Doğal Aselüler Bağırsak Matrix'in üretimi için bir Decellularization Metodoloji

* These authors contributed equally
Bioengineering
 

Summary

Makalede, sıçan bağırsaktan bir hücresel olmayan matrisinin üretimi için bir yöntem anlatılmaktadır. Bağırsak iskelelerinin türetme hücre biyolojisi ve uyuşturucu testi kök, doku mühendisliği gelecekteki uygulamalar için önemlidir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Maghsoudlou, P., Totonelli, G., Loukogeorgakis, S. P., Eaton, S., De Coppi, P. A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix. J. Vis. Exp. (80), e50658, doi:10.3791/50658 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Başarılı bir doku mühendisliği in vitro ya da in vivo olarak uygun bir hücre ile iskeleler kombinasyonunu içerir. Iskele, sentetik, doğal olarak türetilmiş ya da doku / organ türetilmiş olabilir. İkincisi decellularization adı verilen bir teknik kullanılarak elde edilir. Decellularization fiziksel, kimyasal ve enzimatik yöntemlerin bir arada içerebilir. Bu tekniğin amacı, orijinal doku makro-ve mikro-mimari muhafaza ederken, her hücresel izlerini ortadan kaldırmaktır.

Bağırsak doku mühendisliği bugüne kadar yerli organın karmaşık mimarisini çoğaltmak değil nispeten basit iskeleleri kullandı. Bu çalışmanın odak noktası sıçan ince bağırsak için etkili bir decellularization tekniği tanımlamaktır. Ince bağırsağın izolasyon vasküler bağlantısının korunmasını sağlayacak şekilde tarif edilmiştir. Whil Hücreleri çıkarmak için kimyasal ve enzimatik çözümleri kombinasyonuiskele luminal açıdan villus-kript ekseni koruyucu st de belirtilmiştir. Son olarak, uygun özelliklere için üretilen iskelelerinin değerlendirilmesi tartışılmıştır.

Introduction

Doku mühendisliği (TE) immünosüpresyon ve organ sıkıntısı konuları atlayarak, organ nakli için bir tedavi alternatifi sunar. TE son zamanlarda bu tür yetişkinler 3,4 ve çocuklarda 5 hem de mesane 1, üretra 2 ve trakea gibi organların değiştirilmesi ile, klinikte başarılı uygulamaları olmuştur.

Bir doku mühendisliği organı Bina uygun hücreler ile bir iskele kombinasyonunu gerektirmektedir. Bir skafold doğal kaynaklı (örneğin, kolajen) kullanılarak hazırlandı ve sentetik (örneğin, poli-L-glikolik asit, PLGA) olabilir maddeler ya da doğal organ ve dokuların decellularization ile elde edilebilir. Intestinal TE için, şimdiye kadar kullanılmış olan iskele esas olarak 6-13 (poli-L-glikolik asit ve poli-laktik asit) decellularized (ince bağırsak mukoza) ya da sentetik ya da olmuştur. Bu biyomalzemeler, makro ve mikro-mimarisi hem de çok basit olandoku mühendisliği bağırsak klinik tercüme edilmesi için ise ideal olmayabilir. Bağırsak için optimal bir biyo materyal ile yardımcı olmak için lumen tarafında konağın kan gitmesi, bağırsak duvarının katmanları yansıtmak için, farklı özelliklere sahip bir katmanlı bir boru şeklinde duvar ve bir villus-kript eksenine bağlanabilir doğuştan gelen bir damar ağacı olmalıdır epitel kök hücreleri tarafından repopulation.

Decellularization kendi özgün mimarisini 14 koruyarak bütün organların hücrelerini kaldırarak iskeleleri üreten bir roman yöntemdir. Bu, organ yapısını taklit değil, aynı zamanda hücre dışı matris (ECM) yardım hücre çoğalması ve farklılaşması içinde gömülü kimyasal ipuçları içeriyor sadece önceden bu yana yapı iskelesi mevcut olan tercih edilir. 2008 yılında kadavra trakea hastanın kendi hücreleri ile seribaşı, 14 decellularized ve genç bir adam sol ana bronşu yerine nakil oldu 15, 16,17, karaciğer ve akciğer 18-20 için hücresizleştirilmiş iskeleler üretimini bildirmiştir.

Ayrıca küçük bağırsak decellularized iskele 21 üretilmesi için aynı metodoloji adapte edilmiştir. Burada tarif edilen yöntemin amacı bu kan akımı gibi orijinal doku, hem de bağırsak lümeninde villus-kript ekseninin mikroskobik mimarisinin makroskopik özelliklerini korumak decellularized bağırsak matrisleri üretmektir. Biz bu metodoloji sonuçta decellularization verimliliğini artırmak için diğer organlar için kabul edilebilir inanıyorum.

Protocol

1.. Rat Bağırsak İzolasyonu

  1. % 1 antibiyotik / antimikotik (Sigma, UK) (PBS / AA) ile fosfat tamponlu tuzlu çözeltisi (Sigma, UK) bir 1 L çözelti hazırlayın. Iki tüp ile peristaltik pompa (Masterflex L / S değişken hız) takınız. Başka bir 15 dakika boyunca PBS / AA ve ardından en yüksek hızda 15 dakika boyunca peristaltik pompanın tüpler aracılığıyla% 70 etanol (EtOH) çalıştırın.
  2. CO 2 inhalasyon ve (İngiltere, Hayvanlar (Scientific Procedures) Yasası 1986 altında Home Office kurallar) Yerel hayvan kurallar ve onayları doğrultusunda, boyunları kırılarak yaklaşık 250-350 g ağırlığında Sprague-Dawley sıçanları Euthanize.
  3. Kullanmadan önce cerrahi aletler otoklavlayın. Sprey ve% 70 EtOH ile hayvanın karın silin.
  4. Net bir cerrahi alan sağlamak için karın üzerinde bir xifo-kasık laparotomik kesi gerçekleştirin.
  5. % 70 EtOH ile püskürtülen bir kağıt havlu üzerine hayvanın sağ tarafında ince bağırsak Eviscerate. Takhücre dışı matrisin (ECM) 'nin doku ve denatürasyon su kaybını önlemek için sürekli bir şekilde PBS / AA bağırsak ıslak bakım e.
  6. Bağırsak doğru aorta 90 ° açı ile çıkan superior mezenterik arter (SMA) bulun. Aort SMA girmek ve hızlı bir şekilde kabın duvarı yırtılmasını önlemek için iğnenin geri çekilmesi hususunda bir 27 G kanül kullanın. SMA içine kanül plastik tüp ilerlemek ve sütür (vicryl 5/0) tutturun.
  7. PBS / AA 1 ml enjekte edilerek kanülasyon onaylayın. Kanül serbest şekilde SMA aorta proksimal ve distal kesilirken yaylı makas kullanın.
  8. Kalın bağırsak üzerinden kesme zaman dışkı sızmasını önlemek için, bir (İpek 5/0) dikiş ileocaecal birleşme proksimal ucunda düğüm ve sigmoid kolon ve uzak ucunda bir yer. Daha sonra, iki düğüm arasındaki terminal ileum ve kolon kesme ve kalın bağırsak çıkarın.
  9. Jejuno-duodenum kavşak a da bağırsak Cutnd karın ile olabilecek herhangi bir bağ dokusu bağlantıları bağırsak ücretsiz.
  10. PBS / AA ile bir Petri kabındaki ince bağırsak aktarın. Bir plastik Pasteur pipet (LSL Laboratuvar Sarf) ile bağırsağın proksimal bölümünü Cannulate ve dikişlerle yerine sabitleyin. Bir 60 ml şırınganın luer-lok (BD Plastipak) uyacak şekilde pipet kesin. Intestinal lümen dışkı ve enkaz kaldırmak için PBS / AA 60 ml 2x yıkayın.

2. Decellularization Metodoloji

  1. Üç yollu musluk için damar kanülü bağlayın. Bu, kullanım kolaylığı vasküler ağacın üzerine gerginlik en aza indirmek ve boru gelen kabarcıkların çıkarılmasını sağlayacaktır.
  2. 0.6 ml / st 'de Masterflex L / S değişken hızlı rulo pompa ile, iyonu giderilmiş su (18.2 MQ direnç / cm) çalışan başlatın. Kabarcıklar önce bağırsak lümen musluğu ile bağlantı için bir boru içinde mevcut olduğundan emin olun. Bazı kabarcıklar aşama lümen içinde mevcut olabilir,1.9, decellularization sürecini bozabilecek. Pompanın hızını Vary ve uzak ucundan itibaren en kabarcıklar çıkış sağlamak için dikkatli bir forseps ile doku kolu. Yüksek hızlarda damar ağaca zarar olabilir çünkü bu süreç tamamlanana kadar damar kanül bağlamayın.
  3. Decellularization aşağıdaki aşama 4 ° C'de gerçekleştirilir, çünkü soğuk odaya transfer aparatı Düşük sıcaklık doku ayrışmasını en aza indirgerken hücre çıkarılmasına izin verir. Taşan çözüm toplayacak bir kapta Petri yerleştirin. 0.6 ml / saat, 24 saat boyunca bağırsak lümeni ve deiyonize su ile damar ağacı (direnç M 18.2 / cm) iki serpmek. İlk saat tüm bağlantıların sağlam olduğundan emin olmak için düzenli olarak kontrol cihazı için, kaçak minimal ve hiçbir kabarcıklar bağırsak içinde mevcut.
  4. Iyonu giderilmiş su ile tedavinin 24 saat sonra adımlardır geri kalanı gibi soğuk oda dışında decellularization cihaz hareketOda sıcaklığında (RT) olarak gerçekleştirilmiştir.
  5. Iyonu giderilmiş su içinde% 4 solüsyon 300 ml hazırlamak için, sodyum deoksikolat (Sigma, UK) tartılır. Bir ağız ve göz tahriş edici olduğu gibi, bir emme başlık altında sodyum deoksişolat tartılır. Çözelti berrak olana kadar bir vorteks ile karıştırın. Çözelti, en fazla 1 ay boyunca 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
  6. Herhangi bir kabarcıkları ve 0.6 4 saat ml / saatte serpmek, bağlantılarını kontrol, sodyum deoksikolata deiyonize çözüm değiştirin.
  7. Sodyum deoksikolat ve DNase-I arasındaki etkileşimi engellemek için 30 dakika boyunca PBS / AA sodyum deoksikolat yıkama aşaması sonrasında.
  8. Deoksiribonükleaz-I (DNase I, Sigma) tartılır ve 1 M sodyum klorür, pH 7.4 içinde bir 2.000 kU çözeltisi 250 ml hazırlar. Çözelti berrak olana kadar bir vorteks ile karıştırın. Bu çözelti kullanımdan hemen önce hazırlanmalı ve depolanamaz.
  9. 0.6 ml / saat 'lık bir hızda oda sıcaklığında 3 saat boyunca DNase-I ile serpmek.
  10. DNase I-adımından sonra, aktarmaBir doku kültürü kaputu içine iskelesi ve tabak ve araçları değiştirmek. Bu aseptik teknik kullanılması tavsiye edilir.
  11. Decellularization çözeltilerin her kalıntıları çıkarıldığından emin olmak için, 30 dakika boyunca PBS / AA ile yıkayın. Yeni bir Petri tabağına yerleştirin iskele ve bir UV çapraz bağlayıcı madde (Spectroline, ABD) ve transfer. İki sterilizasyon döngüleri çalıştırın. Her 3 günde bir% 5 PBS / AA saklamak ve çözüm değiştirin.

Representative Results

Başarılı decellularization (Şekil 1) üzerine, skafold yerli bağırsağın benzer bir makroskopik bir görünüme sahip olmalıdır, ancak yarı saydam duvarlar (Şekil 2A) ile. Makro-mimarisinin korunması da vasküler ağacın açıklığının tarafından belirgin olmalıdır. Boya SMA kanülden enjekte edildiğinde, bu yapı iskeletinin her yerinde homojen bir şekilde dağılması ve kapiller ağaç (Şekil 2B) ulaşması gerekir. Iskele nükleer ve sitoplazmik malzeme, bir DNA miktar kiti ve basit histolojik analizi kullanılarak değerlendirilebilir şey özgür olmalıdır. Hematoksilin ve eozin boyama (H & E), küçük bağırsak katmanları (Şekil 3A) muhafaza etmekte iken, nükleer ve sitoplazmik malzemesinin yokluğunu göstermelidir. Özellikle, luminal tarafta, villuslarda kript bakım tarama elektron mikroskobu (Şekil 4), aşağıdaki açık olmalıdır. Aörneğin kolajen, elastin ve glikozaminoglikanlar gibi hücre dışı matriks bileşenlerinin korunması da beklenmelidir. Örneğin, skafold (Şekil 3B) Masson trikrom görüntüler sağlam bağ dokusu.

Şekil 1
Şekil 1. . Decellularization prosedür deneysel planı Timeline; PBS / AA: antibiyotik-antimikotik, NaDeoxy ile fosfat tamponlu tuzlu su: Sodyum deoksikolatın, RT: oda sıcaklığı, DNAse-I: deoksiribonükleaz-I. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 2,
Şekil 2. İskele macroscopic özellikleri. başarılı decellularization sonra sıçan ince bağırsağın Makroskopik görünüm (A). Rosso Ponceau SMA ile boya enjeksiyon sağlam bir damar ağı (B) gösterir; SMA: superior mezenterik arter büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,
Şekil 3,. . Histoloji H & E (A) ve MT (B) boyama bağ doku mimarisinin korunmasında hücresel malzemeden bir olmadığını gösterir; H & E: hematoksilin ve eosin, MT: Masson trikrom. Ölçek çubuğu:. 100 mikron büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın . Şekil 4,
Şekil 4. . Elektron Mikroskobu Taramalı elektron mikroskobu iskele lümen içinde korunmuş villus-kript mimarisini gösterir; Ölçek çubuğu:. 100 mikron büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın .

Discussion

Bu denemeyi kurarken en zor adımlar SMA kanülasyon ve kuruluş ve kısırlık bakımını içerir. Duvar yırtmadan kemirgenlerde SMA kanülü nedeniyle kabın boyutu ve konumu oldukça zor olabilir. Seçenek olarak ise, bir ameliyat dikiş ipliği SMA içine plastik kanül yönlendirilmesi, distal aort kendisinin kanül, ardından önceki SMA orijine proksimal aort etrafına yerleştirilebilir. Decellularization sırasında kötü kanül yerleştirilmesi ve yüksek akış oranları bir arada damar erişimi kaybetmenize neden olabilir. Sterilite, ince bağırsakta mevcut bakteri florasının miktarı nedeniyle önemli bir konudur. Hasat sonrası PBS / AA ile yıkanması çok önemlidir, ve dışkı veya enkaz herhangi bir işaret lumeninden kaldırılması gerekir. Kısırlık elde edilmiş ise UV sterilizasyondan sonra inkübatör içerisinde DMEM ile bir Falcon tüpüne iskeletin bir kısmını yerleştirme göstergesi olmalıdır. Durumdabakteriyel kolonizasyon, medya kendi rengi sarı kırmızı dönüm ile pH değişecek. Bu başa çıkmak için, daha fazla UV çevrimi PBS antibiyotik / antimikotik ajanın yüksek bir konsantrasyon içeren yıkama hem de tavsiye edilir.

Damar ve venöz hem de erişimi olan bir iskele elde etmek için olası bir değişiklik inferior vena kava (IVC) yanı sıra, SMA kanüle olacaktır. Venöz ve damar taraftan Decellularization her üç çözelti için aralıklı olarak denenmelidir. Sürekli decellularization iki tarafta pozitif basınç alarak kılcal damarları patlayabilir.

Yıllar boyunca in vitro ve in vivo 6,9,12 farklı hücre-iskelet kombinasyonları kullanılarak bağırsak TE içinde çabaları bir dizi olmuştur. Işin çoğunluğu kolajen tip I 6,7,13,22 ile kaplanmış boru şeklindeki dokuma olmayan% 95 PGA-PLGA% 5 yapı iskelesi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Intestinal ile ardından mibzerepitel organoid birimleri (OU) ve farelerin omentum içine implantasyon dönemi, daha sonra tübülerize edilebilir iç dış ve epiteli üzerinde kas kist oluştururlar. Bununla birlikte, bu iskelelerinin tasarımında gözeneklilik ve basitlik bir biyoreaktör edilen gibi bir in vitro ortamda yapay bağırsak büyük parçalarının üretimi için izin vermez. Buna ek olarak, ayrıca alıcıya bağlı olabilir bir doğal damar ağının eksikliği klinik çeviri için bu iskele kullanımını sınırlar. PGA-PLGA iskeleler olan deneylerde yanı sıra, diğer gruplar bağırsak yolunun karışıklık kopyalamazlar, her ikisi de kollajen veya SIS iskeleleri, kullandık. SIS özellikle intestinal doku mühendisliği sadece daha önce yayınlanmış bir yöntemdir ve mekanik sağlamlık sağlamak ve talebi sırasında hücre büyümesini teşvik etmek için hücresizleştirilmiş iskelelerinin yeteneğini gösteren, 150'den tıbbi ortamlarda kullanılmaktadırhiçbir immünojenik tepki meydana getirmez ing. Ancak, uygun makro-ve mikro-mimarisi eksikliği, bağırsak TE amaçlar 9-11,23 için onun 'kullanımı kötü sonuçlara yol açmıştır.

Tarif ettiğimiz decellularization metodolojisinin faydaları bağırsak kök hücre niş tarafından repopulation uygun bir ortamı temsil gibi lümen crypt-villus mimarisi gibi mikroskobik özelliklerinin korunmasını içerir. Makroskopik açıdan, hiyerarşik bir damar ağının varlığının, TE-bağırsak 21 her katmana besin ve oksijen sağlanmasını sağlayan, alıcıya eki sağlayacaktır. Dahası, örneğin kolajen, elastin ve glyocosaminoglycans gibi ECM bileşenlerin bakım mekanik özellikleri için değil, aynı zamanda, hücre proliferasyonunu ve farklılaşmasını yönlendirilmesi de önemli bir rolü vardır. En önemlisi, decellularization metodolojinin yeteneği geniş içine ölçeklendirilebiliraynı özellikleri muhafaza ederken r dokular TE klinik çeviri için önemli bir özelliktir.

Vasküler ağ ile doğal intestinal matrisin gelişme ana bağlanabilir yapay bağırsak daha bölümlerinin oluşturulmasını sağlar.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Yazarlar, bu protokolün geliştirilmesi ile yardım için Rejeneratif Tıp Wake Forest Enstitüsü teşekkür ederim. Biz Great Ormond Street Hastanesi sadaka hibe ile destek kabul, Vakıf Eugenio Litta (Cenevre, İsviçre), Tıbbi Araştırma Konseyi, İngiltere için İngiltere Cerrahlar, Sparks Çocuk Tıp Charity, İngiliz Dışişleri Bakanlığı'nın Kraliyet Koleji / ABD Hücre İşbirliği Ödülü ve Mittal Araştırma Fonu Stem. Biz de Çocuk Sağlığı Enstitüsü, Çocuk Cerrahisi Anabilim Dalı için elde doku mühendisliği laboratuvar yenileme hibe için Royal Society / Wolfson Vakfı'na teşekkür etmek istiyorum. PDC ve SE Great Ormond Street Hastanesi Çocuk Vakfı tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol solution, 70% in H20 Sigma 02877
Phosphate buffered saline tablets Sigma 79382
Antibiotic Antimycotic Solution (100x) Sigma A5955
Sodium deoxycholate Sigma D6750 Oral and eye irritant; use protection
Sodium chloride
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma D5025

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367, (9518), 1241-1246 (2006).
  2. Raya-Rivera, A., Esquiliano, D. R., Yoo, J. J., Lopez-Bayghen, E., Soker, S., Atala, A. Tissue-engineered autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study. Lancet. 377, (9772), 1175-1182 (2011).
  3. Macchiarini, P., Jungebluth, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372, (9655), 2023-2030 (2008).
  4. Macchiarini, P., Walles, T., Biancosino, C., Mertsching, H. First human transplantation of a bioengineered airway tissue. J. Thorac. Cardiov. Surg. 128, (4), 638-641 (2004).
  5. Elliott, M. J., de Coppi, P., et al. Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: a 2-year follow-up study. Lancet. 380, (9846), 994-1000 (2012).
  6. Grikscheit, T. C., Siddique, A., et al. Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection. Ann. Surg. 240, (5), 748-754 (2004).
  7. Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., Torashima, Y., Barthel, E. R., Grikscheit, T. C. A Multicellular Approach Forms a Significant Amount of Tissue-Engineered Small Intestine in the Mouse. Tissue Eng. Part A. (2011).
  8. Matthews, J. A., Sala, F. G., Speer, A. L., Warburton, D., Grikscheit, T. C. VEGF optimizes the formation of tissue-engineered small intestine. Regen. Med. 6, (5), 559-567 (2011).
  9. Chen, M. K., Badylak, S. F. Small bowel tissue engineering using small intestinal submucosa as a scaffold. J. Surg. Res. 99, (2), 352-358 (2001).
  10. Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Toki, A. Experimental assessment of small intestinal submucosa as a small bowel graft in a rat model. J. Pediatr. Surg. 38, (11), 1596-1601 (2003).
  11. Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Noda, T., Yoshida, A., Oyama, T., Toki, A. Morphologic evaluation of regenerated small bowel by small intestinal submucosa. J. Pediatr. Surg. 40, (12), 1898-1902 (2005).
  12. Hori, Y., Nakamura, T., et al. Experimental study on tissue engineering of the small intestine by mesenchymal stem cell seeding. J. Surg. Res. 102, (2), 156-160 (2002).
  13. Gardner-Thorpe, J., Grikscheit, T. C., et al. Angiogenesis in tissue-engineered small intestine. Tissue Eng. 9, (6), 1255-1261 (2003).
  14. Conconi, M. T., Coppi, P. D., et al. Tracheal matrices, obtained by a detergent-enzymatic method, support in vitro the adhesion of chondrocytes and tracheal epithelial cells. Transpl. Int. 18, (6), 727-734 (2005).
  15. Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, (2), 213-221 (2008).
  16. Uygun, B. E., Soto-Gutierrez, A., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. 1-8 (2010).
  17. Uygun, B. E., Price, G., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. J. Vis. Exp. (48), e2394 (2011).
  18. Petersen, T. H., Calle, E. A., et al. Tissue-Engineered Lungs for in Vivo Implantation. Science. 329, (5991), 538-541 (2010).
  19. Ott, H. C., Clippinger, B., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, (8), 927-933 (2010).
  20. Calle, E. A., Petersen, T. H., Niklason, L. E. Procedure for lung engineering. J. Vis. Exp. (49), e2651 (2011).
  21. Totonelli, G., Maghsoudlou, P., et al. A rat decellularized small bowel scaffold that preserves villus-crypt architecture for intestinal regeneration. Biomaterials. 33, (12), 3401-3410 (2012).
  22. Sala, F. G., Kunisaki, S. M., Ochoa, E. R., Vacanti, J., Grikscheit, T. C. Tissue-engineered small intestine and stomach form from autologous tissue in a preclinical large animal model. J. Surg. Res. 156, (2), 205-212 (2009).
  23. Demirbilek, S., Kanmaz, T., Ozardali, I., Edali, M. N., Yücesan, S. Using porcine small intestinal submucosa in intestinal regeneration. Pediatr. Surg. Int. 19, (8), 588-592 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics