자연 무 세포 창자 매트릭스의 생산을위한 탈세 포화 방법론

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Bioengineering
 

Summary

이 문서는 쥐의 소장에서 무 세포 매트릭스의 제조 방법을 설명합니다. 장 비계의 유도는 세포 생물학 및 약물 검사 줄기, 조직 공학의 미래 응용 프로그램에 중요합니다.

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Maghsoudlou, P., Totonelli, G., Loukogeorgakis, S. P., Eaton, S., De Coppi, P. A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix. J. Vis. Exp. (80), e50658, doi:10.3791/50658 (2013).

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Abstract

성공적인 조직 공학은 시험 관내 또는 생체 내에서 적절한 세포와 지지체의 조합을 포함한다. 발판은, 합성 천연 유래 나 조직 / 기관에서 파생 될 수 있습니다. 후자는 탈세 포화라는 기술을 사용하여 얻을 수있다. 탈세 포화는 물리적, 화학적, 및 효소 적 방법의 조합을 포함 할 수있다. 이 기술의 목적은 본래 조직의 매크로 및 마이크로 구조를 유지하면서 모든 휴대 흔적을 제거하는 것이다.

장 조직 공학은 지금까지 네이티브 기관의 복잡한 구조를 복제하지 않는 비교적 간단한 발판을 사용하고 있습니다. 이 논문의 초점은 쥐의 소장을위한 효율적인 탈세 포화 기술을 설명하는 것입니다. 소장의 분리 관 연결의 유지를 확보 할 수 있도록 설명한다. 간편하게 조절할 세포를 제거하는 화학 물질과 효소 솔루션의 조합발판의 내강 측면에서 융모-토굴 축을 유지 세인트도 제시된다. 마지막으로, 해당 특성에 대한 생산 비계의 평가는 설명합니다.

Introduction

조직 공학 (TE)은 면역 억제 및 장기 부족 문제를 우회, 장기 이식에 대한 치료 대안을 제공합니다. TE는 최근 같은 성인 3,4 어린이 5 모두 방광 1, 요도 2 및 기관 등 장기의 교체로, 병원에서 성공적으로 응용 프로그램을 가지고 있습니다.

조직 공학 기관을 구축하는 것은 적절한 세포와​​ 지지체의 조합을 필요로한다. 발판은 자연 유래 (예를 들면 콜라겐)을 사용하여 제조 및 합성 (예를 들어, 폴리-L-글리콜 산, PLGA) 할 수있는 물질, 또는 네이티브 장기와 조직의 탈세 포화에 의해 얻을 수. 장 TE를 위해 지금까지 사용 된 발판은 주로 6-13 (폴리-L-글리콜 산, 폴리 락트산) decellularized (소장 점막하 층) 또는 합성 하나 있었다. 이러한 생체 재료는, 매크로와 마이크로 아키텍처 모두에서 매우 간단한다조직 공학 소장은 임상 적으로 번역해야하는 경우 적합하지 않을 수 있습니다. 소장에 대한 최적의 생체 재료가 함께 지원하기 위해 내강 측의 호스트의 혈액 공급, 장 벽의 레이어를 반영하기 위해 서로 다른 특성을 가진 계층 관 벽과 융모 - 토굴 축에 연결 될 수있는 선천성 혈관 트리가 있어야합니다 상피 줄기 세포로 다시 채우기.

탈세 포화는 원래 건축 (14)를 유지하면서 전체 장기에서 세포를 제거하여 발판을 생산하는 새로운 방법입니다. 이것은 그들이 기관의 구조를 복제뿐만 아니라, 세포 외 기질 (ECM) 그 원조 세포 증식과 분화에 내장 된 화학 신호를 포함하지 만 이후 이미 비계 기존하는 것이 바람직하다. 2008 년 사체 기관은 환자 자신의 세포에 접종, 14 decellularized, 그리고 젊은 사람의 주요 좌측 기관지를 대체하기 위해 이식 된 (15), (16, 17) 간, 및 폐 18-20 대 decellularized 비계의 생산을보고했다.

또한 소장 decellularized 발판 (21)을 생성하기 위해 동일한 방법을 채택했다. 본원에 기술 된 방법의 목적은 혈액 공급로서 일본어의 조직뿐만 아니라 장 내강에서 융모-토굴 축의 미세한 구조의 거시적 특성을 유지 decellularized 장내 행렬을 생성하는 것이다. 우리는이 방법론은 궁극적 탈세 포화의 효율을 향상시키는 다른 기관에 채택 될 수 믿는다.

Protocol

1. 쥐 소장의 분리

  1. 1 %의 항생제 / 항진균제 (시그마, UK) (PBS / AA)와 인산염 완충 생리 식염수 (시그마, UK)의 1 L의 솔루션을 준비합니다. 두 개의 튜브 연동 펌프 (Masterflex의 L / S 가변 속도)를 장착한다. 또 다른 15 분 동안 PBS / AA 다음에 최대 속도에서 15 분의 연동 펌프의 튜브를 통해 70 % 에탄올 (EtOH로)를 실행합니다.
  2. CO 2 흡입 (영국, 동물 (과학적인 절차) 법 1986에 따라 본사의 지침) 지역 동물 지침 및 승인에 따라 자궁 경부 전위에 의해 약 2백50-3백50g 무게 성인 흰쥐를 안락사.
  3. 사용하기 전에 수술 도구를 압력솥. 스프레이 및 EtOH로 70 %를 사용하여 동물의 복부를 닦아냅니다.
  4. 명확한 수술 부위를 확인하기 위해 복부에 xifo 치골 laparotomic 절개를 수행합니다.
  5. 70 % EtOH로 뿌려 종이 타월에 동물의 오른쪽에있는 작은 창자 절개. 탁세포 외 기질 (ECM)의 조직과 변성의 탈수를 방지하기 위해 지속적으로 PBS / AA로 장을 적시는 전자 의료.
  6. 소장으로 대동맥에서 90 ° 각도에서 발생하는 상 장간막 동맥 (SMA)를 찾습니다. 대동맥에서 SMA를 입력하고 신속하게 용기의 벽을 찢어지지 않도록 바늘을 철회 27 G 정맥을 사용합니다. SMA에 캐 뉼러의 플라스틱 튜브를 진행하고 봉합 (Vicryl 5 / 0)를 사용하여 고정합니다.
  7. PBS / AA 1 ㎖를 주입하여 삽관을 확인합니다. 정맥을 해제 할 수 있도록 SMA에 대동맥 근위부와 원위부를 절개 봄 가위를 사용합니다.
  8. 대장을 해부 할 때 대변의 누출을 방지하기 위해, 하나 (실크 5 / 0) 봉합 ileocaecal 접합의 기단부에 매듭 및 S 상 결장의 말단부 하나를 놓습니다. 그런 다음 두 매듭 사이의 터미널 회장과 결장을 잘라 대장을 제거합니다.
  9. jejuno 십이지장 접합에 소장을 잘라ND는 복부와 함께있을 수있는 결합 조직의 연결에서 장을 무료로 제공됩니다.
  10. PBS / AA와 페트리 접시에 소장을 전송합니다. 플라스틱 파스퇴르 피펫 (LSL 실험실 소모품)과 소장의 근위 부분을 Cannulate 봉합 제자리에 고정합니다. 그것은 60 ML의 주사기의 루어 코리아 (BD Plastipak)을 맞는 있도록 피펫을 잘라. 장 루멘 배설물과 이물질을 제거하는 PBS / AA 60 ㎖로 2 배 세척.

2. 탈세 포화 방법론

  1. 세 방향 꼭지에 혈관 정맥을 연결합니다. 이것은, 취급 용이성 혈관 나무에 긴장을 최소화하고 튜브에서 거품을 제거 할 수 있습니다.
  2. 0.6 ㎖ / 시간의 Masterflex의 L / S 가변 속도 롤러 펌프를 통해 탈 이온수 (저항 18.2 MΩ / cm)를 실행 시작합니다. 기포 전에 장 루멘 꼭지에 연결하는 튜브 내에서 존재하지 않는 확인하십시오. 일부 거품이 단계의 루멘 내에서 존재할 수있다1.9, 탈세 포화 과정을 손상시킬 수있다. 펌프의 속도를 변화와 말단부에서 거품 출구을 보장하기 위해 신중하게 집게로 조직을 처리합니다. 높은 속도는 혈관 나무가 손상 될 수 있기 때문에이 과정이 완료 될 때까지 혈관 정맥을 연결하지 마십시오.
  3. 탈세 포화의 다음 단계는 4 ℃에서 수행되기 때문에, 추운 방에 장치를 이동 낮은 온도는 조직의 분해를 최소화하면서 세포의 제거를 할 수 있습니다. 넘치는 솔루션를 수집 용기에 배양 접시를 놓습니다. 0.6 ㎖ / 시간에서 24 시간 동안 장 루멘과 탈 이온수로 혈관 트리 (저항 18.2 MΩ / cm)를 모두 Perfuse. 첫 번째 시간은 모두가 제대로 연결되도록 정기적으로 장치를 확인, 누출을 최소화하고 더 거품이 대장 내에 존재하지 않습니다.
  4. 탈 이온수와 치료 24 시간 후, 단계는 다음의 나머지와 냉장실 탈세 포화 외부 장치를 이동실온 (RT)에서 실시했다.
  5. 탈 이온수에서 4 % 용액 300 ㎖를 제조 소듐 데 옥시 콜레이트 (시그마, UK)를 단다. 이 구두 및 눈 자극성 등의 흡입 후드 나트륨 데 옥시 콜레이트의 무게. 용액이 깨끗해질 때까지 소용돌이를 사용하여 섞는다. 이 솔루션은 최대 1 달 동안 4 ° C에서 유지 될 수있다.
  6. 모든 거품을 제거하고 0.6 4 시간에 대한 ㎖ / 시간에 perfuse, 연결을 확인, 나트륨 데 옥시 콜레이트에 탈 솔루션을 변경합니다.
  7. 나트륨 데 옥시 콜레이트 및 DNA 분해 효소-I 사이의 상호 작용을 피하기 위해 30 분 동안 PBS / AA와 소듐 데 옥시 콜레이트 단계 세척을 다음.
  8. 디옥시리보 뉴 클레아 제-I (DNA 분해 효소-I, 시그마)를 달아 1 M 염화 나트륨, 산도 7.4에서 2,000 구 용액 250 ㎖를 준비합니다. 용액이 깨끗해질 때까지 소용돌이를 사용하여 섞는다. 이 용액을 사용 직전에 제조 될 수 있어야하고 저장 될 수 없다.
  9. 0.6 ㎖ / hr의 속도로 실온에서 3 시간 동안 DNA 분해 효소-I와 Perfuse.
  10. DNA 분해 효소-I의 단계에 따라, 전송조직 문화 후드에 비계와 접시와 악기를 변경합니다. 그것은 무균 기술을 사용하는 것이 좋습니다.
  11. 탈세 포화 솔루션의 모든 흔적을 제거 할 때까지 30 분 동안 PBS / AA로 세척. 새로운 배양 접시에 발판을 놓고 UV 가교제 (Spectroline, 미국)에 전송할 수 있습니다. 두 멸균 사이클을 실행합니다. 3 일마다 5 % PBS / AA에 저장하고 솔루션을 변경합니다.

Representative Results

성공 탈세 포화 (그림 1)에, 비계는 기본 대장의 유사한 매크로 모양이해야하지만, 반투명 벽 (그림 2A)로. 매크로 아키텍처의 보존은 또한 혈관 트리의 개통에 의해 분명해야한다. 염료는 SMA의 정맥을 통해 주입 할 때, 발판에 걸쳐 균등하게 분배하고 모세관 트리 (그림 2B)에 도달한다. 비계는 핵 및 세포질 물질, DNA 정량 키트와 간단한 조직 학적 분석을 사용하여 평가 될 수있는 일이 없어야합니다. 헤 마톡 실린 및 에오신 염색 (H & E)은 소장 층 (그림 3A)를 유지하는 동안 핵 및 세포질 물질의 부재를 증명해야합니다. 특히, 내강 측 융모 및 소낭의 정비는 주사 전자 현미경 (도 4) 다음 명백 할 것이다.콜라겐, 엘라스틴 및 글리코 사 미노 글리 칸 등의 세포 외 기질 성분의 보존도 예상해야한다. 예를 들어, 비계 (그림 3B)에있는 메이슨의 트리 크롬 염색 디스플레이는 그대로 결합 조직.

그림 1
그림 1. . 탈세 포화 절차의 실험 계획 타임 라인, PBS / AA : 항생제 항진균, NaDeoxy와 인산염 완충 생리 식염수 : 나트륨 데 옥시 콜레이트, RT : 실내 온도, DNA 분해 효소-I : 디옥시리보 뉴 클레아 제-I. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 2
그림 2. 비계 macroscopiC 특성. 성공 탈세 포화 된 쥐의 소장의 육안 모양 (A). 로소 개양귀비 빛의 SMA를 통해 염료의 주입은 그대로 혈관 네트워크 (B)를 사용하는 방법을 보여줍니다; SMA : 장간막 동맥은 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 3
그림 3. . 조직학 H & E (A)와 MT (B) 염색은 결합 조직 구조의 보존과 세포 물질의 부재를 나타내는, H & E : 헤 마톡 실린 및 에오신, MT : 메이슨의 트리 크롬. 스케일 바 :. 100 μm의 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 . 그림 4
그림 4. . 전자 현미경 스캐닝 전자 현미경 발판 루멘의 보존 융모-토굴 아키텍처를 나타냅니다 스케일 바 :. 100 μm의는 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

Discussion

이 실험 설정에서 가장 어려운 단계는 SMA의 삽관과 스타일 및 멸균의 유지를 수반한다. 벽 파열없이 설치류 SMA를 Cannulating 인해 용기의 크기 및 위치에 매우 어려울 수있다. 선택적으로, 봉합은 SMA에 플라스틱 캐뉼라를 연출 말단 대동맥 자체의 삽관이어서 종래 SMA 원점 근위 대동맥 주위에 배치 될 수있다. 탈세 포화 동안 가난한 정맥 배치 및 고 유량의 조합은 혈관 접근을 잃고 발생할 수 있습니다. 불임은 소장에 존재하는 세균 식물의 양으로 인해 큰 문제입니다. 수확 다음 PBS / AA로 세척하는 것은 매우 중요하며, 대변이나 파편의 흔적은 루멘에서 제거해야합니다. 불임이 달성 된 경우 UV 살균 다음 배양기에서 DMEM로 팔콘 튜브에 비계의 일부를 배치하는 지표가 될 것이다. 경우세균성 식민지의 미디어는 색이 빨간색에서 노란색으로 선회로 pH를 변경합니다. 이것에 대처하기 위해, 상기 UV 사이클은 PBS 항생제 / 항진균제의 높은 농도를 함유하는 세정뿐만 아니라 권고된다.

혈관과 정맥 모두에 액세스 할 수있는 발판을 얻기 위해 가능한 변형은 하대 정맥 (IVC)뿐만 아니라 SMA를 cannulate하는 것입니다. 정맥 혈관 측면에서 탈세 포화는 세 가지 솔루션을 간헐적으로 시도해야합니다. 연속 탈세 포화 양쪽에 긍정적 인 압력을 갖는하여 모세 혈관을 파열 할 수 있음.

수년에 걸쳐 시험 관내 및 생체 내 6,9,12에서 다른 세포 - 지지체의 조합을 사용하여 장 TE의 노력이있어왔다. 작품의 대부분은 콜라겐 유형 I은 6,7,13,22로 코팅 관 부직포 95 % PGA-5 % PLGA 지지체를 사용하여 수행되었습니다. 장과 다음 파종상피 organoid 단위 (OU)와 마우스의 대망에 주입 동안, 그들은 다음 tubularized 할 수있는 내부에 외부와 상피 세포에 근육과 낭종을 형성한다. 그러나 이러한 지지체의 디자인에 기공과 단순는 생물 반응기의 경우와 체외 환경에서 인공 대장의 큰 조각의 생성을 허용하지 않습니다. 또한, 상기 수신자에 연결될 수 선천성 혈관 네트워크의 부족은 임상 번역이 지지체의 사용을 제한한다. PGA-PLGA 인공 지지체와 실험 외에, 다른 그룹은 장관의 복잡함을 복제하지 않는 둘 콜라겐 또는 SIS 발판을 사용했습니다. SIS는 특히 장 조직 공학 만 이전 발행 방법론 및 기계적 안정성을 제공하고, 리드 동안 세포 성장을 촉진하는 decellularized 비계의 능력을 보여주는, 150 개 이상의 의료 세팅에 사용되고아무 면역 반응을 보내고. 그러나, 적절한 매크로 및 마이크로 아키텍처의 부족, 장내 TE 목적 9-11,23에 대한 '사용 가난한 결과를 주도하고있다.

우리가 기술 한 탈세 포화 방법의 장점은 장 줄기 세포 틈새 시장으로 다시 채우기에 적합한 환경을 나타내는 등 내강 토굴-융모 구조와 같은 미세한 특성의 보존이 (가) 있습니다. 거시적 인 측면에서, 계층 적 혈관 네트워크의 존재는 TE-부위 (21)의 모든 층에 영양소 및 산소 공급을 허용 수신자에의 부착을 가능하게 할 것이다. 무엇보다, 콜라겐, 엘라스틴과 glyocosaminoglycans으로 ECM 구성 요소의 유지 보수는 기계적 특성에 대한뿐만 아니라, 세포 증식과 분화를 연출뿐만 아니라 중요한 역할을하고 있습니다. 가장 중요한 것은, 탈세 포화 방법의 능력은 대형으로 확장 할 수 있습니다동일한 특성을 유지하면서 연구 조직은 TE의 임상 번역을위한 중요한 기능입니다.

혈관 네트워크와 천연 장내 매트릭스의 개발은 호스트에 접속 될 수있는 인공 소장의 큰 세그먼트의 생성을 허용한다.

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

저자는이 프로토콜의 개발에 도움을 재생 의학의 웨이크 포레스트 대학을 감사합니다. 우리는 그레이트 오르 몬드 스트리트 병원 자선에서 교부금에 의해 지원을 인정 재단 에우 제 니오 리타 (제네바, 스위스), 의학 연구위원회, 영국에 대한 영국의 외과 의사, 스파크 아이들의 의료 자선, 영국 외무부의 왕 대학 / 미국 휴대 공동 수상과 미탈 연구 기금을 줄기. 우리는 또한 아동 건강 연구소의 소아 외과 부에서 얻은 조직 공학 실험실 보수 공사 보조금 왕립 학회 / 울프슨 재단에게 감사의 말씀을 전합니다. PDC와 SE는 그레이트 오르 몬드 스트리트 병원 어린이의 자선에 의해 지원된다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol solution, 70% in H20 Sigma 02877
Phosphate buffered saline tablets Sigma 79382
Antibiotic Antimycotic Solution (100x) Sigma A5955
Sodium deoxycholate Sigma D6750 Oral and eye irritant; use protection
Sodium chloride
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma D5025

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References

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