Isolering av fettvev immunceller

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Fettvev (AT) er et område med intens immun celle aktivering og interaksjon. Nesten alle celler i immunsystemet er tilstede i AT og deres forhold er endret av fedme. Riktig isolasjon, kvantifisering, og karakterisering av AT immun celle populasjoner er avgjørende for å forstå sin rolle i immunometabolic sykdom.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Orr, J. S., Kennedy, A. J., Hasty, A. H. Isolation of Adipose Tissue Immune Cells. J. Vis. Exp. (75), e50707, doi:10.3791/50707 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Oppdagelsen av økt makrofaginfiltrering i fettvev (AT) av overvektige gnagere og mennesker har ført til en intensivering av interesse i immunceller bidrag til lokal og systemisk insulinresistens. Isolering og kvantifisering av ulike immun celle populasjoner i mager og obese AT er nå en vanligvis benyttes teknikk i immunometabolism laboratorier, men ekstrem forsiktighet må tas både i stromal vaskulær celle isolasjon og i flowcytometri analyse, slik at data innhentet er pålitelig og tolkbare . I denne videoen viser vi hvordan du kjøttdeig, fordøye, og isolere immun celle-beriket stromal vaskulær brøk. Deretter viser vi hvordan du antistoff label makrofager og T-lymfocytter og hvordan du riktig gate på dem i flowcytometri eksperimenter. Representative flowcytometri plott fra lave fett-matet mager og høy fett-matet overvektige mus er gitt. Et kritisk element i denne analysen er bruk av antistoffer som gjørikke fluoresce i kanaler der AT makrofager er naturlig autofluorescent, samt bruk av riktig kompensasjon kontroller.

Introduction

Historisk har fettvev (AT) blitt sett på som en inert organ av lipid lagring, noe som utvider seg og trekker i respons til energibalansen. Nå forstår vi at AT representerer et dynamisk endokrine organ som aktivt utskiller en rekke hormoner, som direkte påvirker spiseatferd og systemisk glukose homeostase. I tillegg, det siste tiåret har det vært en økende forståelse for de mange bestander av immunceller bosatt i AT stromal vaskulær fraksjon (SVF), samt deres bidrag til AT homeostase.

Evnen til å skille AT adipocyte og SVF bruker en collagenase fordøye etterfulgt av differensial sentrifugering ble først beskrevet av Rodbell i 1964 en. Collagenase II er oftest brukt for adipocyte og SVF separasjon på grunn av vedlikehold av adipocyte insulin reseptorer en. Tidlig på, enzymatisk fraksjonering av AT ble primært brukt til å studere adipocyte metabolismen og å isolere preadipocytes. Mer nylig har denne teknikken, kombinert med den utbredte tilgjengeligheten av flowcytometere og den stadig økende antall kommersielt tilgjengelige fluorophore-konjugerte antistoffer, til rette for karakterisering av AT immunceller.

Selv om tilstedeværelsen av immunceller i betent på hadde vært beskrevet tidligere 2, seminal artikler av Weisberg, et al. og Xu et al. publisert i 2003 var de første til å dokumentere opphopning av AT makrofager (minibanker) i fedme, som skiller inflammatoriske cytokiner og korrelerer med AT-spesifikke og systemisk insulinresistens 3,4. Disse observasjonene tjente som grunnlag for et nytt felt med etterforskning nylig innførte, "immunometabolism," 5 og har blitt fulgt opp av studier implicating ulike immun celle populasjoner, inkludert dendrittiske celler 6, mastceller 7, T-celler 8 -10, B-celler 11, NKT celler 12, eosinofile 13, og nøytrofile 14,15 i utviklingen av fedme assosiert insulinresistens.

Målet med denne artikkelen er å gi en detaljert beskrivelse av collagenase fordøye teknikk som brukes for å isolere celler av AT SVF og å karakterisere minibanker og ved T-celler via flow cytometri. Denne protokollen er optimalisert for mus AT, men kan seerne nytte av å lese en utmerket artikkel som gir omfattende detalj på optimalisering av denne teknikken for menneskelig AT 16. Målgruppen for denne artikkelen omfatter etterforskere med begrenset erfaring med musen AT og utføre flowcytometri. Flere praktiske hensyn for å balansere mobilnettet yield og levedyktighet med tid og ressurser blir presentert samt optimale flowcytometri kontroller for å karakterisere AT immun celle populasjoner. I tillegg til protokollen vår, leserne er referred en fersk Jove artikkel av Basu et al. for en utmerket diskusjon av noen av de tekniske aspektene ved flowcytometri å inkludere forsvarlig kontroll og kompensasjoner 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Reagenser og rekvisita

Før oppstart av denne eksperimentelle protokollen, forberede følgende reagenser:

  1. 70% etanol
  2. 1X PBS
  3. 1X DPBS (uten Ca og Mg) supplementert med 0,5% BSA
  4. FACS-buffer: 1X DPBS (uten Ca og Mg), 2 mM EDTA, og 1% FCS
  5. ACK-buffer: 150 mM NH4Cl, 10 mM 3 KHCO, og 0,1 mM Na EDTA i vann 2

2. Høsting og klargjøring av fettvev

  1. Avlive mus henhold til IACUC-godkjente prosedyrer som er spesifikke for den enkelte institusjon.
  2. Grundig våt pels med 70% etanol.
  3. Gjør et snitt på nivå med xiphoid prosess (nedre del av brystbenet) og åpne brysthula å utsette hjertet, tar seg ikke å bryte noen store blodkar.

Bemerk: Ved dette punktet, er det også nyttig å la membranen intakt så myemulig, og for å kutte et hakk ut av den høyre side av brystkassen for å tillate blod og perfusatet for å strømme ut av brysthulen.

  1. Klipp høyre atrium slik at blod og perfusate å unnslippe sirkulasjonssystemet.

Merk: Når du arbeider med overvektige mus, overflødig perikardiale AT må fjernes for å gi tilgang til hjertet.

  1. Ta tak i hjerte med pinsett og forsiktig sette inn en nål inn i venstre hjertekammer gjennom apex. Sakte perfuse musen med 15 ml sterilt PBS.

Merk: Redusere frekvensen av perfusjon dersom lungene begynner å fylle og utvide.

  1. Åpne bukhulen og fjerne perigonadal fett pads med forsiktighet for å unngå eventuelle gonadale vev.
  2. Plasser fett pads i en veie båt på is som inneholder 2 ml 1X DPBS (uten Mg eller Ca) supplert med 0,5% BSA, og hakke AT i fine biter.

Merk: Begrens mengden AT per veie båt til 1,2 g. Hvis mengden av AT overstiger 1,2 g, dele det jevnt mellom to veier båter.

  1. Lagres ved prøvene på is og forberede 3 ml collagenase digest løsning per AT prøve bestående av 1X DPBS supplert med 0,5% BSA, 10 mM CaCl 2 og 4 mg / ml kollagenase type II.

3. Collagenase Fordøyelse

  1. Overfør AT til 50 ml koniske rør ved å helle homogenat og skylle veie båt med 1 ml DPBS (0,5% BSA) og 3 ml collagenase II fordøye løsning.
  2. Inkuber ved homogenat i en roterende rister (200 rpm) ved 37 ° C i 20 min.
  3. Tilsett 10 ml DPBS (0,5% BSA) til koniske rør og legg på is.
  4. Triturer homogenat flere ganger ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette, og cellesuspensjoner passere gjennom 100 pm filter inn i et nytt 50 ml konisk rør.
  5. Sentrifuger cellesuspensjon ved 500 xg i 10 min ved 4 & df.eks; C.
  6. Dekanter supernatanten og resuspender SVF cellepellet i 3 ml ACK buffer for å lyse forurensende erytrocytter.
  7. Tilsett 12 ml FACS-buffer og sentrifuger cellesuspensjon ved 500 xg i 10 min ved 4 ° C.
  8. Dekanter supernatanten og resuspender SVF cellepellet i FACS buffer.

Merk: Bruk av størrelsen på cellepelleten som en veiledning for hvor mye FACS-buffer for å resuspendere i. Hvis cellepelleten dekker bunnen av 50 ml konisk rør, bruk 0,5-1 ml FACS-buffer, ellers resuspender i 0,25-0,5 ml.

  1. Plasser prøvene på is og forberede fortynning på 1:10 alikvoter av hver prøve for Celletellingen ved å blande 40 ul FACS-buffer, 50 pl trypanblått-oppløsning (0,2%), og 10 ul cellesuspensjon.
  2. Telle levedyktige celler basert på trypan blå eksklusjon og fortynn cellesuspensjoner til en endelig konsentrasjon på 5-10 x 10 6 celler / ml.

4. Farging av celleoverflateantigener

Legg anti-mus antistoff CD16/CD32 (Fc-blokk) til en endelig konsentrasjon på 0,5-1 μg/10 6 celler og inkuber på is i 10 min.
  • Transfer prøver (≥ 10 6 celler) til 12 x 75 mm polystyren rund bunn rør. Utarbeide egne rør hvis analysere minibanker og T-celler, og kombinere ekstra cellene til å forberede et tilstrekkelig antall rør for å imøtekomme den nødvendige korreksjoner og modifisert fluorescens minus en (FMO) kontroller.
  • Merk: Som et eksempel, når vil kvantifisere andelen av minibanker basert på F4/80 og CD11b, følgende kompensasjon og FMO kontroller må være forberedt:

    - Unstained (celler)

    - DAPI eller propidium jodid (PI) enkeltstående flekken (celler, ikke legg levedyktighet fargestoff til trinn 5.1)

    - F4/80 APC enkelt flekk (celler eller kompensasjon perler)

    - CD11b FITC enkelt flekk (celler ellerkompensasjon perler)

    - FMO 1 (celler): Rat IgG2a κ isotype kontroll APC + CD11b FITC + levedyktighet fargestoff (lagt ved trinn 5.1)

    - FMO 2 (celler): F4/80 APC + Rat IgG2b κ isotype kontroll FITC + levedyktighet fargestoff (lagt ved trinn 5.1)

    1. Legg fluorofor-konjugerte primære antistoffer og / eller isotype kontroller ved passende konsentrasjoner (se tabell av reagenser og materialer).
    2. Beskytt prøver fra lys og inkuber ved 4 ° C i 30 min.
    3. Tilsett 2 ml FACS-buffer og sentrifuger cellesuspensjon ved 500 xg i 5 min ved 4 ° C.
    4. Dekanter supernatanten og resuspender SVF cellepellet i 2 ml FACS buffer.
    5. Sentrifuger cellesuspensjon 500 xg i 5 min ved 4 ° C, og resuspender SVF cellepelleten i ≥ 400 pl FACS buffer.
    6. Overføre prøver til 12 x 75 mm polystyren rund bunn rør utstyrt med en 35 mikrometer celle sil tube topper.
    7. Beskytte mot lys, og lagre prøver ved 4 ° C inntil FACS-analyse.

    Merk: For optimale resultater celler bør analyseres immeadiately, men har FACS analyse med denne protokollen blitt gjennomført på merkede celler lagret i FACS buffer for 1-2 timer ved 4 ° C. Dersom cellene må festes for å øke lagringstid, kan merkede celler festes med 2% paraformaldehyd ved 4 ° C i 24 t før FACS-analyse. Antistoff selskaper antyder at merkede celler kan lagres i opp til en uke, men dette har ikke blitt testet innen rammen av denne fremgangsmåte.

    Fem. FACS Analyse

    1. Før FACS analyse, legger levedyktighet fargestoff til prøver og nødvendige kontroller for å tillate for live / død celle diskriminering.

    Merk: Mange levedyktighet fargestoffer er kommersielt tilgjengelig, men DAPI og PI anbefales avhengig av eksitasjon / utslipp profiles av fluorofor-konjugerte antistoffer som brukes. DAPI og propidium jodid blir tilsatt til hver prøve ved en endelig konsentrasjon på 0,2 mg / ml.

    1. Bruk en unstained negativ kontrollprøve, fortrinnsvis celler isolert fra samme vev som de eksperimentelle prøver, for å justere side scatter (SSC) og fremover scatter (FSC), slik at cellen befolkningen (r) av interesse er på skalaen.

    Merk: For analyse av AT SVF celler, anbefales det at SSC skal vises i en logg skala versus FSC i en lineær skala. Bruken av en log skala for SSC er spesielt viktig når analysere minibanker, som ofte er svært store og kornete.

    1. Tegn en innledende lysspredning gate basert på type celle (r) som blir analysert, og juster fotomultiplikatorrør (PMT) gevinst slik at unstained cellene er helt til venstre med en én-parameter histogrammet (ca. sentrert på 10 2) for de riktige kanalene. </ Li>

    Merk: Det anbefales at lymfocytter og makrofager (eller andre myeloide celler) analyseres separat skyldes forskjeller i autofluorescence.

    1. Bruk enkle farget kontroller eller antistoff fangst kompensasjon perler til å utføre multi-color kompensasjon.

    Merk: Bruken av kompensasjon perlene anbefales, men må kompatibiliteten av hvert antistoff sikres. For eksempel kan erstatning perlene ikke kryssreagerer med kanin-antistoffer, og i så fall isolerte celler er nødvendig for å oppnå en passende enkelt flekk kontroll.

    1. Sett eksperimentelle porter basert på modifiserte FMO kontroller.
    2. Sett strømningscytometeret å samle riktig antall hendelser basert på utbredelsen av befolkningen av interesse og registrere eksperimentelle data.
    3. Eksport FCS datafiler for offline analyse. Det finnes mange programmer tilgjengelig for flyt cytometry dataanalyse. Vi anbefaler Cytobank, en web-basert plattform som tillater investigatores å lagre og analysere data og generere tall fra hvilken som helst datamaskin med Internett-tilgang 18. I tillegg tilbyr Cytobank muligheten til å gjøre data offentlig tilgjengelig eller begrense tilgangen til samarbeidspartnere.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Collagenase fordøyelsen av AT etterfulgt av differensial sentrifugering ble brukt til å isolere SVF fra bitestiklenes fett pads av mannlige C57BL/6J mus matet en lav fett (10% kcal fra fett) eller høy fett (60% kcal fra fett) diett (LFD og HFD , henholdsvis) i 16 uker. Celler av den SVF ble deretter merket med fluorofor-konjugerte primære antistoffer for å kvantifisere andelen av levedyktige minibanker (figur 1), og ved T-celler (figur 2) via FACS analyse. Initial gating, inkludert lysspredning, dublett diskriminering, og levedyktighet porter er avbildet i figur 1A og 2A. Det bør understrekes at den første lyssprednings-porten på figur 2A er begrenset til den Lymfocyttpopulasjonen for å unngå å inkludere autofluorescent myeloide celler. Et eksempel på bruk av modifiserte FMO kontrollene til å angi eksperimentelle porter er vist i figur 1B. I dette eksempelet F4/80 (venstre kolonne) og CD11b (høyre kolonne) antistoffer er erstattet med passende isotype kontroller til kontoen for autofluorescence og ikke-spesifikk binding. Quadrant porter blir dratt for å identifisere levedyktig minibanker (F4/80 + CD11b +). Gating for CD4 + og CD8 + T-celler AT er vist i figur 2B. Levedyktig AT lymfocytter er første gated for TCRβ (venstre kolonne). Deretter TCRβ + AT T-celler er gated for CD4 og CD8 (høyre kolonne).

    Figur 1
    Figur 1. Fettvev makrofager. Den SVF ble isolert fra epididymal AT av mannlige C57BL/6J mus matet en lav fett eller høy fett diett i 16 uker ved hjelp av collagenase fordøye protokollen. Etterfølgendequently ble SVF celler farget for F4/80 og CD11b og FACS analyse ble utført ved hjelp av et flowcytometer å identifisere minibanker. (A) Initial lysspredning og levedyktighet porter. (B) Endret FMO styrer innlemme isotype antistoffer for F4/80 og CD11b ble brukt til å justere kvadrant porter. (C) Sammenligning av andelen F4/80 + CD11b + minibanker fra AT av magre og høy fett matet mus. Klikk her for å se større figur .

    Figur 2
    Figur 2. Fettvev T-celler. Den SVF ble isolert fra epididymal fettvev av mannlige C57BL/6J mus matet en lav fett eller høy fett diett i 16 uker ved hjelp av than collagenase fordøye protokollen. Deretter ble cellene farget for SVF TCRβ, CD4, og CD8a og FACS-analyse ble utført ved hjelp av et strømningscytometer for å karakterisere ved T-celler. (A) Initial lysspredning og levedyktighet porter. (BC) Sammenligning av andelen av TCRβ + T-celler (venstre kolonne) og av CD4 + og CD8 + T-celler (høyre kolonne) fra AT ifølge (B) fettfattig og (c) fettrik matet mus. klikk her se større figur .

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Økende interesse for rollen av immunsystemet i de metabolske konsekvensene av fedme har ført til utbredt bruk av flowcytometri å karakterisere immunceller i AT. Selv om den eksakte protokollen vil variere mellom laboratorier basert på egen erfaring og tilgjengelig utstyr, de kritiske trinnene omfatter collagenase fordøyelsen, differensial sentrifugering, og celleoverflateantigen merking. Målet med denne artikkelen er å gi en detaljert protokoll og praktisk guide for isolering av AT SVF til etterforskere med begrenset erfaring med AT og / eller utføre flowcytometri.

    Som med alle eksperimentell teknikk, er det mange varianter som kan eller ikke kan ha betydelig innvirkning på ønskede resultatet. Basert på vår erfaring, representerer protokollen beskrevet i dette dokumentet den mest effektive kompromisset mellom tid, ressurser, cellular yield, og celle levedyktighet. For eksempel har vi funnet ut at å økeVarigheten av kollagenase II fordøyelse til så mye som 60 min ved tilsvarende konsentrasjoner av kollagenase har en ubetydelig virkning på cellulær utbytte; således anvender vi en 20 min fordøyelse for å redusere lengden av collagenase eksponering. Collagenase II er den mest brukte collagenase for fettvevssykdommer digestions. En beskrivelse av alle de forskjellige collagenases og deres primære bruksområder kan bli funnet på Sigma hjemmeside. Typiske mobilnettet gir fra ovennevnte protokollen er 2-3 x 10 6 og 4-5 x 10 6 celler / g AT fra mus matet en lav fett (10% kcal fra fett) og høy fett (60% kcal fra fett) diett for 16 uker, henholdsvis. I tillegg til å fordøye varierende kollagenase-tider, er det et antall mulige modifikasjoner av den aktuelle protokoll, avhengig av den eksperimentelle modell som brukes, inkludert dietetisk behandling. Først når høsting AT fra mus matet en diett beriket for kolesterol eller mettet fettsyrer, unngå å holde prøvene på is før hakking fordi AT vil stivne og gjøre hakking vanskelig. Sekund, omfatter en protokoll erytrocytt lysis trinn (3.6), men en vellykket første perfusjon ofte gjør dette trinnet nødvendig. Tredje, forsiktighet må utvises for ikke å tilsette mer enn 10 mM CaCl 2 til collagenase fordøye-løsning (5 mM endelig konsentrasjon); større kalsiumkonsentrasjoner kan resultere i dannelsen av en kalsium-fosfat utfelling. Dersom dette bunnfall dannes etter den innledende sentrifugering trinn (3.5), tilsett to vasketrinn med 20 ml FACS-buffer (inneholdende EDTA) forut for erytrocytt lysis trinn for å fjerne bunnfallet. Fjerde, anbefaler vi at etterforskere bruke minst én hel perigonadal fett puten når isolere SVF. Vi gjør denne anbefalingen ikke på grunn av begrensninger i mobilnettet avkastning, men fordi ulike celle populasjoner vise ulike regionale fordelinger 19. Således kan resultatene bli forspent når bare en del av den perigonadal fett puten er ossed å isolere immunceller bosatt i AT. Hvis hele fett puten er større enn 1,2 gram, dele fettvev lengderetningen fra rostral til kaudale ender. Ved delt i to på denne måten, bør hver halvdel gi en representativ populasjon av celler og bør generelt være mindre enn 1,2 gram. Imidlertid, i det tilfellet at dette fremdeles er mer enn 1,2 gram, anbefales det å utføre kollagenase digestions på 1,2 gram-segmenter i separate rør, og deretter å kombinere alle de SVF celler for strømningscytometri. I tillegg, for magre mus, kan det være nødvendig å kombinere fett pads fra 2 eller 3 mus for å oppnå den mengde SVF celler for flowcytometrisk analyse. Behovet for flere mus skal regnskapsføres ved utforming eksperimenter. Endelig er en annen måte å vise dataene antall celler per gram vev. Hvis celletetthet er ønsket bør AT veies før male og fordøyelse.

    I forhold til å karakterisere AT SVF celler via flowcytometri, topunkter skal vektlegges. Først bør alle fluorophore-konjugert primære antistoffer bli godkjent til bruk med AT SVF celler og riktig titreres. Selv om vi demonstrert kompensasjon med perler, hadde vi tidligere titreres disse antistoffene med AT SVF. Når karakterisere de makrofager, anbefaler vi mot bruk av tandem fargestoffer (f.eks PE-Cy7), som vi har hatt blandede resultater med hensyn til ikke-spesifikk binding av minibanker når du bruker antistoffer konjugert til disse fargestoffer. I tillegg bør fluoroforer, slik som PE og FITC kun brukes etter forsiktig titrering slik det er beskrevet ovenfor. En liste over spesifikke antistoffer vi brukte for å karakterisere AT SVF celler sammen med anbefalte konsentrasjoner kan finnes i den medfølgende i tabell 1. Sekund, fordi minibanker utstillingen sterk autofluorescence og en rekke antistoffer viser et lavt nivå av ikke-spesifikk binding når det brukes på en høy konsentrasjon, anbefaler vi bruk av modifisert FMO kontrollene til å angi eksperimentelle porter.FMO kontroller er generert ved farging et sett av kontrollprøver med alle unntatt én av de antistoffer som brukes til å merke eksperimentelle prøver 20. Vi har endret FMO kontrollene i protokollen vår for å erstatte en av antistoffer med en passende fluorophore-konjugert isotype kontroll snarere enn bare å fjerne den. I praksis kan det være akseptabelt å gi avkall FMO kontroller for antistoffer som gir eksepsjonelt god atskillelse mellom positive og negative populasjoner. I tillegg til disse kontrollene, vil du merke at før gating på antistoffer, forhåndsvelger vi for lymfocytter og makrofager populasjoner basert på fremover og side scatter. Dette vil eliminere påvisning av autofluorescent makrofager når analysere lymfocyttpopulasjoner med fluorophores som FITC og tandem fargestoffer.

    Selv om detaljerte protokoller er utenfor omfanget av denne artikkelen, serverer isolasjon teknikk beskrevet som et viktig første skritt for mange teknikker rettet mot karakterisertterizing immunceller bosatt i AT. For eksempel kan den ovenfor isolasjon og farging protokoll benyttes for å lette sortering av spesifikke populasjoner som mRNA kan isoleres for å analysere genekspresjon. I tillegg kan små endringer i protokollen bli gjort for å tillate ex vivo behandling av minibanker. Slike modifikasjoner ville omfatte å benytte sterile teknikker for å oppnå den SVF, som da ville bli vasket to ganger og resuspendert i en passende cellekulturmedier. Snarere enn å legge fluorophore-konjugerte antistoffer å farge celleoverflateantigener kan SVF legges til ikke-behandlede vevskulturplater å berike for minibanker via plast etterlevelse (selv om dette ikke kan hevdes å være en ren befolkningen som fibroblaster og preadipocytes kan også følge ). Dette oppnås ved dyrking av SVF i ​​2-4 timer ved 37 ° C, etterfulgt av to vasketrinnene for å fjerne ikke-adherente celler. Minibanker kan deretter behandles deretter og høstes ved hjelp av en EDTA-basert celledissosieringsmedium sårensning for flowcytometri eller lysert i RIPA-buffer Trizol eller for isolering av RNA eller protein, henholdsvis. Uavhengig av nedstrøms søknaden, fortsetter collagenase fordøye teknikk for å isolere adipocytes og SVF celler først beskrevet av Rodbell i 1964 en å være et uvurderlig verktøy for karakterisering av AT immunceller og deres bidrag til de metabolske konsekvensene av fedme.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Vi har ingenting å avsløre.

    Acknowledgements

    JSO er støttet av en NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040), er AK støttet av en postdoktorstilling fra American Diabetes Association (7-10-MI-05), og AHH er støttet av en American Heart Association Etablert Investigator Award (12EIA8270000). Flowcytometri eksperimenter ble utført i VMC flowcytometrisystemer delt ressurs. VMC flowcytometrisystemer delt ressurs støttes av Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml Life Technologies 14190-250
    DAPI Life Technologies D3571
    BSA Sigma A2153-100G
    collagenase Sigma C6885-5G
    propidium iodide solution Sigma P4864-10 ml
    stable stack 20 microliter Rainin SS-L10
    20 microliter filter tips Rainin SRL10F
    stable stack 250 microliter tips Rainin SS-L250
    1000 microliter tips Rainin GPS-L1000
    1000 microliter filter tips Rainin GP-L1000F
    250 microliter Filter Tips Rainin SR-L200F
    FC Block BD Biosciences 553142
    fisher 100mn strainers Fisherbrand 22-363-549
    medium weigh dish Fisherbrand 02-202B
    aluminum foil Fisherbrand 1213100
    mincing scissors Fisherbrand 089531B
    Vortex Fisherbrand 2215365
    50 ml conical tubes BD Falcon 14-959-49A
    filter top FACS tubes BD Falcon 352235
    10 ml pipette case 200 BD Falcon 1367520
    round bottom tubes BD Falcon 352058
    5 ml syringe BD Falcon 309646
    V Bottom Plates Costar 07-200-107
    transfer bulb pipette Thermo Scientific 13-711-22
    Shaker Thermo Scientific 11 676 071
    Adhesive mat Thermo Scientific 1368750
    Cell Culture Centrifuge Sorvall 75253839
    Adapters Sorvall 75003723
    Rat anti-mouse CD16/CD32 BD Biosciences 553142 Concentration: 0.5 - 1 μg/ 106 cells
    Rat anti-mouse F4/80 eBioscience 17-4801 Fluorophore conjugate: APC
    Concentration: 0.2 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: 17-4321
    Rat anti-mouse CD11b eBioscience 11-0112 Fluorophore conjugate: FITC
    Concentration: 0.5 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: 11/1/4031
    Armenian Hamster anti-mouse CD11c eBioscience 12-0114 Fluorophore conjugate: PE
    Concentration: 0.8 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: Dec-88
    Goat anti-mouse MGL1/2 R&D Systems FAB4297P Fluorophore conjugate: PE
    Concentration: 0.1 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: IC108P
    Goat anti-mouse CD206 R&D Systems FAB2535P Fluorophore conjugate: PE
    Concentration: 0.1 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: IC108P
    Rat anti-mouse CCR2 R&D Systems FAB5538P Fluorophore conjugate: PE
    Concentration: 0.1 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: IC013P
    Armenian Hamster anti-mouse TCRβ BD Biosciences 553174 Fluorophore conjugate: APC
    Concentration: 0.2 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: 553956
    Rat anti-mouse CD8a BD Biosciences 552877 Fluorophore conjugate: PE-Cy7
    Concentration: 0.8 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: 552784
    Rat anti-mouse CD4 BD Biosciences 557956 Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700
    Concentration: 0.2 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: 557963

    Table 1. List of Materials and Reagents.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).
    2. Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-induced yellow fat disease in rats. III. Lipolysis in affected adipose tissue. Veterinary Pathology. 15, 544-548 (1978).
    3. Weisberg, S. P., et al. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1796-1808 (2003).
    4. Xu, H., et al. Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1821-1830 (2003).
    5. Mathis, D., Shoelson, S. E. Immunometabolism: an emerging frontier. Nature Reviews. Immunology. 11, 81 (2011).
    6. Stefanovic-Racic, M., et al. Dendritic cells promote macrophage infiltration and comprise a substantial proportion of obesity-associated increases in CD11c+ cells in adipose tissue and liver. Diabetes. 61, 2330-2339 (2012).
    7. Liu, J., et al. Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice. Nature Medicine. 15, 940-945 (2009).
    8. Feuerer, M., et al. Lean, but not obese, fat is enriched for a unique population of regulatory T cells that affect metabolic parameters. Nature Medicine. 15, 930-939 (2009).
    9. Nishimura, S., et al. CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity. Nature Medicine. 15, 914-920 (2009).
    10. Winer, S., et al. Normalization of obesity-associated insulin resistance through immunotherapy. Nature Medicine. 15, 921-929 (2009).
    11. Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610-617 (2011).
    12. Wu, L., et al. Activation of invariant natural killer T cells by lipid excess promotes tissue inflammation, insulin resistance, and hepatic steatosis in obese mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109. 1143-1152 (2012).
    13. Wu, D., et al. Eosinophils sustain adipose alternatively activated macrophages associated with glucose homeostasis. Science. 332, 243-247 (2011).
    14. Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding. Journal of Lipid Research. 49, 1894-1903 (2008).
    15. Talukdar, S., et al. Neutrophils mediate insulin resistance in mice fed a high-fat diet through secreted elastase. Nature Medicine. 18, 1407-1412 (2012).
    16. Hagman, D. K., et al. Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing. Journal of Immunological Methods. 386, 50-59 (2012).
    17. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
    18. Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Current Protocols in Cytometry. Chapter 10, Unit 10 (2010).
    19. Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100, e47-e57 (2007).
    20. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45, 194-205 (2001).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics