouges et verts émissions sont fusionnés. Diamètre de cellules est d'environ 10 um. Wi images acquisese Un objectif 40X.

Figure 5
Figure 5.Adjustments les paramètres spatiaux horizontaux, verticaux et de rotation des images capturées dans la caméra 1 et la caméra 2 peuvent améliorer l'alignement spatial dans l'image fusionnée. Alignement correct est essentiel pour représenter avec précision comment les cellules adhèrent et rouler dans le test d'adhésion . (A) Une image fusionnée d'une seule cellule BT-20 est désalignée du fait de positionnement de caméra. (B) l'alignement du territoire est améliorée avec des ajustements de logiciels dans le module SimulPix de Streampix 5. (C) Les ajustements de logiciels supplémentaires à réaliser l'alignement presque parfait. Barre d'échelle = 2 pm. Les images acquises avec un objectif 40X.

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Discussion

Le système de fractionnement des émissions de double caméra a une résolution spatiale, temporelle, et optique nécessaire pour capturer des images de haute qualité dans des applications où la cellule ou le mouvement moléculaire est rapide. Dans la génération des résultats représentatifs, les paramètres du système de fractionnement caméra émission double, y compris les paramètres logiciels et réglages de l'appareil, ont été optimisés pour obtenir une séquence d'image fusionnée dans laquelle roulement et les cellules adhérentes sont spatialement et temporellement aligné. Cette étape d'optimisation est essentielle, comme le désalignement peut entraîner des images qui ne véhiculent pas correctement le phénomène physique à l'étude, par exemple une cellule unique observé à rouler dans les deux canaux vert et rouge peut apparaître comme deux cellules de roulement dans l'espace de travail fusionné. Alignement spatial devrait être atteint dans la configuration du système de fractionnement des émissions de double caméra lorsque les caméras sont physiquement alignées comme décrit dans l'étape 2.4 du protocole. Corrections numériques à l'orientation spatiale des images captrée par les caméras peut être appliqué pour horizontal, vertical, ou décalage de rotation (s) par des paramètres numériques d'alignement dans le logiciel d'imagerie (étape 5.7 et Figure 5).

Alignement temporel entre les images capturées par la caméra 1 et la caméra 2 peut être obtenue en ajustant les paramètres "en direct" des caméras: le temps de l'exposition, l'offset et le gain. Gain et de décalage peut être réglé sans affecter l'alignement temporel des images fusionnées, encore des écarts dans le temps d'exposition définie par l'utilisateur entre les caméras peuvent se traduire par un mauvais alignement. Ainsi, le gain peut être ajusté pour compenser les différences entre les durées d'exposition utilisées pour recueillir des images de chaque caméra. Idéalement, les différences dans le temps d'exposition entre les caméras ne devraient être autorisés lors des réglages de gain semblent compromettre sensiblement la qualité de l'image. En variante, des expériences de titrage d'anticorps peuvent être effectués pour optimiser le marquage cellulaire pour compenser les différences de temps d'exposition requis par chaque caméra (a) en raison des propriétés inhérentes de chaque fluorophore ou (b) en raison de différences dans les niveaux d'expression moléculaires détectés par chaque anticorps / fluorophore. Toutefois, il convient également de noter que des expériences de titrage d'anticorps sont les plus pratiques pour empêcher purge à travers les artefacts (étape 5.4.5) 11.

Bien que le système de fractionnement des émissions de double caméra a été utilisée pour l'image simultanément deux molécules cibles dans les canaux d'émission distincts, d'autres technologies sont en mesure de capturer des images dans de multiples canaux d'émission simultanément. Ces systèmes d'imagerie aller de caméras monochromes à la microscopie confocale, et chacun a des avantages et des inconvénients par rapport à la qualité d'image, la vitesse, et coûtera 12-17. En particulier, les microscopes à balayage laser confocal état-of-the-art qui intègrent les scanners de résonance sont des systèmes d'imagerie multi-spectrale impressionnants capables d'acquérir des images à des centaines de cadres par seconde. Ces systèmes confocaux sont extrêmement puissants,mais leur coût peut limiter le nombre de chercheurs qui ont accès à ces systèmes par les installations de base. En fin de compte, les besoins et les ressources d'investigation de chaque diktat de laboratoire qui système d'imagerie multi-canal le plus approprié.

Les procédés décrits ici expliquent comment obtenir en temps réel de séquences d'images en deux canaux d'émission en utilisant un double système d'émission de l'appareil de fendage et un logiciel d'imagerie. Alignement spatiale et temporelle des images capturées dans deux canaux d'émission par des caméras CCD monochrome similaires est essentielle pour la production en temps réel de l'image fusionnée séquences de haute qualité qui révèlent simultanément plusieurs molécules cibles sur les cellules. Les candidatures pour le système de fractionnement des émissions de double caméra comprennent tout en direct l'analyse cellulaire à deux couleurs qui exige une résolution optique et temporelle exceptionnelle d'un champ de vision, telle que des analyses de flux, la translocation de molécules de surface cellulaire, le remodelage du cytosquelette, le transport vésiculaire, et particules 3D poursuite.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier le Dr Douglas Goetz (Département de chimie et génie biomoléculaire de l'Université de l'Ohio) et le Dr Fabian Benencia (Département des sciences biomédicales, Université de l'Ohio) pour des discussions pertinentes et évaluation des manuscrits. Nous remercions également le Dr Christopher Huppenbauer pour les discussions techniques utiles (W. Nuhsbaum Inc.). Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Science Foundation (CBET-1106118) et les National Institutes of Health (1R15CA161830-01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
BT-20 cells ATCC HTB-19
CHO-E cells Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School)
MEM Thermo Scientific SH30024.01
FBS Thermo Scientific SH30396.03
Penicillin-streptomycin Thermo Scientific SV30010
0.25% Trypsin / 0.1% EDTA Thermo Scientific SV30031.01
DPBS Thermo Scientific SH30028.02
DPBS+ Life Technologies 14080-055
BSA Sigma A9647
HECA-452 monoclonal antibody BD Biosciences 555946
Anti-human CD24 monoclonal antibody BD Biosciences 555426
Anti-rat IgM AlexaFluor 488 Invitrogen A21212
Anti-mouse IgG AlexaFluor 568 Invitrogen A11004
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera Q Imaging EXI-BLU-R-F-M-14-C
Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera Q Imaging RET-EXi-F-M-12-C
DC2 Emission Splitter Photometrics DC2
Inverted Fluorescence Microscope Leica DMI6000 B
Streampix 5 software Norpix

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
  2. Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. Mac-2 binding protein is a novel e-selectin ligand expressed by breast cancer cells. PLoS One. 7, (9), e44529 (2012).
  3. Burdick, M. M., McCaffery, J. M., Kim, Y. S., Bochner, B. S., Colon Konstantopoulos, K. carcinoma cell glycolipids, integrins, and other glycoproteins mediate adhesion to HUVECs under flow. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, (4), C977-C987 (2003).
  4. Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions. J. Biol. Chem. 283, (23), 15816-15824 (2008).
  5. Shirure, V. S., Henson, K. A., Schnaar, R. L., Nimrichter, L., Burdick, M. M. Gangliosides expressed on breast cancer cells are E-selectin ligands. Biochem Biophys. Res. Commun. 406, (3), 423-429 (2011).
  6. Tees, D. F., Goetz, D. J. Leukocyte adhesion: an exquisite balance of hydrodynamic and molecular forces. News Physiol. Sci. 18, 186-190 (2003).
  7. Chang, K. C., Tees, D. F., Hammer, D. A. The state diagram for cell adhesion under flow: leukocyte rolling and firm adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, (21), 11262-11267 (2000).
  8. Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nat. Methods. 2, (12), 910-919 (2005).
  9. Kummitha, C. M., Shirure, V. S., Delgadillo, L. F., Deosarkar, S. P., Tees, D. F., Burdick, M. M., Goetz, D. J. HECA-452 is a non-function blocking antibody for isolated sialyl Lewis x adhesion to endothelial expressed E-selectin under flow conditions. J. Immunol. Methods. 384, (1-2), 43-50 (2012).
  10. Burdick, M. M., Henson, K. A., Delgadillo, L. F., Choi, Y. E., Goetz, D. J., Tees, D. F., Benencia, F. Expression of E-selectin ligands on circulating tumor cells: cross-regulation with cancer stem cell regulatory pathways? Front. Oncol. 2, 103 (2012).
  11. Hoffman, G. E., Le, W. W., Sita, L. V. The Importance of Titrating Antibodies for Immunocytochemical Methods. Current Protocols in Neuroscience. John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  12. Weinberg, S., Lipke, E. A., Tung, L. In vitro electrophysiological mapping of stem cells. Methods Mol. Biol. 660, 215-237 (2010).
  13. Kong, K. V., Leong, W. K., Lim, L. H. Osmium carbonyl clusters containing labile ligands hyperstabilize microtubules. Chem. Res. Toxicol. 22, (6), 1116-1122 (2009).
  14. Vermot, J., Fraser, S. E., Liebling, M. Fast fluorescence microscopy for imaging the dynamics of embryonic development. HFSP J. 2, (3), 143-155 (2008).
  15. Bullen, A., Friedman, R. S., Krummel, M. F. Two-photon imaging of the immune system: a custom technology platform for high-speed, multicolor tissue imaging of immune responses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 334, 1-29 (2009).
  16. Worth, D. C., Parsons, M. Advances in imaging cell-matrix adhesions. J. Cell Sci. 123, 3629-3638 (2010).
  17. Xiao, Z., Visentin, G. P., Dayananda, K. M., Neelamegham, S. Immune complexes formed following the binding of anti-platelet factor 4 (CXCL4) antibodies to CXCL4 stimulate human neutrophil activation and cell adhesion. Blood. 112, (4), 1091-1100 (2008).

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