Isolamento de tecido adiposo de células imunes

Immunology and Infection

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Summary

O tecido adiposo (TA) é um site de ativação imune celular intensa e interação. Quase todas as células do sistema imune estão presentes em AT e as suas proporções são alteradas pela obesidade. Isolamento adequado, quantificação e caracterização de populações de células imunes são fundamentais para a compreensão do seu papel na doença immunometabolic.

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Orr, J. S., Kennedy, A. J., Hasty, A. H. Isolation of Adipose Tissue Immune Cells. J. Vis. Exp. (75), e50707, doi:10.3791/50707 (2013).

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Abstract

A descoberta de aumento de infiltração de macrófagos no tecido adiposo (TA) de roedores obesos e humanos conduziu a um interesse em intensificação da contribuição de células imunes à resistência à insulina local e sistémica. O isolamento e quantificação de populações de células imunitárias diferentes nos magros e obesos AT é agora uma técnica vulgarmente utilizada em laboratórios immunometabolism; Ainda extremo cuidado deve ser feita tanto no isolamento das células vasculares do estroma e na análise de citometria de fluxo, de modo que os dados obtidos são fiáveis ​​e podem ser interpretados . Neste vídeo demonstramos como picar, digerir, e isolar a fração de células enriquecido estroma vascular imunológico. Posteriormente, vamos mostrar como anticorpos rótulo macrófagos e linfócitos T e como fazer corretamente portão los em experimentos de citometria de fluxo. Representante de citometria de fluxo de parcelas provenientes de gordura alimentados com ratos obesos alimentados com gordura de baixa magra e alta são fornecidos. Um elemento crítico da presente análise é o uso de anticorpos que fazemnão fluorescência nos canais onde a AT macrófagos são naturalmente autofluorescent, bem como o uso de controles de compensação adequados.

Introduction

Historicamente, o tecido adiposo (TA) tem sido visto como um órgão inerte de armazenamento de lípidos, a qual expande e contrai em resposta ao equilíbrio de energia. Agora entendemos que a AT representa um órgão endócrino dinâmico que secreta ativamente uma série de hormônios que influenciam diretamente no comportamento alimentar e homeostase da glicose sistêmica. Além disso, durante a última década tem havido uma apreciação crescente para as numerosas populações de células do sistema imunológico que residem na fracção vascular do estroma EM (SVF), bem como a sua contribuição para a AT homeostase.

A capacidade para separar o EM adipócito e SVF utilizando uma digest de colagenase seguido de centrifugação diferencial foi descrita pela primeira vez em 1964 por Rodbell 1. Colagenase II é mais frequentemente usado para a separação dos adipócitos e SVF devido à manutenção de receptores de insulina adipócitos 1. Logo no início, fracionamento enzimática da AT foi utilizada principalmente para estudar Adipocyte metabolismo e para isolar pré-adipócitos. Mais recentemente, essa técnica, combinada com a ampla disponibilidade de cytometers fluxo eo número cada vez maior de anticorpos a fluoróforos, disponíveis comercialmente, tem facilitado a caracterização da AT células do sistema imunológico.

Embora a presença de células imunes em inflamada no tinha sido descrita anteriormente 2, os papéis seminais de Weisberg et al. e Xu et al. publicado em 2003, foram os primeiros a documentar o acúmulo de AT macrófagos (ATMs) em obesidade, que secretam citocinas inflamatórias e correlacionar com a resistência à insulina AT específica e sistêmica 3,4. Estas observações serviu como a base de um novo campo de investigação recentemente inventado, "immunometabolism" 5, e foram acompanhados por estudos que implicam diferentes populações de células imunitárias, incluindo as células dendríticas, 6 7, mastócitos, células T 8 -10, as células B, células NK 11 12 13, eosinófilos e neutrófilos 14,15 no desenvolvimento da resistência à insulina associada a obesidade.

O objetivo deste artigo é a de proporcionar uma descrição pormenorizada da técnica de digestão de colagenase usada para isolar células da EM SVF e caracterizar ATMs e AT células T através de citometria de fluxo. Este protocolo foi otimizado para mouse AT, no entanto, os telespectadores podem se beneficiar da leitura de um excelente artigo que fornece muitos detalhes sobre a otimização da técnica para o ser humano aos 16 anos. O público-alvo deste artigo inclui investigadores com pouca experiência de trabalho com o mouse AT e realizando citometria de fluxo. Várias considerações práticas para equilibrar o rendimento ea viabilidade celular com o tempo e os recursos são apresentados, bem como os controles de citometria de fluxo ideais para a caracterização de populações de células imunes. Além do nosso protocolo, os leitores são remetidoed com um artigo recente da Jove Basu et al. uma excelente discussão de alguns dos aspectos técnicos da citometria de fluxo para incluir controles e compensações 17 adequadas.

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Protocol

1. Reagentes e Suprimentos

Antes de se iniciar este protocolo experimental, preparar os seguintes reagentes:

  1. 70% de etanol
  2. PBS 1X
  3. 1X DPBS (sem Ca e Mg), suplementado com 0,5% de BSA
  4. FACS buffer: 1X DPBS (sem Ca e Mg), EDTA 2 mM, e 1% de FCS
  5. ACK tampão: 150 mM de NH4Cl, 10 mM KHCO 3, e 0,1 mM Na 2 EDTA em água

2. A colheita e preparação do tecido adiposo

  1. Eutanásia camundongos de acordo com os procedimentos aprovados pela IACUC específicos de cada instituição.
  2. Molhe cuidadosamente a pele com álcool 70%.
  3. Faça uma incisão no nível do processo xifóide (parte inferior do esterno) e abrir a cavidade torácica para expor o coração, tomando cuidado para não cortar os vasos sanguíneos principais.

Nota: Neste ponto, é também útil a deixar intacto o diafragma tanto quantoe possível cortar um entalhe para fora do lado direito da caixa torácica para permitir que o sangue e perfusato a fluir para fora da cavidade torácica.

  1. Prenda o átrio direito para permitir que o sangue e perfusato para escapar do sistema circulatório.

Nota: Quando se trata de ratos obesos, o excesso de pericárdio EM podem precisar de ser removidas para permitir o acesso ao coração.

  1. Segure o coração com uma pinça e coloque delicadamente uma agulha no ventrículo esquerdo através do ápice. Lentamente perfundir o mouse com 15 ml estéril PBS.

Nota: reduzir a taxa de perfusão se os pulmões começam a encher e expandir.

  1. Abra a cavidade peritoneal e remover as bolsas de gordura perigonadal usando o cuidado de evitar qualquer tecido gonadal.
  2. Coloque bolsas de gordura em um barco pesar no gelo contendo 2 ml de 1X DPBS (sem Mg ou Ca), suplementado com 0,5% BSA, e picar a AT em pedaços finos.

Nota: Limite a quantidade de AT por pesar barco a 1,2 g. Se a quantidade de AT superior a 1,2 g, dividi-lo uniformemente entre dois pesam barcos.

  1. Manter as amostras em gelo e preparar 3 ml de solução de colagenase por digest EM amostra consistindo de 1X DPBS, suplementado com 0,5% de BSA, 10 mM de CaCl2, e 4 mg / mL de colagenase tipo II.

3. A digestão de colagenase

  1. Transferir AT a 50 ml por tubos cónicos vertendo o homogeneizado e enxaguar o barco pesar com 1 ml de DPBS (0,5% de BSA) e 3 ml de solução de digestão de colagenase II.
  2. Incubar a homogeneizado num agitador rotativo (200 rpm) a 37 ° C durante 20 min.
  3. Adicionar 10 ml DPBS (0,5% BSA) para tubos cônicos e colocar no gelo.
  4. Tritura-se homogeneizado de numerosas vezes usando uma pipeta de 10 ml serológica, as suspensões de células e passar através de um filtro de 100 um para um novo tubo de 50 ml.
  5. Centrifugar a suspensão de células a 500 xg durante 10 min a 4 & dpor exemplo; C.
  6. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células SVF em 3 ml de tampão de lise ACK para eritrócitos contaminantes.
  7. Adicionar 12 ml de tampão de FACS e suspensão de células de centrifugação a 500 xg durante 10 min a 4 ° C.
  8. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células SVF em tampão de FACS.

Nota: É o tamanho do agregado de células como um guia de quanto tampão FACS para ressuspender pol Se o pellet celular cobre a parte inferior do tubo de 50 mL cónico, utilize 0,5-1 mL de tampão de FACS, caso contrário, ressuspender em 0,25-0,5 ml.

  1. Coloque as amostras em gelo e preparar a aliquotas de diluição de 1:10 de cada amostra para a contagem de células por mistura de 40 ul de tampão de FACS, solução de azul de tripano ul 50 (0,2%), e 10 ul de suspensão de células.
  2. Contagem de células viáveis ​​com base na exclusão de azul de tripano e dilui-se suspensões de células a uma concentração final de 5-10 x 10 6 células / ml.

4. A coloração de antígenos de superfície celular

Adicionar CD16/CD32 anti-murganho de anticorpos (bloco de Fc) para uma concentração final de 0,5-1 μg/10 6 células, e incubar em gelo durante 10 min.
  • Amostras de transferência (≥ 10 6 células) para 12 x mm de poliestireno tubos de fundo redondo 75. Prepare tubos separados se analisar caixas eletrônicos e células T, e combinar células extra para preparar um número suficiente de tubos para acomodar a compensação necessária e fluorescência modificada menos um (FMO) controles.
  • Observação: Como um exemplo, quando a quantificação da proporção das ATMs baseado em F4/80 e CD11b, a seguinte compensação e controlos FMO terá de ser preparado

    - Não corado (células)

    - DAPI ou iodeto de propídio (PI), mancha única (células; não adicionar corante de viabilidade até que o passo 5.1)

    - F4/80 APC (células ou contas de compensação) única mancha

    - CD11b FITC células individuais da mancha (oucontas de compensação)

    - FMO 1 (células): + CD11b FITC corante de viabilidade de IgG2a de rato de controlo de isotipo κ APC + (adicionado no passo 5.1)

    - FMO 2 (células): F4/80 APC + κ IgG2b de rato de controlo de isotipo FITC corante de viabilidade + (adicionado no passo 5.1)

    1. Adicionar anticorpos primários fluoróforos e / ou controlos de isotipo para a concentração apropriada (ver Tabela de reagentes e materiais).
    2. Proteger as amostras da luz e incubar a 4 ° C durante 30 min.
    3. Adicionar 2 ml de tampão de FACS e suspensão de células de centrifugação a 500 xg durante 5 min a 4 ° C.
    4. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células SVF em 2 mL de tampão de FACS.
    5. Centrifugar a suspensão de células a 500 xg por 5 min a 4 ° C, e ressuspender o sedimento de células em SVF ≥ 400 ul de tampão de FACS.
    6. Transferir amostras de 12 x mm de poliestireno tubos de fundo redondo de 75 equipado com um filtro de células 35 mM tubo tops.
    7. Ao abrigo da luz, e as amostras de armazenar a 4 ° C até à análise por FACS.

    Nota: Para resultados óptimos as células devem ser analisados ​​immeadiately, no entanto, a análise de FACS com este protocolo foi realizado com sucesso em células marcadas armazenados em tampão de FACS durante 1-2 horas a 4 ° C. Se as células devem ser fixados para aumentar o tempo de armazenamento, as células marcadas podem ser fixadas com paraformaldeído a 2% a 4 ° C durante 24 horas antes da análise de FACS. Anticorpo empresas sugerem que as células marcadas podem ser armazenados durante até uma semana, no entanto, isto não foi testado no contexto do presente processo.

    5. Análise FACS

    1. Antes da análise por FACS, adicionar corante de viabilidade para as amostras e controlos apropriados para permitir a discriminação de células vivas / mortas.

    Observação: Vários corantes de viabilidade estão disponíveis comercialmente, mas DAPI e PI são recomendados, dependendo da excitação / emissão profiles dos anticorpos conjugados com fluoróforo utilizado. DAPI e iodeto de propídio são adicionados a cada amostra a uma concentração final de 0,2 mg / ml.

    1. Usar uma amostra de controlo negativo não corado, de preferência, células isoladas a partir do mesmo tecido, como as amostras experimentais, para ajustar de dispersão lateral (SSC) e de dispersão frontal (FSC), de modo a que a população de células (s) de interesse são em escala.

    Nota: Para a análise de EM células SVF, recomenda-se que SSC ser apresentado numa escala logarítmica vs FSC em uma escala linear. A utilização de uma escala logarítmica para SSC é especialmente importante para a análise dos ATM, que são frequentemente muito grandes e granulares.

    1. Desenhar um portão de dispersão de luz inicial com base no tipo de célula (s) a ser analisado, e ajustar o tubo fotomultiplicador (PMT), o ganho de modo que as células não coradas estão na extrema esquerda de um histograma de parâmetro único (aproximadamente centrada em 10 de 2) para os canais apropriados. </ Li>

    Nota: É recomendado que os linfócitos e macrófagos (ou outras células mielóides) ser analisada separadamente, devido a diferenças na autofluorescência.

    1. Use os controles manchadas individuais ou anticorpo de captura contas de compensação para realizar a compensação multi-color.

    Nota: Recomenda-se a utilização de contas de compensação, no entanto, a compatibilidade de cada anticorpo deve ser assegurada. Por exemplo, contas de compensação não pode reação cruzada com anticorpos de coelho, caso em que células isoladas são necessários para obter um controle da mancha único apropriado.

    1. Definir portões experimentais baseados em controles FMO modificados.
    2. Definir o citómetro de fluxo para recolher o número apropriado de acontecimentos com base na prevalência da população de interesse e gravar dados experimentais.
    3. Arquivos de dados de exportação FCS para análise offline. Existem vários programas disponíveis para cytometr fluxoanálise de dados y. Recomendamos Cytobank, uma plataforma baseada na web que permite investigatores para armazenar e analisar os dados e gerar dados a partir de qualquer computador com acesso à internet 18. Além disso, Cytobank oferece a capacidade de tornar acessíveis dados públicos ou restringir o acesso aos colaboradores.

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    Representative Results

    A colagenase seguido de digestão de EM por centrifugação diferencial foi usado para isolar o SVF de almofadas de gordura epididimal de ratos C57BL/6J machos alimentados com baixo teor de gordura (10% kcal de gordura) ou rica em gorduras (60% kcal de gordura), dieta (LFD e HFD , respectivamente) durante 16 semanas. Células do SVF foram então marcadas com anticorpos primários fluoróforos para quantificar a percentagem de ATMs viável (Figura 1) e AT células T (Figura 2) através de análise de FACS. Gating inicial, incluindo a dispersão da luz, a discriminação gibão, e os portões de viabilidade estão representados nas figuras 1A e 2A. Deve ser enfatizado que o portão de dispersão de luz inicial na Figura 2A é restrito à população de linfócitos, para evitar a inclusão de células mielóides autofluorescent. Um exemplo do uso modificado FMO controla para definir portas experimentais é mostrada na Figura 1B. Neste exemplo, o F4/80 (coluna da esquerda) e (coluna da direita) anticorpos CD11b são substituídos por controles isotipo apropriadas para dar conta de ligação autofluorescência e não específica. Portões Quadrant são então atraídos para identificar viável ATMs (F4/80 + CD11b +). Gating para CD4 + e CD8 + em células T é mostrado na Figura 2B. Viável AT linfócitos são os primeiros fechado para TCRβ (coluna da esquerda). Posteriormente, as células TCRβ + AT T são fechado para CD4 e CD8 (coluna da direita).

    Figura 1
    Figura 1. Macrófagos do tecido adiposo. SVF A foi isolado a partir do epidídimo EM de camundongos C57BL/6J machos alimentados com uma dieta rica em gordura ou de baixo teor de gordura, durante 16 semanas, utilizando o protocolo de digest da colagenase. Postequentemente, as células foram coradas para SVF F4/80 e CD11b e análise FACS foi realizada usando um citómetro de fluxo para identificar as ATMs. (A) dispersão de luz inicial e portões de viabilidade. (B) Modificado FMO controla incorporando anticorpos isotipo para F4/80 e CD11b foram usadas para alinhar quadrante portões. (C) A comparação da proporção de F4/80 + CD11b + ATMs dos AT de baixo teor de gordura e alto ratos alimentados com gordura. Clique aqui para ver a figura maior .

    Figura 2
    Figura 2. As células T do tecido adiposo. SVF A foi isolado a partir do tecido adiposo epididimal de ratos C57BL/6J machos alimentados com um baixo teor de gordura ou dieta rica em gordura durante 16 semanas utilizando tele colagenase protocolo digest. Subsequentemente, as células foram coradas para SVF TCRβ, CD4, e CD8a e análise FACS foi realizada usando um citómetro de fluxo para a caracterização EM células T. (A) dispersão de luz inicial e portões de viabilidade. (AC) A comparação da percentagem de células T TCRβ + (coluna da esquerda) e de células T CD4 + e CD8 + (coluna da direita) da EM de (B) e de baixo teor de gordura (C) elevada ratinhos alimentados com gordura. clique aqui para ver maior figura .

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    Discussion

    O interesse crescente no papel do sistema imunológico nas consequências metabólicas da obesidade levou à utilização generalizada de citometria de fluxo para caracterizar as células imunes do TA. Embora o protocolo exacto irá variar entre laboratórios com base na sua experiência e equipamentos disponíveis, os passos críticos incluem digestão com colagenase, a centrifugação diferencial, e o antigénio da superfície da célula de rotulagem. O objetivo do presente artigo é fornecer um protocolo detalhado e guia prático para o isolamento da AT SVF aos investigadores com pouca experiência de trabalho com a AT e / ou a realização de citometria de fluxo.

    Tal como acontece com qualquer técnica experimental, existem numerosas variações que podem ou não podem ter impacto significativo no resultado desejado. Com base na nossa experiência, o protocolo aqui detalhadas representa a troca entre o tempo mais eficiente, os recursos, o rendimento celular e viabilidade celular. Por exemplo, verificou-se que aumentando oduração da digestão da colagenase II a tanto quanto 60 min com concentrações semelhantes de colagenase tem um impacto insignificante na produtividade celular, assim, nós utilizamos uma digestão de 20 minutos, a fim de reduzir o tempo de exposição da colagenase. Colagenase II é a colagenase mais comumente usado para digestões de tecido adiposo. Uma descrição de todas as diferentes colagenases e seus usos primários podem ser encontrados no site da Sigma. Rendimentos celulares típicas do protocolo acima são de 2-3 x 10 6 e 4-5 x 10 6 células / g a partir de ratinhos alimentados com baixo teor de gordura (10% kcal de gordura) e de elevado teor de gordura (60% kcal de gordura) para dieta 16 semanas, respectivamente. Além de variar colagenase digere vezes, há uma série de potenciais modificações no protocolo de corrente, dependendo do modelo experimental a ser utilizada, incluindo o tratamento dietético. Em primeiro lugar, quando da retirada EM de ratinhos alimentados com uma dieta rica em ácidos gordos saturados ou de colesterol, evite manter as amostras em gelo antes da trituração porque o AT irá solidificar e tornar difícil picados. Em segundo lugar, o nosso protocolo inclui uma etapa de lise de eritrócitos (3,6), porém, a perfusão inicial de sucesso, muitas vezes faz com que este passo desnecessário. Em terceiro lugar, deve ser tomado cuidado para não incluir mais de 10 mM de CaCl2 para digerir a solução de colagenase (concentração final 5 mM); maiores concentrações de cálcio podem resultar na formação de um precipitado de fosfato de cálcio. Se esta forma precipitado a seguir ao passo de centrifugação inicial (3,5), adicionar dois passos de lavagem com 20 ml de tampão de FACS (contendo EDTA), antes do passo de lise de eritrócitos para remover o precipitado. Em quarto lugar, recomendamos que os investigadores usam toda, pelo menos uma almofada de gordura perigonadal ao isolar o SVF. Fazemos esta recomendação não por causa de limitações na produção de celulares, mas porque várias populações de células exibir diferentes distribuições regionais 19. Assim, os resultados podem ser influenciados quando apenas uma porção da almofada de gordura é perigonadal nósed para isolar células do sistema imunológico que residem no AT. Se toda a almofada de gordura é maior do que 1,2 gramas, dividir o tecido adiposo longitudinalmente a partir da rostral extremidades caudal. Se dividido em metade desta forma, cada metade deve fornecer uma população representativa de células e geralmente deve ser inferior a 1,2 gramas. No entanto, no caso em que este é ainda mais do que 1,2 gramas, recomendamos realizando digestões colagenase segmentos de 1,2 gramas em tubos separados, e em seguida da combinação de todas as células SVF para a citometria de fluxo. Além disso, para os ratos magros, pode ser necessário combinar a almofadas de gordura a partir de 2 ou 3 ratos para obter células SVF suficientes para a análise por citometria de fluxo. A necessidade de camundongos adicionais devem ser contabilizados ao projetar experimentos. Finalmente, uma outra maneira de apresentar os dados é o número de células por grama de tecido. Se a densidade de células é desejado, o AT deve ser ponderado antes da trituração e digestão.

    No que diz respeito à caracterização AT células SVF via citometria de fluxo, doisDeve ser enfatizado pontos. Primeiro, todos os anticorpos primários a fluoróforos, devem ser validados para uso com a AT células SVF e devidamente titulado. Embora tenhamos demonstrado a compensação com contas, tínhamos anteriormente titulada estes anticorpos com a AT SVF. Na caracterização dos macrófagos, não é recomendável a utilização de corantes em tandem (por exemplo, PE-Cy7), como já tinha resultados mistos em relação à ligação não específica de ATM, quando da utilização de anticorpos conjugados com estes corantes. Além disso, fluoróforos, tais como PE e FITC só devem ser usados ​​após titulação cuidadosa, tal como descrito acima. A lista dos anticorpos específicos que vulgarmente utilizados para caracterizar a AT células SVF, juntamente com as concentrações recomendadas pode ser encontrado na fornecida na Tabela 1. Em segundo lugar, porque ATMs exibem forte autofluorescência e um número de anticorpos apresentar um baixo nível de ligação não-específica, quando usado em uma alta concentração, recomendamos o uso de modificação FMO controla para definir portas experimentais.Controlos FMO são gerados através da coloração de um conjunto de amostras de controlo com todos menos um dos anticorpos usados ​​para etiquetar as amostras experimentais 20. Nós modificamos os controles FMO em nosso protocolo para substituir um dos anticorpos com um controle de isotipo fluoróforo conjugado apropriado ao invés de simplesmente removê-lo. Na prática, pode ser aceitável renunciar controles FMO para anticorpos que proporcionam excepcional separação entre as populações positivas e negativas. Em adição a estes controlos, notará que, antes de propagação nos anticorpos, para pré-seleccionar populações de linfócitos e macrófagos com base em dispersão frontal e lateral. Isto vai eliminar a detecção de macrófagos autofluorescent ao analisar populações de linfócitos com fluoróforos, tais como FITC e corantes em tandem.

    Embora os protocolos detalhados estão além do escopo deste artigo, a técnica de isolamento descrito serve como um primeiro passo importante para inúmeras técnicas que visam característicasterizing células do sistema imunológico que residem no AT. Por exemplo, o isolamento de cima e protocolo de coloração podem ser utilizados para facilitar a separação de populações específicas de ARNm a partir do qual pode ser isolado para análise da expressão do gene. Além disso, as modificações simples para o protocolo pode ser feita para permitir o tratamento ex vivo de ATMs. Tais modificações que incluem utilizando técnicas estéreis obter o SVF, que seriam então lavadas duas vezes e novamente suspensas num meio de cultura de células apropriadas. Em vez de adicionar anticorpos fluoróforos para corar os antigénios da superfície das células, o SVF podem ser adicionados às placas de cultura de tecidos não tratados para enriquecer para ATM através de aderência ao plástico (embora isto não possa ser reclamada a uma população pura como os fibroblastos e os pré-adipócitos também podem aderir ). Isto é realizado através da cultura do SVF para 2-4 horas a 37 ° C, seguido por dois passos de lavagem para remover as células não aderentes. ATMs pode, então, ser tratado como tal e colhida utilizando uma dissociação celular baseado em EDTA paraSolução para citometria de fluxo ou lisadas em tampão RIPA Trizol ou para o isolamento de ARN ou proteína, respectivamente. Independentemente da aplicação a jusante, a técnica digest colagenase para isolar adipócitos e células SVF primeiro descritos por Rodbell em 1964 1 continua a ser uma ferramenta valiosa para a caracterização da AT células do sistema imunológico e sua contribuição para as conseqüências metabólicas da obesidade.

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    Disclosures

    Não temos nada a divulgar.

    Acknowledgements

    JSO é apoiado por um NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040), AK é apoiado por uma bolsa de pós-doutorado da American Diabetes Association (7-10-MI-05), e AHH é apoiado por um Heart Association Award americano Investigator Fundada (12EIA8270000). Experimentos de citometria de fluxo foram realizadas no VMC Citometria de Fluxo de Recursos Compartilhados. O VMC Citometria de Fluxo de recursos partilhada é apoiado pelo Digestive Disease Research Center Vanderbilt (DK058404).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml Life Technologies 14190-250
    DAPI Life Technologies D3571
    BSA Sigma A2153-100G
    collagenase Sigma C6885-5G
    propidium iodide solution Sigma P4864-10 ml
    stable stack 20 microliter Rainin SS-L10
    20 microliter filter tips Rainin SRL10F
    stable stack 250 microliter tips Rainin SS-L250
    1000 microliter tips Rainin GPS-L1000
    1000 microliter filter tips Rainin GP-L1000F
    250 microliter Filter Tips Rainin SR-L200F
    FC Block BD Biosciences 553142
    fisher 100mn strainers Fisherbrand 22-363-549
    medium weigh dish Fisherbrand 02-202B
    aluminum foil Fisherbrand 1213100
    mincing scissors Fisherbrand 089531B
    Vortex Fisherbrand 2215365
    50 ml conical tubes BD Falcon 14-959-49A
    filter top FACS tubes BD Falcon 352235
    10 ml pipette case 200 BD Falcon 1367520
    round bottom tubes BD Falcon 352058
    5 ml syringe BD Falcon 309646
    V Bottom Plates Costar 07-200-107
    transfer bulb pipette Thermo Scientific 13-711-22
    Shaker Thermo Scientific 11 676 071
    Adhesive mat Thermo Scientific 1368750
    Cell Culture Centrifuge Sorvall 75253839
    Adapters Sorvall 75003723
    Rat anti-mouse CD16/CD32 BD Biosciences 553142 Concentration: 0.5 - 1 μg/ 106 cells
    Rat anti-mouse F4/80 eBioscience 17-4801 Fluorophore conjugate: APC
    Concentration: 0.2 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: 17-4321
    Rat anti-mouse CD11b eBioscience 11-0112 Fluorophore conjugate: FITC
    Concentration: 0.5 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: 11/1/4031
    Armenian Hamster anti-mouse CD11c eBioscience 12-0114 Fluorophore conjugate: PE
    Concentration: 0.8 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: Dec-88
    Goat anti-mouse MGL1/2 R&D Systems FAB4297P Fluorophore conjugate: PE
    Concentration: 0.1 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: IC108P
    Goat anti-mouse CD206 R&D Systems FAB2535P Fluorophore conjugate: PE
    Concentration: 0.1 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: IC108P
    Rat anti-mouse CCR2 R&D Systems FAB5538P Fluorophore conjugate: PE
    Concentration: 0.1 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: IC013P
    Armenian Hamster anti-mouse TCRβ BD Biosciences 553174 Fluorophore conjugate: APC
    Concentration: 0.2 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: 553956
    Rat anti-mouse CD8a BD Biosciences 552877 Fluorophore conjugate: PE-Cy7
    Concentration: 0.8 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: 552784
    Rat anti-mouse CD4 BD Biosciences 557956 Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700
    Concentration: 0.2 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: 557963

    Table 1. List of Materials and Reagents.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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