脂肪组织免疫细胞的分离

Immunology and Infection

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Summary

脂肪组织(AT)是一个强烈的免疫细胞的激活和相互作用的部位。几乎所有的免疫系统的细胞是存在于AT和它们的比率是改变了肥胖。适当的隔离,定量,定性的AT免疫细胞群,是了解自己的角色在immunometabolic疾病的关键。

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Orr, J. S., Kennedy, A. J., Hasty, A. H. Isolation of Adipose Tissue Immune Cells. J. Vis. Exp. (75), e50707, doi:10.3791/50707 (2013).

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Abstract

在脂肪组织中的巨噬细胞浸润增加(AT)的肥胖啮齿类动物和人类的发现感兴趣的免疫细胞贡献的加剧,导致局部和全身的胰岛素抵抗。瘦肉和肥胖不同的免疫细胞群的分离和量化是现在普遍使用的技术,还必须格外小心,应采取使血管基质细胞的分离和流式细胞仪分析获得的数据是可靠的,可解释的在immunometabolism实验室。在这段视频中,我们展示了如何切末,消化,并隔离富含免疫细胞间质血管分数。随后,我们将展示如何抗体标记巨噬细胞和T淋巴细胞,以及如何正确的门对他们在流式细胞仪实验。代表流式细胞仪地块从低脂肪喂养的瘦和高脂肪喂养的肥胖小鼠。在此分析中的一个关键因素是使用的抗体,该抗体荧光渠道在巨噬细胞是自然自发荧光,以及使用适当的补偿控制。

Introduction

从历史上看,脂肪组织(AT)一直被看作是惰性的脂质储存器官,膨胀和收缩响应能量平衡。我们现在明白了,在代表一个动态的内分泌器官,积极分泌一些激素,它直接影响摄食行为和全身葡萄糖稳态。此外,在过去十年中一直为众多的人口居住在血管基质部分(SVF),以及他们的贡献动态平衡免疫细胞的不断升值。

其次通过差速离心分离脂肪细胞和SVF使用胶原酶消化能力罗德贝尔首次描述了在1964年1。 Ⅱ型胶原酶是最常用的为脂肪细胞的和SVF分离的脂肪细胞的胰岛素受体​​1的维护。在早期,主要采用酶分馏AT学习体重减轻,脂肪CYTE代谢和隔离脂肪前体细胞。最近,这种技术,结合流式细胞仪和广泛的可用性市售荧光标记的抗体的数量不断增加,促进免疫细胞的表征AT。

虽然存在前面所述的免疫细胞在发炎AT 2,Weisberg等人的开创性论文。徐等人 。发表于2003年首次记录积累的巨噬细胞(自动取款机)肥胖,分泌炎性细胞因子,并与AT特异性和全身胰岛素抵抗3,4。这些观测服务为基础,最近创造了一个新的研究领域,“immunometabolism,”5,并已跟进研究,涉及各种免疫细胞的人口,包括树突状细胞,肥大细胞,T细胞8 -10,B细胞,NKT细胞,嗜酸性粒细胞13,与肥胖相关的胰岛素抵抗的发展中的嗜中性粒细胞14,15。

这篇文章的目标是提供胶原酶消化技术,用于分离细胞的AT SVF和表征自动取款机和AT&T的细胞通过流式细胞仪的详细说明。该协议已优化的鼠标,但是,观众可能会受益于阅读的优秀文章,优化这一技术为人类提供丰富的细节在16。这篇文章的目标受众包括有限的工作经验,用鼠标进行流式细胞仪的调查。平衡的时间和资源的细胞产率以及活性与几个实际的考虑,以及最佳的流式细胞仪控制AT的免疫细胞群的特征。除了我们的通讯协议,读者请参照最近的朱庇特的文章Basu 的精彩讨论一些流式细胞仪技术方面的,包括适当的控制和补偿17。

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Protocol

1。试剂和耗材

发起这个实验协议之前,需准备以下试剂:

  1. 70%乙醇
  2. 1X PBS
  3. 1X的DPBS(无钙,镁)与0.5%牛血清白蛋白补充
  4. FACS缓冲液:1X DPBS(无钙,镁),2mM的EDTA,1%FCS的
  5. ACK缓冲液:150mM的氯化铵的10mM KHCO 3,和0.1mM EDTA在水中的Na 2

2。脂肪组织的收获和准备

  1. 安乐死老鼠IACUC批准程序,具体到每个机构。
  2. 彻底弄湿皮草,用70%的乙醇。
  3. 在剑突(胸骨下部)的水平做一个切口,打开胸腔,暴露心脏,小心不要断绝任何主要血管。

注意:在这一点上,它也是有帮助的离开隔膜完好的一样多可能的,切一个缺口,肋骨的右侧,让血液和灌注液流出的胸腔。

  1. 剪辑的右心房,让血液灌流逃脱循环系统。

注意:肥胖老鼠,多余的心包处理时可能需要拆除,允许进入心脏。

  1. 用钳子抓住心,轻轻插入一根针进入左心室通过顶点。慢慢灌注鼠标,用15毫升无菌PBS。

注意:如果肺部开始,以填补和拓展,减少灌注率。

  1. 打开腹腔脂肪垫删除perigonadal的使用小心,以避免任何性腺组织。
  2. 脂肪垫放置在称重船在冰含2毫升1X DPBS(无镁或钙)含0.5%BSA,AT成细片和肉。

注:限制量的每称重船1.2克的。如果量的超过1.2克时,均匀地分成两个称量皿之间。

  1. 查看AT样品在冰上,准备3毫升每AT样本组成的1X DPBS补充有0.5%BSA的10mM的CaCl 2和4毫克/毫升Ⅱ型胶原酶,胶原酶消化液。

3。胶原酶消化

  1. 传输到50毫升锥形管浇匀浆和漂洗1毫升DPBS(0.5%BSA)和3毫升Ⅱ型胶原酶消化液的权衡船。
  2. AT匀浆在旋转摇床(200转),在37℃孵育20分钟。
  3. 添加10毫升DPBS(0.5%BSA)的锥形管置于冰上。
  4. 磨碎匀浆无数次,使用10毫升血清吸管,并传递到一个新的50毫升锥形管细胞悬液通过100微米的过滤器。
  5. 细胞悬浮液在500×g离心10分钟在4研发比如C。
  6. 倒出上清,重悬细胞沉淀SVF ACK缓冲液3毫升溶解红细胞的污染。
  7. 添加12毫升的FACS缓冲液中,离心细胞悬浮液在4℃下以500×g离心10分钟
  8. 倒出上清,重悬细胞沉淀SVF在流式细胞仪缓冲。

注意:使用作为导览多少FACS缓冲液重悬英寸如果细胞沉淀覆盖的50毫升锥形管的底部,用FACS缓冲液0.5-1毫升,否则,在0.25〜0.5重悬细胞沉淀的大小毫升。

  1. 将样本放置在冰上混合加入40μlFACS缓冲液中,加入50μl台盼蓝溶液(0.2%),10微升细胞悬浮液制备1:10稀释每个样品的等分试样中,进行细胞计数。
  2. 基于台盼蓝染色,计数活细胞,并稀释至终浓度为5-10×10 6细胞/ ml的细胞悬浮液。

4。细胞表面抗原染色

添加抗小鼠CD16/CD32抗体(Fc的块),以终浓度为0.5-1μg/106个细胞,并在冰上孵育10分钟。
  • 将样品(≥10 6个细胞),以12×75毫米的聚苯乙烯圆底管。准备单独的管,如果,分析取款机和T细胞,并准备了充足的管数以容纳所需的补偿和修饰的荧光减一(FMO)控制的额外的细胞结合。
  • 注意:作为一个例子,当量化的自动取款机的基础上,下面的补偿F4/80和CD11b及FMO控制的比例将需要准备:

    - 未染色(细胞)

    - DAPI或碘化丙啶(PI)单染色(细胞,不加可行性染料,直到步骤5.1)

    - ,F4/80的APC单染色(细胞或补偿珠)

    - 细胞CD11b FITC的单染色(细胞或补偿珠)

    - FMO 1(细胞):大鼠IgG2a的κ型控制APC + CD11b的FITC +活力染料(在步骤5.1中添加)

    - FMO 2(细胞):F4/80 APC +鼠IgG2b的κ型控制FITC +生存能力染料(增加5.1步)

    1. 在相应的浓度添加的荧光基团共轭的第一抗体和/或同种型对照( 见表试剂和材料 )。
    2. 保护样品免受光线和在4°C孵育30分钟。
    3. 加入2毫升的FACS缓冲液中,离心细胞悬浮液在4℃下以500×g离心5分钟
    4. 倒出上清,重悬细胞沉淀SVF 2毫升FACS缓冲。
    5. 细胞悬液500 XG离心5分钟,在4°C,重悬细胞沉淀SVF≥400微升FACS缓冲。
    6. 将样品12×75毫米聚苯乙烯圆底配备35微米的细胞过滤管顶管。
    7. 保护光,店内样品在4℃,直到流式细胞仪分析。

    注意:为获得最佳效果,细胞应immeadiately分析,然而,与此协议的FACS分析已经成功地进行了对存储在FACS缓冲液中的标记的细胞在4℃下1-2小时如果细胞需要加以固定,以增加存储时间标记的细胞可以用2%多聚甲醛在4℃下固定24小时,FACS分析之前。抗体公司标记的细胞可被存储为一个星期,然而,这并没有此过程的范围内进行了测试。

    5。流式细胞仪分析

    1. 流式细胞仪分析前样品和适当的控制,增加生存能力染料,允许死/活细胞歧视。

    注意:众多的可行性染料是市售的,但DAPI和PI建议取决于激发/发射教授所使用的荧光团标记的抗体尔斯。 DAPI和碘化丙啶被添加到每个样品的终浓度为0.2毫克/毫升。

    1. 使用未染色的阴性对照样品,分离的细胞优选从相同的组织作为实验样品,进行调整使侧向散射光(SSC)和前向散射(FSC)的感兴趣的细胞群(次)的规模。

    请注意:有关的AT SVF细胞的分析,它是建议SSC被显示在对数标尺的线性标尺与FSC。 SSC使用日志规模分析是特别重要的,当自动柜员机(ATM),这往往是非常大的,颗粒状。

    1. 绘制一个初始光散射门类型细胞(s)被分析的基础上,调整增益,使光电倍增管(PMT)未染色的细胞是最左边的一个单参数直方图(约集中在10 2)相应的通道。</ LI>

    注意:这是建议的淋巴细胞和巨噬细胞(或其它髓系细胞)分别进行分析,由于自体荧光的差异。

    1. 使用单一的彩色控制或抗体捕获补偿珠进行多色彩补偿。

    注意:建议补偿有孔玻璃珠的使用,但是,每种抗体的兼容性必须得到保证。例如,补偿的有孔玻璃珠可能不交叉反应,兔抗体,在这种情况下,分离的细胞需要获得相应的单染色控制。

    1. 设置的基础上改进的FMO控制实验的大门。
    2. 设置流式细胞仪收集相应数量的患病人口的利益基础上的事件,并记录实验数据。
    3. 出口FCS数据文件进行离线分析。有许多方案可供流量cytometr的y数据分析。我们建议Cytobank,一个基于网络的平台,允许的investigatores存储和分析数据,并生成数字从任何一台计算机与互联网接入18。此外,Cytobank提供的能力,使数据的公共访问或限制访问的合作者。

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    Representative Results

    雄性小鼠附睾脂肪垫的AT胶原酶消化后差速离心法分离的SVF喂食低脂肪(10%千卡来自脂肪)或高脂肪(60%千卡来自脂肪)饮食(LFD和HFD ),分别为16周。然后SVF细胞标记的荧光团标记的第一抗体,通过FACS分析可行的自动取款机( 图1)和AT&T的细胞( 图2)的量化比例。 图1A2A中描绘了初始的门控,包括光散射,双重歧视和生存能力门。应该强调的是,在图2A中的初始光散射栅被限制为,以避免包括自体荧光的髓系细胞的淋巴细胞群体。使用改性FMO的一个例子控制设置实验盖茨描绘图1B。在这个例子中,F4/80(左列)和CD11b抗体( 右列 )被替换为相应的同种型对照,考虑到自体荧光和非特异性结合。象限门,然后绘制,确定可行的自动取款机(F4/80 +细胞CD11b +)。 图2B中所示的CD4 +和CD8 + AT&T细胞的门控。 AT淋巴细胞可行第一门TCRβ( 左列 )。随后,TCRβAT&T细胞CD4和CD8( 右列 )门控。

    图1
    图1。脂肪组织巨噬细胞分离从AT雄性小鼠附睾SVF喂食低脂肪或高脂肪的饮食16周使用胶原酶摘要协议。随后F4/80和CD11b quently,SVF细胞进行染色,并使用流式细胞仪进行FACS分析,来识别自动柜员机。 ( )初始光散射和活力门。 (B)改性FMO控制F4/80和CD11b将同种抗体用于对齐象限门。 (C)比较F4/80 +细胞CD11b +自动取款机的比例从AT的低脂肪和高脂肪喂养的老鼠。 点击此处查看大图

    图2
    图2。脂肪组织的T细胞。SVF从雄性小鼠附睾脂肪组织分离喂食低脂肪或高脂肪的饮食,连续16周,采用t胶原酶消化的协议。随后,SVF细胞TCRβ,CD4染色,并使用流式细胞仪进行表征AT&T细胞CD8A和FACS分析。 ( )初始光散射和活力门。 (BC)的比例比较TCRβ+ T细胞(左列)和CD4 +和CD8 + T细胞(右列),AT(B),低脂肪,低(C)高脂肪喂养的老鼠。 点击这里查看大图

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    Discussion

    流式细胞仪的广泛使用,表征免疫细胞的AT导致肥胖的代谢结果,在免疫系统中的作用越来越大的兴趣。虽然确切的协议会有所不同,根据自己的经验和现有设备的实验室之间的关键步骤包括:胶原酶消化,差速离心和细胞表面抗原的标记。本文的目标是提供一个详细的协议和实用指南隔离AT SVF有限的工作经验,与AT和/或执行流式细胞仪调查。

    任何实验技术,有无数的变化,可能会或可能不会显着影响所期望的结果。根据我们的经验,该协议的详细这里代表时间,资源产量,细胞,细胞活力最有效的权衡。例如,我们已经发现,增加胶原酶II消化时间高达60分钟胶原酶具有相似的浓度对细胞产量的影响可以忽略不计,因此,我们利用一个20分钟的消化,以减少胶原酶暴露的长度。胶原酶II是最常用的脂肪组织胶原酶消化。 Sigma公司的网站上可以找到所有不同胶原酶及其主要用途的描述。典型的蜂窝产量从上述协议是2-3×10 6和4-5×10 6个细胞/克AT从小鼠喂食低脂肪(10%千卡来自脂肪)和高脂肪(60%千卡来自脂肪)的饮食16周后,分别。除了不同胶原酶消化时间,有一些潜在的修改当前的协议,这取决于被使用,包括饮食治疗的实验模型。首先,从老鼠喂食胆固醇或饱和脂肪酸丰富的饮食,收获时要避免冰的样品前切碎因为AT将巩固和使切碎困难。其次,我们的协议包括红细胞裂解步骤(3.6),但是,一个成功的初始灌注常常使得不需要此步骤。第三,必须小心,不添加超过10mM的CaCl 2的胶原酶消化溶液(终浓度5mM的),可能会导致更大的钙离子浓度的磷酸钙沉淀的形成。如果该沉淀物形成后的初始离心步骤(3.5),添加2个洗涤步骤除去沉淀的红细胞裂解步骤前,用20毫升FACS缓冲液(含EDTA)。第四,我们建议,调查使用至少一个整个perigonadal的的脂肪垫隔离SVF时。我们不是因为蜂窝产量的限制,使这个建议,但由于不同的细胞群显示不同的区域分布19。因此,结果可能会偏向时,只有一个部分的脂肪垫perigonadal的是我们隔离居住在AT的免疫细胞。如果整个脂肪垫是超过1.2克纵向划分的脂肪组织,从吻端到尾鳍末端。如果在这种方式的一半,每一半应提供有代表性的细胞群体,一般应不大于1.2克。然而,这仍然是超过1.2克的情况下,我们推荐1.2克在单独的管段进行胶原酶消化,然后结合所有的SVF细胞的流式细胞仪。此外,瘦鼠,它可能是要结合的2个或3个老鼠的脂肪垫,以获得足够的的SVF细胞的流式细胞仪分析。应占设计实验时需要额外小鼠。最后,用于显示数据的另一种方法是每克组织的细胞的数量。如果所需的细胞密度时,AT切碎和消化之前,应权衡。

    在SVF细胞通过流式细胞仪,两个特征方面应该强调的点。首先,所有的荧光共轭主抗体应被验证用于AT SVF细胞和妥善滴定。尽管我们证明赔偿珠,我们以前滴定这些抗体与AT SVF。表征巨噬细胞时,我们建议您不要使用串联染料( PE-CY7),因为我们有不同的结果对于非特异性结合的ATM使用这些染料的抗体共轭时。此外,如PE和FITC的荧光基团应该只被用于如上所述的经过仔细滴定。我们一般常用的表征推荐的浓度随着AT SVF细胞的特异性抗体的列表,可以发现在表1中提供。其次,因为ATM机具有强大的自体荧光抗体和非特异性结合显示一个较低的水平,在高浓度使用时,我们建议使用改性FMO控制设置实验门。FMO控制所产生的所有而不是一个标记实验样品20使用的抗体染色的对照样品与一组。我们已经修改了FMO控制在我们的协议,以取代用适当的荧光标记的同型的控制,而不是简单地删除它的抗体。在实践中,它可能是可接受的放弃FMO控制正极和负极之间的人群提供了卓越的分离的抗体,该抗体。除了这些控制,你会注意到门抗体之前,我们预选的基础上正向和侧向散射光的淋巴细胞和巨噬细胞群体。这将消除自体荧光检测的巨噬细胞,淋巴细胞群进行分析时,与FITC和汇接染料的荧光基团,如。

    虽然详细的协议是超出了本文的范围,隔离技术作为众多技术,旨在字符的第一个重要步骤在一定的免疫细胞居住在AT。例如,上述的隔离和染色协议可用于以方便分拣可以分离出mRNA的分析基因表达的特定人群。此外,可以简单的修改协议,以允许自动取款机前体内治疗。这样的修改将包括利用无菌技术取得的SVF,然后洗涤两次,再悬浮于合适的细胞培养基。 SVF,而不是添加的荧光基团共轭的抗体染色细胞表面抗原可以加入到未经处理的组织培养板为自动柜员机通过塑料吸附丰富(虽然这可以不被权利是一个纯粹的人口为成纤维细胞和前体脂肪细胞可以也坚持)。这是通过培养SVF为2-4小时,在37℃,接着由两个洗涤步骤以除去非粘附细胞。然后自动取款机可以相应处理和收获使用EDTA-细胞分离,使流式细胞仪或Trizol试剂或RIPA缓冲液,RNA或蛋白质的分离,在裂解演化过程为控制。不管下游应用,的胶原酶消化技术的罗德贝尔首次描述了在1964年1的隔离脂肪细胞和SVF细胞继续为表征的免疫细胞和肥胖的代谢后果所作出的贡献,是一个非常宝贵的工具。

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    Disclosures

    我们什么都没有透露。

    Acknowledgements

    JSO支持由美国国立卫生研究院露丝,属Kirschstein NRSA(F32 DK091040),AK是来自美国糖尿病协会(7-10-MI-05)的博士后奖学金支持,AHH支持由美国心脏协会成立研究者奖(12EIA8270000)。流式细胞仪检测实验进行了流式细胞仪在VMC共享资源。 VMC流式细胞仪共享资源支持范德比尔特消化疾病研究中心(DK058404)。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml Life Technologies 14190-250
    DAPI Life Technologies D3571
    BSA Sigma A2153-100G
    collagenase Sigma C6885-5G
    propidium iodide solution Sigma P4864-10 ml
    stable stack 20 microliter Rainin SS-L10
    20 microliter filter tips Rainin SRL10F
    stable stack 250 microliter tips Rainin SS-L250
    1000 microliter tips Rainin GPS-L1000
    1000 microliter filter tips Rainin GP-L1000F
    250 microliter Filter Tips Rainin SR-L200F
    FC Block BD Biosciences 553142
    fisher 100mn strainers Fisherbrand 22-363-549
    medium weigh dish Fisherbrand 02-202B
    aluminum foil Fisherbrand 1213100
    mincing scissors Fisherbrand 089531B
    Vortex Fisherbrand 2215365
    50 ml conical tubes BD Falcon 14-959-49A
    filter top FACS tubes BD Falcon 352235
    10 ml pipette case 200 BD Falcon 1367520
    round bottom tubes BD Falcon 352058
    5 ml syringe BD Falcon 309646
    V Bottom Plates Costar 07-200-107
    transfer bulb pipette Thermo Scientific 13-711-22
    Shaker Thermo Scientific 11 676 071
    Adhesive mat Thermo Scientific 1368750
    Cell Culture Centrifuge Sorvall 75253839
    Adapters Sorvall 75003723
    Rat anti-mouse CD16/CD32 BD Biosciences 553142 Concentration: 0.5 - 1 μg/ 106 cells
    Rat anti-mouse F4/80 eBioscience 17-4801 Fluorophore conjugate: APC
    Concentration: 0.2 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: 17-4321
    Rat anti-mouse CD11b eBioscience 11-0112 Fluorophore conjugate: FITC
    Concentration: 0.5 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: 11/1/4031
    Armenian Hamster anti-mouse CD11c eBioscience 12-0114 Fluorophore conjugate: PE
    Concentration: 0.8 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: Dec-88
    Goat anti-mouse MGL1/2 R&D Systems FAB4297P Fluorophore conjugate: PE
    Concentration: 0.1 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: IC108P
    Goat anti-mouse CD206 R&D Systems FAB2535P Fluorophore conjugate: PE
    Concentration: 0.1 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: IC108P
    Rat anti-mouse CCR2 R&D Systems FAB5538P Fluorophore conjugate: PE
    Concentration: 0.1 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: IC013P
    Armenian Hamster anti-mouse TCRβ BD Biosciences 553174 Fluorophore conjugate: APC
    Concentration: 0.2 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: 553956
    Rat anti-mouse CD8a BD Biosciences 552877 Fluorophore conjugate: PE-Cy7
    Concentration: 0.8 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: 552784
    Rat anti-mouse CD4 BD Biosciences 557956 Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700
    Concentration: 0.2 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: 557963

    Table 1. List of Materials and Reagents.

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    References

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