Samtidig Fange sanntidsbilder i to utslippskanalen med en Dual Camera Emission Splitting System: Søknader til celle adhesjon

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dual kamera utslipps splitting systemer for to-farge fluorescens mikros generere sanntid bildesekvenser med eksepsjonell optisk og tidsmessig oppløsning, et krav i visse levende celle-analyser inkludert parallelle plate flyt kammer vedheft analyser. Når programvaren er ansatt for å slå sammen bilder fra samtidig kjøpt utslipps kanaler, er pseudocolored bildesekvenser produsert.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Carlson, G. E., Martin, E. W., Burdick, M. M. Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion. J. Vis. Exp. (79), e50604, doi:10.3791/50604 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Flerfarge immunfluorescens mikroskopi for å påvise spesifikke molekyler i cellemembranen kan være kombinert med parallelle plate strømningskammeret analyser for å undersøke mekanismer som styrer celleadhesjon under dynamiske strømningsbetingelser. For eksempel, kan kreftceller merket med flere fluoroforene bli perfused over en potensielt reaktive substrat å modellere mekanismer for kreft metastasering. Men flerkanals enkelt kamera systemer og fargekameraer utstillingen mangler i bildet oppkjøpet for sanntids levende celle analyse. For å overvinne disse begrensninger, har vi brukt et to kamera utslipp splitting system for å samtidig fange opp sanntidsbildesekvenser av fluorescensmerkede celler i strømningskammeret. Dual kamera utslipps splitting systemer filter definert bølgelengde varierer i to monokrom CCD-kameraer, og dermed samtidig fange to romlig identiske men fluoroforpar spesifikke bilder. Deretter blir psuedocolored ett-kanal bilder sammen til ettsanntid fusjonert sekvens som kan avsløre flere målmolekyler på celler beveger seg raskt over et område av interesse.

Introduction

Metoder for analyse av molekyler på celleoverflaten, slik som farging, anvende prober som er kjemisk konjugert til fluoroforer, slik at deteksjon av målmolekyler. Live-cell imaging og hydrodynamiske strømningsbaserte celle adhesjon analysene er vanligvis spilt med monokrom CCD-kameraer er laget for å fange fysiologiske prosesser på celle og / eller molekylært nivå 1, 2. Disse kameraene er svært sensitive, levere rask bildefrekvens (større enn 30 bilder per sekund), og har en enestående tidsmessig oppløsning (på grunn av rask bildefrekvens og tider kort eksponering). Imidlertid kan monokrome kameraer bare fange et enkelt utslipp kanal (oppdage en eneste fluoroforen) for å samle inn bilder. Enkelt kamera utslippsknusesystemer kan innarbeides for å fange opp flere utslippskanaler, men ofte redusere synsfeltet og krever samme eksponeringstid for avbilding av alle kanaler. For å fange opp hele fargespekteret fra celler merket med flerfasele fluoroforer, et fargekamera kan brukes som et alternativ. Men fargekameraer er vanligvis ikke i stand til å gi tidsmessig oppløsning ønskelig for live cell imaging i enkelte programmer. En annen bildeenhet er nødvendig for applikasjoner der det er fordelaktig å avbilde levende celler på flere bølgelengder og samtidig beholde en høy tidsoppløsning. En førsteklasses eksperimentell anvendelse er den parallelle platen strømningskammeret adhesjon assay, hvor cellene er perfundert på fysiologisk relevante betingelser over en potensielt reaktiv substrat 1, 3. Celler i strømnings som uttrykker spesifikke celleoverflatemolekyler kan feste seg og rulle på underlaget, for eksempel en celle monolag uttrykker adhesjonsmolekyler eller overflate adsorbert ekstracellulære matriksproteiner 4, 5. Rullende celler kan gjennomgå roterende og translatorisk bevegelse i brøkdeler av et sekund. Molekylære egenskaper for rullende og adherente celler, slik som klynger av celleoverflate-molekyler, har også den potenal gjennomgå aktive omstilling på celleoverflaten. Dermed må bildesystemer gi en eksepsjonell tidsmessig oppløsning (30 bilder per sekund eller mer og "nær null" eksponeringstider) for å generere en bildesekvens som illustrerer steg-for-steg progresjon av celle rullende 6, 7. Dual kamera utslipps splitting systemer er i stand til å møte disse kravene for bildebehandling celler merket med flere fluorophores.

Dual kamera utslipps splitting systemer splittet og filter fluorescens kanaler i to lignende kameraer å samtidig fange to romlig identiske men fluoroforpar spesifikke bilder samtidig som du beholder full synsfelt. Denne teknologien muliggjør direkte sammenligning av bildet som fanges i sanntid i hver kanal, og gjør det mulig for brukeren å raskt bytte mellom kameramodeller med ulike imaging evner. Denne funksjonen er nyttig for å gjøre justeringer i bildefotografering innstillinger i ett kamera som bedre at systemet skal fange oppfluoroforene med ulik intensitet, levetid, og ekstinksjonskoeffisienter åtte. Sammen med bildebehandlingsprogrammer, dual kamera utslipps splitting systemer tillater sanntids opptak av live-cell imaging-analyser på flere bølgelengder og kan forbedre in vitro analyser som bruker fluorescens å studere celle atferd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Installasjon av programvare

  1. Kjøp StreamPix 5 Multi-Camera programvare med SimulPix modul eller annen bildebehandlingsprogrammer i stand til å samle og kombinere bilder tatt av svart-hvitt CCD-kameraer.
  2. Minimumskrav for StreamPix 5 inkluderer: En PC som er utstyrt med Core 2 Duo med 2,4 GHz eller bedre med 2 GB RAM eller høyere. En støttet IEEE digitalt eller analogt kamera og kompatibel ramme fanget. Windows XP/7/Vista 32 eller 64 bit. En skjerm som støtter oppløsningen 1024 x 768 eller høyere. En grafisk adapter med god 2D-ytelse (OCU uttrykke 16x eller bedre anbefales) og 7200 RPM harddisk for opptak med RAID-O-konfigurasjon.

2. Installasjon av Dual Camera System Kan Two Color Samtidig Sanntids Imaging

  1. Koble DC2 Fotometri utslipp splitter, eller tilsvarende to kamera utslipp splitting enheten, til mikroskop ved å skyve DC2 C-mount adapter inn i video-porten på microscope slik at kassen til dichroic på enheten er tilgjengelig.
  2. Sett to monokrom CCD-kameraer inn kvinnelige C-mount en og kvinnelige C-mount to. Identiske kameraer er å foretrekke. Lignende kameraer kan brukes, men kompatibilitet er avhengig av intern maskinvare, viktigst CCD bildesensor.
  3. Bruk bildebehandlingsprogrammer for å vise bilder fra begge kameraene. Følgende trinn (2.3.1 - 2.3.4) gjelder StreamPix 5 med SimulPix modul og må tilpasses for andre flerkamerabildebehandlingsprogrammer.
    1. Åpen StreamPix 5 og velg "arbeidsområdet" på oppgave bånd.
    2. Open "arbeidsområde manager" som ligger helt til høyre på skjermen og velg "ny arbeidsplass".
    3. Etter å navngi et kamera, følger programvaren ber for å velge en grabben fra en forhåndsutfylt liste. Velg grabben matchende kameramodell og gjenta for den andre kamera arbeidsområdet. For det fusjonerte arbeidsområdet, gjentar enda en gang, men "alle kameraer er i bruk" feil message vil vises. Denne meldingen er normal.
    4. Når det fusjonerte arbeidsområdet er lastet, tilordne kameraer fra arbeidsområdet en og arbeidsområde 2 til det fusjonerte arbeidsområdet i docking panel plassert på høyre side av visningsskjermen.
  4. Rett kameraer i to kamera utslipp splitting system.
    1. Rett kameraer i lyse felt eller fase kontrast med kalibrerings rutenett gitt av produsenten å bruke en PlanApo 40X objektiv (eller høyere).
    2. Send lys til mikroskopet okularene, plasserer metallic-belagt kalibrering rutenett som ble gitt av produsenten på mikroskopet scenen, og Square rutenettet på mikroskopet scenen.
    3. Ta med rutenettet i fokus.
    4. Fortrenge, men ikke fjern, dichroic boliger å justere kameraet 1 (bypass-kamera). Vis rutenettet uten binning og uten AutoScaling. Fokuser bildet ved hjelp av fokusjustering hjulet på C-mount port en.
    5. Skyv dichroic boliger inn den doble channel oppkjøp enhet fullt, slik at bildet er delt av dichroic til begge kameraene.
    6. Løsne de tre 5/64 "settskruer og roter det andre kameraet på den kvinnelige C-mount to til orientering av rutenettet er identisk i begge bildene. Bruke fokusjustering hjulet på C-mount port 2, ta bildet fra kameraet 2 i fokus.
    7. Ferdigstille justeringen ved hjelp av det sammensatte bildet i det fusjonerte arbeidsområdet av bildebehandlingsprogrammer. Dette gjør det mulig å se et sanntidsPseudo overlapping av de to bilder av kalibreringsnett. Juster de kombinerte bildeposisjonene bare ved hjelp av R / L knotten på høyre side av DC2. Juster denne knotten til høyre / venstre vertikale grensen av bildene er nøyaktig justert.
    8. Bruk U / D knott for å justere opp / ned justering av andre bildet til de horisontale risten er riktig justert.
    9. Dersom det under opp / ned justering en svak kamera rotasjon oppstår, korrigere dette problemet ved å løsne de tre 5/64 "tommers skruews for kamera 2, og drei til det viste bildet er riktig justert.

Tre. Utarbeidelse av kreftceller for Parallel Plate Flow Chamber Adhesion analysen

  1. Kultur BT-20 brystkreftceller i minimum essensielt medium (MEM) supplert for å fullmedium med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin ved 37 ° C, og 5,0% CO 2 som tidligere beskrevet 2..
  2. Slaktekreftceller med en fortynnet trypsin behandling og telle celler med en hemocytometer.
  3. Vask og suspendere cellene i 10 7 celler / ml i 0,1% albumin fra bovin serum (BSA) i DPBS med kalsium og magnesium (DPBS +).
  4. Fortynn primære antistoffer, renset mus anti-human CD24 og renset rotte HECA-452 (anti-sialofucosylated antigener), til et på forhånd bestemt optimal konsentrasjon på 0,1% BSA DPBS +. Inkuber cellene i 30 min 9, 10.
  5. Sentrifuger cellene ved 1200 rpm for å oppnå en cellepellet. Aspirangere primære antistoff, og vaske cellene to ganger med 0,1% BSA DBPS +.
  6. Fortynn sekundære antistoffer, geit anti-mus IgG AlexaFluor 568 (utsendelse maks, 603 nm), og geite-anti-rotte-IgM AlexaFluor 488 (utsendelse maks, 519 nm), til en på forhånd bestemt optimal konsentrasjon på 0,1% BSA DPBS +. Inkuber cellene i 30 min.
  7. Vask cellene to ganger og suspendere på 0,1% BSA DPBS + på 10 6 celler / ml i 0,1% BSA DPBS +.

4. Utarbeidelse av reaktiv substrat for Parallel Plate Flow Chamber Adhesion analysen

  1. Koble to separate lengder av rør til innløps-og utløpsportene til parallell plate flyt kammer som passer inni en 35 mm vev kultur parabolen. En slange kan kobles til reservoaret av merkede celler suspendert i 0,1% BSA DPBS + og den andre til sprøytepumpen, som vil trekke fluid ved en bestemt strømningshastighet.
  2. Koble en vakuumledning til strømningskammeret 1..
  3. Plasser flyten salen over 35 mm vev kultur dish inneholder en monolayer av kinesisk hamster ovarieceller uttrykker E-selectin (CHO-E). CHO-E-celler ble dyrket i MEM komplett medium ved 37 ° C, og 5,0% CO 2 2.
  4. Juster strømningskammeret og / eller i strømningskammeret pakning for å sikre en tilstrekkelig vakuumpakningen 1.
  5. Uttak av fluid fra reservoaret, å overvåke strømningskammermontasjen for riktig tetning, og uten tegn til luftbobledannelse 1..
  6. Plasser flyt kammer montering på mikroskop (Leica DMI 6000B) en.

5. To-farge Image Acquisition

  1. Strøm en Leica EL-6000 kompakt lyskilde, eller lignende innretning, for å generere høy intensitet lys og par det inn i en lys guide. Bruk en omvendt mikroskop for å passere dette lyset gjennom en kombinasjon filter kube, dvs. G / R (grønn / rød) filter kube, for å opphisse fluoroforene av en ønsket farge / intensitet.
  2. Sørg dichroic boliger er i korrekt stilling (deprimert) ogikke er i forbikoblingsmodus.
  3. Operer mikroskop i fluorescens-modus, og velg riktig fluorescens filter kube (grønn / rød).
  4. Bestem eksponeringstid og gevinst i kamera 1 (rød, 620 ± 60 nm) og kamera 2 (grønn, 535 ± 40 nm).
    1. Tråkk dichroic å få bilder i både de røde og grønne utslippskanaler. Bruk en flyt kammer analysen med celler merket med rød fluoroforen bare, og få et bilde i den røde kanalen ved å justere eksponeringstiden for kamera 1 i "live-innstillinger" i bildebehandlingsprogrammer.
    2. Matche eksponeringstid på kameraet to til eksponeringstid på kameraet en. Hvis et bilde blir observert i den grønne kanalen, blø-gjennom gjenstander er til stede, og eksponeringstiden i begge kameraer som må reduseres.
    3. Holde eksponeringstiden tilsvarende i kamera 1 og kamera 2, redusere eksponeringstiden til bleed-through artefakt ikke lenger er synlig i den grønne kanalen. Juster forsterkningen av kamera en å forbedre bilde visibility i den røde kanalen hvis nødvendig.
    4. Gjenta trinn 5.4.1 - 5.4.3 med celler som er merket med den grønne fluorophore bare, men definere eksponeringstiden med kamera 2 til bildet celler i den grønne kanalen uten blø-gjennom artefakter i den røde kanalen innsamlet av kamera en.
    5. Retitrate antistoffer hvis blø-gjennom gjenstander ikke kan fjernes 11, eller hvis tider med kamera 1 og kamera to eksponerings er vesentlig forskjellig slik at fusjonerte bilder kan være timelig forskjøvet.
  5. Bruk bildebehandlingsprogrammer for å vise bilder samtidig tatt fra to monokrom CCD-kameraer i flyten kammeret eksperiment.
  6. Slå sammen bilder samlet inn fra begge kameraene bruker SimulPix modulen av Streampix 5 eller en alternativ programvarepakke.
  7. Bruke digitale korreksjons justeringer i SimulPix eller alternativ programvare til romlig justere sammenslåtte bilder, om nødvendig. Bilder kan korrigeres med SimulPix modul for horisontal, vertikal, og rotasjons justeringer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En parallell plate gjennomstrømningskammeret adhesjon assay ble anvendt for å demonstrere en to kamera utslipp splitting system som samtidig tatt sanntidsbildesekvenser i to utslippskanaler (figur 1). De to kamera utslipps splitting system detektert BT-20-celler som ble fluorescensmerkede med anti-human CD24-og HECA-452 (detektering sialofucosylated antigener) monoklonale antistoffer og egnede sekundære antistoffer (figur 2). Noen rullende celler viste røde signaler (CD24) ennå ikke målbare grønne signaler (HECA-452), andre tall grønne signaler og ikke målbare røde signaler, og ytterligere andre celler som vises både røde og grønne signaler (fig. 2). Sammenslåtte utslippskanaler avslørte distribusjon og colocalization av CD24 og sialofucosylated molekyler på overflaten av BT-20 celler rulle på og forholde seg til CHO-E monolayers (figur 3 og 4). Den doble kamera utslipp splitille system som opprinnelig hadde en liten bildejusteringsfeil på grunn av justering av kameraene, men denne feilen ble rettet opp med digitale justeringer (figur 5) ved hjelp av SimulPix modulen av StreamPix fem. Til sammen har de to kamera utslipps splitting system romlige, tidsmessige, og optisk oppløsning for å avdekke cellulære og molekylære egenskaper i applikasjoner slik som strømningskammeret adhesjons-analyser, hvori cellene beveger seg hurtig gjennom synsfeltet.

Figur 1
Figur 1. Illustrasjon av en to kamera utslipps splitting system for å skaffe bilder i en parallell plate strømningskammeret adhesjon assay. Sprøytepumpe blir brukt til å gjennomstrømme celler over substratet i det parallelle platestrømningskammeret. De to kamera utslipps splitting system koblet til en invertert mikroskop epifluorescence benytter en dikroisk mirror og filter kuber å splitte og filtrere utslippskanaler i to kameraer. Disse kameraene samtidig fange to romlig identiske men fluoroforpar spesifikke bildesekvenser. En datamaskin utstyrt med multi-kamera avbildningsprogramvare brukes til å flette og ta bildesekvenser fra den enkelte utslippskanal.

Fig. 2
Figur 2. En to kamera utslipps splitting system ble anvendt for sanntids samtidige avbildning av en parallell plate strømningskammeret adhesjon assay. BT-20 celler som er merket med (1) anti-human CD24-og anti-mus IgG AlexaFluor 568 (pseudocolored rødt, emisjon max, 603 nm; kameraet 1, 620 ± 60 nm) og (2) HECA-452 og anti-rotte-IgM AlexaFluor 488 (pseudocolored grønt, utslipps maks 519 nm; kamera 2, 535 ± 40 nm) ble perfundert over en CHO-E monolag på veggen skjærspenning = en dyne / cm 2. Dual kamera fusjonerte jegmages viser heterogenitet innenfor en rullende cellepopulasjon, og kan brukes til å karakterisere valse oppførsel basert på ekspresjonen av celleoverflatemolekyler. Scale bar = 100 mikrometer. Bilde kjøpt med en 10X objektiv.

Figur 3
Figur 3. En tidssekvens av sammenslåtte bilder tatt av en to kamera utslipp splitting system som viser BT-20 celler som uttrykker CD24 (pseudocolored røde) og sialofucosylated molekyler (pseudocolored grønn) rullende på en CHO-E monolayer på veggen skjærspenning = en dyne / cm 2. Kameraer opprettholdt den optiske og tidsmessig oppløsning for å spore cellefunksjoner på en celle tumbling "ende-over-ende" slik det rullet på den reaktive substrat i strømningsretningen. Hvite piler indikerer en sporet klynge av celleoverflatemolekyler. Utslipps signaler i hver kanal ble pseudocolored og fusjonerte i den jegMaging programvare. Merk at colocalized signaler vises gul / oransje. Stillbilder ble eksportert fra sanntids bildesekvenser på tidspunkter vist. Scale bar = 10 mikrometer. Bilder ervervet med en 40X objektiv.

Figur 4
Figur 4. Dual kamera utslipp splitting system avslører colocalization av CD24 (pseudocolored rød) og sialofucosylated molekyler (pseudocolored grønn) uttrykt av en representant BT-20 brystkreft celle rullende på en CHO-E monolayer. Heterogene uttrykk for (A) CD24 og (B) sialofucosylated molekyler på celleoverflaten er vektlagt i hvert bilde. (C) colocalization av molekyler ser ut som gul / orange pseudocolored flekker når røde og grønne pseudocolored utslipps kanaler slås sammen. Cell diameter er omtrent 10 mm. Bilder ervervet with en 40X objektiv.

Figur 5
Figur 5.Adjustments til de horisontale, vertikale, og rotasjons romlige innstillinger av bilder tatt i kameraet en og kamera 2 kan forbedre den romlige justering i det sammenslåtte bildet. Riktig justering er viktig å nøyaktig skildre hvordan cellene er holde og ruller i vedheft analysen . (A) Et fusjonert bilde av et enkelt BT-20 celler er forskjøvet på grunn av kameraposisjonerings. (B) Spatial innretting er forbedret med programvare justeringer i SimulPix modulen av StreamPix fem. (C) Ytterligere programvarejusteringer oppnå tilnærmet perfekt justering. Scale bar = 2 mikrometer. Bilder ervervet med en 40X objektiv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den doble kamera utslipp splitting systemet har romlig, tidsmessig, og optisk oppløsning som trengs for å ta bilder av høy kvalitet i applikasjoner der celle eller molekylær bevegelse er rask. I generere representative resultater, parametrene i to kamera utslipp splitting systemet, inkludert programvareinnstillinger og kamerainnstillinger, ble optimalisert for å få en sammenslått bildesekvens der rullende og heftende celler var romlig og tidsmessig justert. Dette optimalisering trinnet er kritisk, som forskyvning kan resultere i bilder som ikke skal formidle det fysiske fenomenet som undersøkes, for eksempel en enkelt celle observert å rulle i både de grønne og røde kanaler kan vises som to rullende celler i det fusjonerte arbeidsområdet. Spatial justering bør oppnås i oppsettet av to kamera utslipp splitting systemet når kameraene er fysisk innrettet slik det er beskrevet i trinn 2.4 av protokollen. Digitale korreksjoner til den romlige justering av bilder capttig av kameraene kan brukes for horisontal, vertikal, eller rotasjons offset (e) gjennom digitale justeringsinnstillingene i bildebehandlingsprogrammer (trinn 5.7 og figur 5).

Temporal justering mellom bilder tatt av kamera 1 og kamera 2 kan oppnås ved å justere "live innstillinger" av kameraene: eksponeringstid, offset og gain. Gevinst og offset kan justeres uten å påvirke den time justering av de fusjonerte bilder, men avvik i brukerdefinerte eksponeringstid mellom kameraene kan resultere i feiloppretting. Således forsterkning kan justeres for å kompensere for forskjeller mellom eksponeringstider som benyttes til å samle inn bilder i hvert kamera. Ideelt sett forskjeller i eksponeringstiden mellom kameraene bør bare tillatt når gain justeringer vises til betydelig kompromiss bildekvalitet. Alternativt kan antistoff-titrering eksperimenter kan utføres for å optimalisere cellemerking for å kompensere for forskjeller i eksponeringstiden som kreves av hvert kamera (a) på grunn av iboende egenskaper i hver fluorofor eller (b) på grunn av forskjeller i molekyl ekspresjonsnivåer som registreres av hver antistoff / fluoroforen. Imidlertid bør det også nevnes at antistoff titrering eksperimenter er beste praksis for å hindre blø-gjennom artefakter (trinn 5.4.5) 11.

Selv om to kamera utslipps splitting systemet ble brukt til å samtidig image to målmolekyler i separate utslippskanaler, alternative teknologier er i stand til samtidig å ta bilder i flere utslippskanaler. Disse bildesystemer spenner fra enkle fargekameraer til confocal mikroskoper, og hver har fordeler og ulemper i forhold til bildekvalitet, hastighet og koster 12-17. Spesielt state-of-the-art laser scanning confocal mikroskoper som innlemme resonant skannere er imponerende multi-spektral bildesystemer som kan skaffe bilder på hundrevis av bilder per sekund. Disse confocal systemer er ekstremt kraftig,men deres kostnader kan begrense antallet forskere som har tilgang til disse systemene gjennom kjernefasiliteter. Til syvende og sist, utprøvings behov og ressurser til hver lab diktere som flerkanals imaging system er mest hensiktsmessig.

Metodene som er beskrevet her forklare hvordan du får tak i sanntid bildesekvenser i to utslippskanalen med en to kamera utslipp splitting system-og bildebehandling. Romlig og tidsmessig justering av bilder tatt i to utslippskanaler av lignende sort-hvitt CCD-kameraer er viktig for produksjon av høy kvalitet i sanntid fusjonert bildesekvenser som samtidig avslører flere mål molekyler på cellene. Søknader om to kamera utslipp splitting systemet inkluderer alle to-farge levende celle analyse som krever eksepsjonell optisk og tidsmessig oppløsning av et komplett synsfelt, slik som strømningsanalyser, translokasjon av celleoverflatemolekyler, cytoskeletal ombygging, vesikulært transport, og 3D-partikkel sporing.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgements

Forfatterne ønsker å takke dr. Douglas Goetz (Institutt for kjemisk og biomolekylære Engineering, Ohio University) og Dr. Fabian Benencia (Department of Biomedical Sciences, Ohio University) for innsiktsfulle diskusjoner og manuskript vurdering. Vi vil også takke Dr. Christopher Huppenbauer for nyttige tekniske diskusjoner (W. Nuhsbaum Inc.). Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Science Foundation (cbet-1106118) og National Institutes of Health (1R15CA161830-01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
BT-20 cells ATCC HTB-19
CHO-E cells Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School)
MEM Thermo Scientific SH30024.01
FBS Thermo Scientific SH30396.03
Penicillin-streptomycin Thermo Scientific SV30010
0.25% Trypsin / 0.1% EDTA Thermo Scientific SV30031.01
DPBS Thermo Scientific SH30028.02
DPBS+ Life Technologies 14080-055
BSA Sigma A9647
HECA-452 monoclonal antibody BD Biosciences 555946
Anti-human CD24 monoclonal antibody BD Biosciences 555426
Anti-rat IgM AlexaFluor 488 Invitrogen A21212
Anti-mouse IgG AlexaFluor 568 Invitrogen A11004
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera Q Imaging EXI-BLU-R-F-M-14-C
Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera Q Imaging RET-EXi-F-M-12-C
DC2 Emission Splitter Photometrics DC2
Inverted Fluorescence Microscope Leica DMI6000 B
Streampix 5 software Norpix

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
  2. Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. Mac-2 binding protein is a novel e-selectin ligand expressed by breast cancer cells. PLoS One. 7, (9), e44529 (2012).
  3. Burdick, M. M., McCaffery, J. M., Kim, Y. S., Bochner, B. S., Colon Konstantopoulos, K. carcinoma cell glycolipids, integrins, and other glycoproteins mediate adhesion to HUVECs under flow. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, (4), C977-C987 (2003).
  4. Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions. J. Biol. Chem. 283, (23), 15816-15824 (2008).
  5. Shirure, V. S., Henson, K. A., Schnaar, R. L., Nimrichter, L., Burdick, M. M. Gangliosides expressed on breast cancer cells are E-selectin ligands. Biochem Biophys. Res. Commun. 406, (3), 423-429 (2011).
  6. Tees, D. F., Goetz, D. J. Leukocyte adhesion: an exquisite balance of hydrodynamic and molecular forces. News Physiol. Sci. 18, 186-190 (2003).
  7. Chang, K. C., Tees, D. F., Hammer, D. A. The state diagram for cell adhesion under flow: leukocyte rolling and firm adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, (21), 11262-11267 (2000).
  8. Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nat. Methods. 2, (12), 910-919 (2005).
  9. Kummitha, C. M., Shirure, V. S., Delgadillo, L. F., Deosarkar, S. P., Tees, D. F., Burdick, M. M., Goetz, D. J. HECA-452 is a non-function blocking antibody for isolated sialyl Lewis x adhesion to endothelial expressed E-selectin under flow conditions. J. Immunol. Methods. 384, (1-2), 43-50 (2012).
  10. Burdick, M. M., Henson, K. A., Delgadillo, L. F., Choi, Y. E., Goetz, D. J., Tees, D. F., Benencia, F. Expression of E-selectin ligands on circulating tumor cells: cross-regulation with cancer stem cell regulatory pathways? Front. Oncol. 2, 103 (2012).
  11. Hoffman, G. E., Le, W. W., Sita, L. V. The Importance of Titrating Antibodies for Immunocytochemical Methods. Current Protocols in Neuroscience. John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  12. Weinberg, S., Lipke, E. A., Tung, L. In vitro electrophysiological mapping of stem cells. Methods Mol. Biol. 660, 215-237 (2010).
  13. Kong, K. V., Leong, W. K., Lim, L. H. Osmium carbonyl clusters containing labile ligands hyperstabilize microtubules. Chem. Res. Toxicol. 22, (6), 1116-1122 (2009).
  14. Vermot, J., Fraser, S. E., Liebling, M. Fast fluorescence microscopy for imaging the dynamics of embryonic development. HFSP J. 2, (3), 143-155 (2008).
  15. Bullen, A., Friedman, R. S., Krummel, M. F. Two-photon imaging of the immune system: a custom technology platform for high-speed, multicolor tissue imaging of immune responses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 334, 1-29 (2009).
  16. Worth, D. C., Parsons, M. Advances in imaging cell-matrix adhesions. J. Cell Sci. 123, 3629-3638 (2010).
  17. Xiao, Z., Visentin, G. P., Dayananda, K. M., Neelamegham, S. Immune complexes formed following the binding of anti-platelet factor 4 (CXCL4) antibodies to CXCL4 stimulate human neutrophil activation and cell adhesion. Blood. 112, (4), 1091-1100 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics