הנדסת רקמות: בנייה תאית 3D פיגום למשלוח גיליונות סלולריים שכבות

1School of Engineering, University of California, Merced
Published 10/03/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets. J. Vis. Exp. (92), e51044, doi:10.3791/51044 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

רקמות רבות, כגון לב האדם הבוגר, אינן מסוגלות להתחדש כראוי לאחר נזק. 2,3 אסטרטגיות בהנדסת רקמות להציע חידושים על מנת לסייע לגוף בהתאוששות ותיקון. לדוגמא, גישות TE ייתכן שתוכלנה להחליש לב שיפוץ לאחר אוטם שריר הלב (MI) ואולי להגדיל את סך תפקוד לב לרמתו ערב MI הנורמלי ליד. 4 כמו בכל רקמה פונקציונלית, התחדשות מוצלחת של רקמת לב כרוכה באספקה ​​הנאותה של סוגי תאים מרובים עם רמזים סביבתיים העדפת אינטגרציה והישרדות של שתל תא / רקמה המושתלת. רקמות מהונדסות צריכים להתייחס פרמטרים רבים, כולל: אותות מסיסים, אינטראקציות תא אל התא, וחומרי מטריצה ​​הוערכו ככלי רכב משלוח, ההשפעות שלהם על הישרדות תא, חוזק חומרים, וסיוע של ארגון תא אל רקמות. מחקרי העסקת ההזרקה הישירה של תאי שתל רק להתעלם היסודות החיוניים האלה. 2,5,6עיצוב רקמת שילוב מרכיבים אלו טרם פיתח. כאן, אנו מציגים דוגמא לעיצובים משולבים באמצעות שכבות של יריעות תא בדוגמת עם שני סוגים שונים של חומרים המופקים ביולוגיים המכילים את סוג תא איבר המטרה ותאי האנדותל לשיפור היווצרות כלי דם חדש ב" הרקמה ". למרות שהמחקרים האלה מתמקדים בדור של כמו לב רקמות, עיצוב רקמה זו יכול להיות מיושם על איברים רבים אחרים מאשר לב עם שינויים בעיצוב וחומר מינימאליים, והוא אמור להיות מוצר מהמדף לטיפולי משובי. הפרוטוקול מכיל חמישה שלבים מפורטים. טמפרטורת פולי הרגישים (-isopropylacrylamide N) (pNIPAAM) משמשת למאכלי תרבית רקמת מעיל. לאחר מכן, תאי רקמה ספציפית בתרבית על פני השטח של לוחות מצופים / משטחי micropattern כדי ליצור גיליונות תא עם הידבקויות לרוחב חזקות. שלישית, מטריצת בסיס נוצרה לרקמה על ידי שילוב של מטריצה ​​נקבובית עם permissi neovascularve הידרוג ותאי האנדותל. לבסוף, גיליונות התא הם הרימו ממנות pNIPAAM המצופים והועברו למרכיב הבסיס, מה שהופך את המבנה השלם.

Protocol

.1 יצירה של צלחות מצופות pNIPAAM

  1. ממיסים את g 2.6 של pNIPAAM ב2 מ"ל של פתרון הקסאן / 40% 60 טולואן%.
  2. מחממים את התערובת ל60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות עוררו, עד pNIPAAM נמס.
  3. לחתוך נייר סינון לתוך מעגל 60 מ"מ קוטר ונייר מקום במשפך בוכנר.
  4. סנן את הפתרון דרך המשפך בוכנר לתוך כוס הזכוכית שקל מראש (לא להשתמש בפלסטיק, כהקסאן ימס פלסטיק).
  5. מניחים את הכוס והתוכן לתוך ואקום פעמון O (24 psi) / N (16 hr). הערה: עד השאריות הוא הגיב עם איזופרופיל זה יהיה לחמצן כדי לוודא זה לא בא במגע עם חמצן.
  6. לשקול את הכוס להקים את המשקל של pNIPAAM.
  7. להוסיף באלכוהול רפואי לpNIPAAM, יצירת 50/50 w / w פתרון.
  8. מניחים 2 מ"ל של הפתרון על פני השטח של צלחת תרבית הרקמה, ומעיל למשך 5 דקות תחת אור UV.
  9. לשטוף את הצלחת עם 2 מ"ל של PBS החם פעמייםלפני השימוש בתרבית תאים.

.2 יצירת גיליונות סלולריים

הערה: גיליונות תא של תאים ראשוניים לאיבר המטרה יכולים להיות שנוצרו באמצעות מספר השיטות שונות, או על ידי ציפוי משטחי תרבית רקמה עם פולימר תרמו מגיב כפי שמתואר כאן. צלחות תרמו רגיש טרום מצופים מוצעות גם על ידי מספר הספקים.

הערה: פרוטוקול זה מיועד לתרבות באמצעות צלחת 35 מ"מ. בקצרה, תאים מודגרת ראשון על 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימאלית של 24 שעות בנקודת המפגש ליצור חיבורי רוחב בין תאים סמוכים. לשחרר גיליונות תא, צלחות חשופים לטמפרטורות מתחת 32 ° C. גיליון התא הוא הועבר לאחר מכן למטריצה ​​הסיבית הבסיס החזק המכילה הידרוג'ל מתירנית neovascular עם תאי האנדותל של כלי דם.

  1. לבודד את אוכלוסיית התאים. הערה: שיטה זו תלויה בנהלי גזירת פרט ואת הסוג של תאים. mu החלק אב העורקים עכברושתאי scle (RASMC) משמשים בדוגמא זו. אלה הם תאי שריר חלק עיקריים מבודדים מאב העורקים בבטן של חולדה.
  2. שוטף את התאים עם 2 מ"ל של PBS החם.
  3. הוסף 3 מ"ל של טריפסין (או ביקוע / פתרון disassociating אחר) לתאים למשך 5 דקות.
  4. לעכב טריפסין על ידי התוספת של 3 מ"ל של התקשורת והתרבות, או פתרון חיץ פוספט (PBS) המכיל 10% בסרום שור עוברי (FBS).
  5. לאסוף את התאים בצינור חרוטי ולספור aliquot.
  6. ספין התאים ב 1,000 סל"ד (228 XG) במשך 5 דקות.
  7. לשאוב supernatant ו resuspend התאים בתקשורת הצמיחה שלהם (בינוני תרבות SmGM2 בתוספת ערכת כדור משמש לRASMC).
  8. הנח את המדיה המכילה את התאים על צלחת 35 מ"מ תרמו רגישה - צלחת מצופה pNIPAAM בריכוז שישיג 100 מפגש%. הערה: לקבלת RASMCs המספר שנקבע להיות 100,000 תאים / 2 סנטימטר. עם זאת, כתוצאה מאובדן של תאים במהלך החולף, 120% מva ש משמש lue.
  9. מקום לתוך חממה על 37 מעלות CO / N. שים לב: חשוב לשמור על התאים ב37 ° C כדי לשמור על הידבקות התא לצלחת.

.3 הכנה של מטריקס המכונן

הערה: מטריצות סיבי 3D שונים ניתן להשתמש כדי שכבת מטריצה ​​סיבית חזקה בין סדיני תא העדינים. כמה דוגמאות כוללות: gelfoam, bioglass, חומרי acellularized טבעיים 26 או nanospun חומרי 27,28 המטריצה ​​חזירי שתן בשלפוחית ​​השתן (UBM) משמשת במחקרים אלה סופקה בנדיבות ממשתף הפעולה שלנו, ד"ר Badylak 29.

  1. לפני שימוש, לקבוע מאפייני מטריצה ​​כולל חוסר התוכן סלולארי אם נעשה שימוש במטריצה ​​decellularized, 27,28 כדאיות ספציפית תא, וחלל הריק. 22
  2. חותך את המטריצה ​​מעוקרת מראש לגודל וצורה רצויים. הערה: כאן, ניקוב חורים משמש לחיתוך עיגול בקוטר 4 מ"מ.
ve_title "> 4. תאי האנדותל זריעה לNeovascular מתירנית Hydrogel

הערה: ניתן להשיג תאי האנדותל ממגוון רחב של מקורות, כולל בידול מתאי גזע או אב. כאן, HUVECs משמש.

  1. השתמש בכל זמן כמו בפעם cross-linking הידרוג'ל יתר (הפיברין, ג'ל קולגן) הוא קצר מספיק כדי לאפשר לתאים להישאר בת קיימא. שים לב: כאן, ג'ל hyaluronan (HA) המבוסס צולב עם גשר דיסולפיד משמש.
  2. הכן את הידרוג'ל HA בהתאם לפרוטוקול החברה.
  3. לאסוף את תאי האנדותל ולפזר לפתרון תא בודד באמצעות טריפסין 1x. הערה: Accutase או תא דיסוציאציה הצפת יכול לשמש גם לפיזור תא בודד.
  4. לבטל את אנזים טריפסין על ידי שימוש בכמות שווה של מעכבי טריפסין הסויה (אם זה חשוב כי תאים אינם באים במגע עם סרום) או 10 FBS% PBS, איסוף הפתרון / צינור חרוטי תאים לתוך 15 מ"ל.
  5. Count התאים, ולחשב את הנפח הדרוש לממדי התיקון (לכמת בעבר). הערה: לקבלת תיקון 4 מ"מ, המשמשים כאן 2 מיליון תאי האנדותל.
  6. חלץ 2 מיליון תאים, ומקום לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל חדש.
  7. ספין ב( 228 XG) במשך 5 דקות.
  8. לשאוב supernatant, עוזב את התאים כגלולה בצינור חרוטי.
  9. מערבבים את החומרים נוזליים HA וטין ב1: מנת 1. לאחר מכן להוסיף 80% מהנפח הכולל לתוך צינור חרוטי המכיל גלולה.
  10. Resuspend תאי אנדותל ב1: 1 HA / התערובת לטין
  11. מניחים את התאים התלויים בתערובת HA / לטין לתוך המטריצה ​​הסיבית הבסיס מהשלב 2.
  12. הוספת 1/5 (20 אחוזים) מכלל הנפח הרצוי של צולב מקשר
  13. דגירה של השעה 1 ב37 מעלות צלזיוס.

.5 בידוד של גיליונות סלולריים

  1. הסר את הצלחות שטופלו pNIPAAM 35 מ"מ המכילות את התאים מן החממה והמקום במכסת מנוע תרבית תאים בRT.
  2. במהירות לשאוב את התקשורת מהתאים, ולהוסיף 2 מ"ל של 6% ג'לטין הרגיל שחומם ל37 מעלות צלזיוס.
  3. בעוד ג'לטין הוא עדיין חם, מניח את סריג המתכת לתוך ג'לטין, והשקיע אותה מתחת לפני השטח של ג'לטין הרגיל (סרט 1).
  4. מניחים את הצלחת כולה על גבי קרח למשך 5 עד 7 דקות, המאפשר את הג'לטין להקשיח.
  5. לאחר 7 דקות, להשתמש במרית כדי להפריד בזהירות את קצות ג'לטין מהצד השני של הצלחת, ולאחר מכן להשתמש במלקחיים כדי להרים את סריג המתכת מהערת הצלחת: ג'לטין 6%, וגיליון התא צריך להרים עם הסריג.
  6. הזז את גיליון התא לצלחת ומניח על גבי שילוב מטריצה-הידרוג'ל הבסיס סיבי, הגדרת הרשת בראש המבנה בזהירות. הערה: צד הפסגה של גיליון התא עדיין יהיה במיקום העליון.
  7. הוסף 2 מ"ל של תקשורת החמה (37 מעלות צלזיוס).
  8. דגירה O / N המאפשר הגיליון של תאים לדבוק פני השטח הידרוג'ל.
  9. הסר tהוא סריג מתכת לאחר הפתרון מחמם (כ 1 שעה), או ביום שלמחרת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תרשים הזרימה (איור 1) מראה את השיטה הכוללת של מה שהופך את התיקון רב שכבתי. גיליונות תא מנותקים מהצלחת טופלה pNIPAAM על ידי הטלת הטמפרטורה מתחת 32 ° C. אז גיליון התא ממוקם בחלקו העליון של הידרוג'ל הצולב המכיל את תאי האנדותל זורעים לתוך המטריצה ​​הבסיסית סיבית (איור 1). גם הצלחות תרמו רגיש pretreated יכולות לשמש ליצירת גיליונות התא. משטחי טופולוגי מיוחדים המשמשים לדפוס באופן ספציפי (כלומר, ליישר) התאים 30.

המטריצה ​​הסיבית הבסיס יכולה להיות שנוצרה מdecellularizing מטריצת רקמת יליד או electrospun. הנה, גיליון החומר הסיבי נחתך לקוטר 4 מ"מ לבסיס התיקון (איור 2 א). האפיון של חומר זה הוא חשוב לקביעת הסכום של הידרוג'ל שיכול לשמש כדי למלא את החללים ריקים. המטריצה ​​משמשת כאן כבר previouערמומי מאופיין ופורסם. 22

הידרוג המכיל תאי האנדותל הוא לאחר היישום של הרכיבים נוזלי הידרוג'ל HA למטריצה ​​הסיבית צולב. מיקרוסקופ פלואורסצנטי / שידור מציג תאי חיים מוכתמים בCalcein AM (איור 2), שכבר נתפס בהידרוג'ל הצולב.

התהליך של יצירת גיליון התא הוא הדמיה (איור 3), הכולל השוואה בין הצלחות שלנו מצופות pNIPAAM והצלחות מראש מצופים שנרכשו מספק. RASMC הם מצופים על פני השטח pNIPAAM טופל לפחות 16 שעות על 37 מעלות צלזיוס. מינימום זמן זה מאפשר לתאים להקים הידבקויות הדייר לרוחב שלהם עם תאים שכנים (איור 3 א). הערה: התאים חייבים להיות בנקודת המפגש להקים דיירים לרוחב אלה. לאחר culturing לפחות 16 שעות, הצלחת של תאים חייבת להיות עברה לRT לירידה מתחת 32 ° C, ושימוש בf הקרחאו 5-8 דק 'מאיץ את תהליך הקירור (איור 3 ב). הירידה בטמפרטורה משנה את זווית מגע קונפורמציה של ציפוי החומר המאפשר גיליון התא כדי להרים את הצלחת. איור 3 ג מציג את הרמת גיליון תא מהצלחת.

צלחות מצופים במעבדה עבדו טוב, אחרי כמה אופטימיזציה, ליצירה והעברת גיליונות התא. איור 4D תערוכות monolayer ומחוברות של RASMC לפני ההעברה. כאשר התאים הורשו להרים, הגיליונות נטו לקפל ולדחוף לעצמו (3E איור). למעשה, מניפולציה של גיליונות התא בpNIPAAM שנוצר בבית או אלו שנרכשו היו קשים ולעתים קרובות הביאו לקריעה של הגיליונות (איור 3F). לכן, פתרון להעברת הגיליונות פותח. ברגע שהתאים יוסרו מהחממה ולהתחיל קרירים, 6 ג'לטין% שימש לכיסוי התאים עם l מתכת נוסףattice מוטבע בתוך ג'ל (איור 3G). כצלחת מקוררת, התאים הרימו, ואת הג'לטין מתקשה. בעזרת מלקחיים, גיליון הסריג ותא gelatin- ניתן להסיר יחד מצלחת התרבות; כולם באותו הזמן (איור 3H). ואז שלושת מרכיבים אלה ממוקמים על גבי מבנה בסיס (איור 3I). הנה, גיליון התא (ורוד) הוא הרבה יותר גדול מהמטריצה ​​הבסיסית הבסיס (מטריצה ​​לבנה עבה מתחת לסדין התא הוורוד). גיליון התא בקלות יכול להיות מטופח לגודל.

תיקון התא הסופי (איור 4) נוצר על ידי שכבות גיליון התא על גבי מורכב מתבצע בבסיס התיקון והידרוג'ל מתירנית. מלמטה למעלה, את התיקון מורכב ממטריצה ​​סיבית זרע עם הידרוג'ל hyaluronan המכיל את תאי אנדותל, ולאחר מכן את גיליון תא שכבות על גבי מטריצה ​​זו. מוקדם מנסה לתפעל את גיליונות התא ללא השימוש בג'לטין / Appar הסריגatus הביא סדיני תא קטנים מאוד, כי לעתים קרובות מקופל ונקרעו (איור 4A-D מבט מלמעלה). איור 4 א מייצג תמונה מוקדמת תיקון עיצוב מורכב המשלבת אדום Mitotracker הצבוע RASMC (איור 4), HUVECs ניאון הירוק AM calcein (איור 4C), והתמונה מועברת אור (איור 4D). 10x תמונות קרובים יותר מסופקות לגיליון התא וHA / Hydrogel בלי מטריצה ​​(איור 4E-H). איור 4E הוא השילוב של אדום mitotraker (איור 4F), HUVECs Calcein AM הירוק (איור 4G) והאור המועבר ( איור 4H). המבט מלמטה (מטריצת בסיס, HA / HUVEC), ותמונות גיליון תא של כל רכיב הוא מופע בדמויות 4I-L. התמונות המשולבות היא איור 4I, עם החלקים הבודדים המיוצגים באיור 4J-L, sh איור 4JOWS גיליון התא (אדום), תאי האנדותל (הירוקה) הם באיור 4K, ותמונת ההילוכים (איור 4L) התמונה המורכבת (איור 4M) מציגה את התיקון עם תא גיליון אחיד המכסה את כל השטח של מטריקס ללא כל קיפול או קריעה. איורים 4M-P הם גם מהחלק התחתון ומסתכל אל המטריצה. איור 4N הוא גיליון התא, המכיל אדום ניטרלי. שוב, רצועות אדומות עבות להופיע סביב המטריצה ​​כי הגיליון מקפל באזורים אלה ישירות בסמוך לקצה של המטריצה. הדמיה העברת אור (איור 4O) מציגה את המורפולוגיה של התאים, ואת המבנה של המטריצה. לבסוף (איור 4P), יש לו את המטריצה ​​איכות מיוחדת של fluorescing באותו אורך הגל כמו DAPI. לכן, עירור אולטרה סגול של המטריצה ​​משמש לבבירור לראות את הכתובת נפרדת מגיליון התא (אדום בוהק). הקצוות של התיקון יכולים להיות מטופחים ללהסיר כל קצות הגיליון שתלויים מעל הקצוות של המטריצה.

איור 1
תרשים 1 זרימת איור של רקמות עצרת. ניידים גליונות נוצרים על ידי זריעת תאים על גבי הצלחות מצופות pNIPAAM thermoresponsive, ומאפשר מספיק זמן לתאים להגיע למפגש וליצור חיבורים לרוחב לתאים שכנים. גיליון התא הוא שוחרר על ידי הפחתת הטמפרטורה (דיסק צהוב). במקביל, תאי האנדותל מוטמעים בהידרוג'ל HA מתירנית neovascular, מוזרקים לתוך חלל חללים של המטריצה ​​הסיבית בסיס חזק יותר, ו( לבן דיסק) כימי crosslinked. גיליון התא (דיסק צהוב) הוא אז שכבתי עם שילוב מטריצת אנדותל (הלבן), לפי צורך. אנא לחץ כאן כדילהציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2 תמונות של בסיס מטריצה ​​והאנדותל Encapsulation. () המטריצה ​​הסיבית הבסיס החזק היא אגרוף לצורה עגולה. כאן מ"מ 4 בקוטר משמש מבוסס על המודל של בעלי החיים in vivo. HUVECs (B) מוכתם בירוק Mitotracker (Calcein AM) תלוי בהידרוג HA על פני השטח של מטריצת הבסיס (10X). אנא לחץ כאן כדי להציג גדול יותר גרסה של נתון זה.

איור 3
איור 3 יצירת גיליונות ניידים. () RASMC גתמונת ultured על pNIPAAM טופל 35 מ"מ מנות ל16 שעה (10X). (B) RASMC הוסר לאחר הצבת הצלחת על קרח למשך 5-7 דקות. (C) של הקצה של גיליון תא שחרור מנרכש באופן מסחרי צלחת thermoresponsive תרבית תאים (10X). תמונות (DF) מתארות תוצאות דומות לדור של גיליונות תא ממנות מצופות pNIPAAM בבית שנוצר. (D) והמחוברות RASMC גדל על 35 מ"מ צלחות תרבית רקמה סטנדרטית (4X). (E ) לאחר הקירור, גיליונות התא התכווצו ומקופלים כפי שהם מנותקים (4X). (F) בשל השברירי של הגיליון מהתא הבודד, גיליונות התא לעתים קרובות נפגעו במהלך ההרמה או מניפולציות אחרות (4X). (G) ב כדי למתן נקבים בגיליון התא, מסך מתכת שימש כתמיכה פיזית כדי לסייע בהעברת גיליונות התא. RASMC היו מוכתם באדום ניטרלי, מכוסה ב6 ג'לטין% ותמיכת מסך נקבובי מתכת,nd יורשה להקשיח. (H) עם התמיכה במסך, גיליונות תא מועברים עם נזק מינימאלי (4X). (I) שכבה גדולה RASMC גיליון תא (צבע ורוד) הייתה אז ממוקמת על גבי שילוב הבסיס חזק יותר הסיבי תיקון-הידרוג'ל (חץ). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
.4 תמונות דמותו של רובד נייד תיקון. תאים בתרבית על משטח pNIPPAM המצופה ולאחר מכן עברו כגיליון אל פני השטח של המטריצה ​​הסיבית. ניסויים מוקדמים שלא הועברו עם סריג ג'לטין / המתכת הביאו לתיקונים קטנים מרופטים (AD). (א) תמונה: משולב ל( BD),(ב) RASMCs בשני גיליונות מוכתמים בMitotracker אדום, וHUVECs (C) מוכתם בירוק, ו( ד ') באור מועבר. (E) תמונה מורכבת של תא גיליון בשילוב עם שילוב המטריצה-הידרוג'ל הסיבי בסיס חזק יותר המכיל Calceing AM מוכתם HUVECs (ירוק), ו( F) Mitotracker האדום RASMCs. (G) HUVECs ניאון הירוק תלוי בהידרוג'ל. (H) הילוכים תמונה של שילוב המטריצה-הידרוג'ל הסיבי בסיס חזק יותר. תמונה (I) Composite מסתכלת מ תחתון של התיקון כלפי מעלה באמצעות המטריצה ​​הסיבית בסיס חזק יותר (לא מוכתם), HA המכיל HUVECs (ירוק), וגיליון תא של RASMCs (אדום), בהתאמה. (J) גיליון RASMCs הניאון אדום, כפי שניתן לראות דרך מטריצת סיבי הבסיס שילוב הידרוג'ל. (K) HUVECs ניאון הירוק. (L) תמונת הילוכים של מבנה התיקון.תמונה: משולב לתא גליונות (אדום) על בסיס שילוב מטריצה-הידרוג'ל סיבי (autofluorescent הכחול) (ז). תאים (N) בעמוד השער של הקרינה הבסיס הסיבית מטריקס-הידרוג'ל מופע שילוב המוגבר בקצוות נובעת אגידה של התאים. (O) שידור תמונה של המבנה. (P) מטריצת בסיס סיבית טבעית autofluorescent בDAPI (אורך גל כחול). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

סרט 1. התהליך של העברת הגיליונות של תאים מודגש בסרט המשלים שהוגש עם המסמך. מופעי הסרט, בתהליך צעד חכם, הסרת התאים מן החממה; החלפה של התקשורת עם ג'לטין 6%, ההחדרה של המסך דואר מתכת, מצמרר של התאים על קרח, העברת התאים מהצלחת pNIPAAM המצופה לצלחת אחרת, תמונה של התאים במהלך העברה, ולבסוף הסרת המסך מגיליון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השלבים הקריטיים בפרוטוקול כוללים: ציפוי משטחי צלחת עם פולימר thermoresponsive ומניפולציה של גיליונות התא לאחר קירור הצלחות. מכיוון שתאים שונים להציג תכונות פיזיות שונות, כמו adhesivity, זמן ההרמה צריך להיות מותאם לכל סוג תא אחר. המרכיב השני, ורוב מאתגר באופן משמעותי של פרוטוקול זה, מתמקד במניפולציה של גיליון התא, היבט קריטי של שיטות להרכבת רקמה. שכבת התא בודדת בגיליון התא היא די שבירה ויכולה לקרוע בקלות אם מניפולציות עם מלקחיים. יתר על כן, כאשר גיליונות התא אינם מוחזקים במקום, הם נוטים להתכווץ ויכולים לקפל בקלות. העברת גיליון תא המוצעת באמצעות מסך תומך מסייעת למניפולציה של גיליון התא השביר.

המתודולוגיה העיצוב שהוצגה בכתב היד הזה מספקת גישת עלות נמוכה למדי ליצירת גיליון תא עבור מגוון רחב של appli הנדסת רקמותקטיונים. יתר על כן, יצירת לוחות pNIPAAM מצופה בתוך מעבדה באוניברסיטה יכולה להיות אחיד בשיטה זו ושינויים בפרוטוקול יכול להתבצע כדי להכיל סוגים שונים של תאים, ומשטחים. השימוש בגיליונות תא, ולא תאים בודדים לא מאורגנים, מסייע הרכבה רקמות, וגם עלול להגביר את הסבירות להישרדות ואינטגרציה של רקמות מושתלות. עם זאת, בשיטת vivo המשלוח (שלא צוינה בפרוטוקול זה) של מבנים אלה צריכים להיות מותאמים לכל סוג רקמה. יישומים עתידיים כוללים חקירות ומתודולוגיות מותאמות ליצירת רקמות למערכות איברים ספציפיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Calcein-AM Invitrogen C3099 Cell tracker / live dye
Lysotracker Red Invitrogen L7528 Cell tracker
Neutral Red Sigma N7005 Visible Cell dye
pNIPAAM Sigma Aldrich 412780250 Poly(N-isopropylacrylamide)
Toluene Sigma Aldrich 244511-1L
Hexane Sigma Aldrich 296090-1L
RAOSMC Lonza R-ASM-580 Rat Aortic Smooth Muscle Cells
SmGM2 Lonza CC-4149 Smooth Muscle Media
HUVEC Invitrogen C-003-5C Human Venous Endothelial Cells
HyStem Glycosan/Biotime
Isopropyl alcohol VWR International BDH1133-4LP
Trypsin Corning Cellgro 25-053-C1
PBS Gibco 14287-072
FBS Gibco 16140-071
Specific Equipment
Filter paper Ahlstrom  6310-0900 
Buchner Funnel  Sigma Aldrich  Z247308 
UpCell Plates  Nunc  2014-11 
UV light Jelight Company  UVO Cleaner Model No.42

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ohashi, K., Okano, T. Functional tissue engineering of the liver and islets. Anat Rec (Hoboken). 297, 73-82 (2014).
  2. Chen, Q. Z., Harding, S. E., Ali, N. N., Lyon, A. R., Boccaccini, A. R. Biomaterials in cardiac tissue engineering: Ten years of research survey. Mat Sci Eng R. 59, 1-37 (2008).
  3. Jakob, P., Landmesser, U. Current status of cell-based therapy for heart failure. Curr Heart Fail Rep. 10, 165-176 (2013).
  4. Tongers, J., Losordo, D. W., Landmesser, U. Stem and progenitor cell-based therapy in ischaemic heart disease: promise, uncertainties, and challenges. Eur Heart J. 32, 1197-1206 (2011).
  5. Etzion, S., et al. Influence of embryonic cardiomyocyte transplantation on the progression of heart failure in a rat model of extensive myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 33, 1321-1330 (2001).
  6. Masuda, S., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering for heart tissue repair. Adv Drug Deliv Rev. 60, 277-285 (2008).
  7. Koh, G. Y., Soonpaa, M. H., Klug, M. G., Field, L. J. Strategies for myocardial repair. J Interv Cardiol. 8, 387-393 (1995).
  8. Li, R. K., et al. Construction of a bioengineered cardiac graft. J Thorac Cardiovasc Surg. 119, 368-375 (2000).
  9. Muller-Ehmsen, J., et al. Rebuilding a damaged heart: long-term survival of transplanted neonatal rat cardiomyocytes after myocardial infarction and effect on cardiac function. Circulation. 105-1720 (2002).
  10. Reinecke, H., Zhang, M., Bartosek, T., Murry, C. E. Survival, integration, and differentiation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts. Circulation. 100-193 (1999).
  11. Roell, W., et al. Cellular cardiomyoplasty improves survival after myocardial injury. Circulation. 105, 2435-2441 (2002).
  12. Soonpaa, M. H., et al. Potential approaches for myocardial regeneration. Ann N Y Acad Sci. 752, 446-454 (1995).
  13. Akins, R. E. Can tissue engineering mend broken hearts. Circ Res. 90, 120-122 (2002).
  14. Goodell, M. A., et al. Stem cell plasticity in muscle and bone marrow. Ann N Y Acad Sci. 938, 208-218 (2001).
  15. Menasche, P., et al. Myoblast transplantation for heart failure. Lancet. 357, 279-280 (2001).
  16. Murry, C. E., Wiseman, R. W., Schwartz, S. M., Hauschka, S. D. Skeletal myoblast transplantation for repair of myocardial necrosis. J Clin Invest. 98, 2512-2523 (1172).
  17. Orlic, D., et al. Transplanted adult bone marrow cells repair myocardial infarcts in mice. Ann N Y Acad Sci. 938, 221-229 (2001).
  18. Elia, R., et al. Silk-hyaluronan-based composite hydrogels: a novel, securable vehicle for drug delivery. J Biomater Appl. 27, 749-762 (2013).
  19. Kai, D., et al. Stem cell-loaded nanofibrous patch promotes the regeneration of infarcted myocardium with functional improvement in rat model. Acta Biomater. (2014).
  20. Hong, H. J., et al. Tracheal reconstruction using chondrocytes seeded on a poly(l-lactic-co-glycolic acid)-fibrin/hyaluronan. J Biomed Mater Res A. (2014).
  21. Serpooshan, V., et al. The effect of bioengineered acellular collagen patch on cardiac remodeling and ventricular function post myocardial infarction. Biomaterials. 34, 9048-9055 (2013).
  22. Turner, W. S., et al. Cardiac tissue development for delivery of embryonic stem cell-derived endothelial and cardiac cells in natural matrices. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100, 2060-2072 (2012).
  23. Sato, M., Yamato, M., Hamahashi, K., Okano, T., Mochida, J. Articular cartilage regeneration using cell sheet technology. Anat Rec (Hoboken). 297, 36-43 (2014).
  24. Sawa, Y., Miyagawa, S. Present and future perspectives on cell sheet-based myocardial regeneration therapy. Biomed Res Int. 2013, 583912 (2013).
  25. Demirbag, B., Huri, P. Y., Kose, G. T., Buyuksungur, A., Hasirci, V. Advanced cell therapies with and without scaffolds. Biotechnol J. 6, 1437-1453 (2011).
  26. Song, J. J., Ott, H. C. Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds. Trends Mol Med. 17, 424-432 (2011).
  27. Badylak, S. F., et al. The use of extracellular matrix as an inductive scaffold for the partial replacement of functional myocardium. Cell Transplant. 15, Suppl 1. S29-S40 (2006).
  28. Wang, Y., et al. Lineage restriction of human hepatic stem cells to mature fates is made efficient by tissue-specific biomatrix scaffolds. Hepatology. 53, 293-305 (2011).
  29. Gilbert, T. W., et al. Collagen fiber alignment and biaxial mechanical behavior of porcine urinary bladder derived extracellular matrix. Biomaterials. 29, 4775-4782 (2008).
  30. Luna, J. I., et al. Multiscale biomimetic topography for the alignment of neonatal and embryonic stem cell-derived heart cells. Tissue Eng Part C Methods. 17, 579-588 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats