Engenharia de Tecidos: Construção de um multicelular 3D andaime para a entrega de camadas celulares Sheets

Bioengineering

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Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets. J. Vis. Exp. (92), e51044, doi:10.3791/51044 (2014).

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Abstract

Muitos tecidos, como os corações humanos adultos, são incapazes de se regenerar adequadamente após a lesão. 2,3 Estratégias em engenharia de tecidos propor inovações para ajudar o corpo a recuperação e reparação. Por exemplo, as abordagens TE pode ser capaz de atenuar a remodelação cardíaca após infarto do miocárdio (IM) e, possivelmente, aumentar a função cardíaca total a um próximo nível pré-MI normal. 4 Tal como acontece com qualquer tecido funcional, regeneração bem sucedida do tecido cardíaco envolve a entrega dos vários tipos de células com sinais ambientais que favoreçam a integração e sobrevivência do enxerto de células / tecido implantado. Tecidos artificiais devem abordar vários parâmetros, incluindo: sinais solúveis, interações célula-célula, e materiais de matriz avaliados como veículos de entrega, os seus efeitos sobre a sobrevivência da célula, resistência do material, e facilitação de organização célula-tecido. Estudos empregando a injeção direta de células do enxerto apenas ignorar esses elementos essenciais. 2,5,6Um projeto de tecidos combinando esses ingredientes ainda tem de ser desenvolvido. Aqui, apresentamos um exemplo de projetos integrados que utilizam camadas de folhas de células padronizadas com dois tipos distintos de materiais biológicos derivados contendo o tipo de célula para órgãos-alvo e células endoteliais para aumentar a formação de novos vasos no "tecido". Embora esses estudos concentram-se na geração de tecido cardíaco semelhante, este projeto tecido pode ser aplicado a muitos outros do que o coração com design e material alterações mínimas órgãos, e é destinado a ser um produto off-the-shelf para terapias regenerativas. O protocolo contém cinco etapas detalhadas. Uma temperatura de poli sensível (N -isopropylacrylamide) (PNIPAAm) é usado para placas de cultura de tecidos revestimento. Em seguida, as células são cultivadas de tecido específico sobre a superfície das placas revestidas / superfícies micropattern para formar camadas de células com aderências laterais fortes. Em terceiro lugar, uma matriz de base, é criado para o tecido através da combinação de matriz porosa com Permissi neovascularve hidrogéis e células endoteliais. Finalmente, as folhas de células são levantados a partir dos pratos PNIPAAm revestidos e transferido para o elemento de base, fazendo com que a construção completa.

Protocol

1 Criação de placas PNIPAAm revestidas

  1. Dissolve-se o 2,6 g de PNIPAAm em 2 ml de uma solução de hexano a 60% de tolueno / 40%.
  2. Aquecer a mistura a 60 ° C durante 10 minutos agitou-se, até que a PNIPAAm é dissolvido.
  3. Cortar papel de filtro para um círculo de diâmetro 60 mm e coloque o papel no funil de Buchner.
  4. Filtrar a solução através de Buchner Funil para a pré-pesado copo de vidro (não use plástico, como o hexano vai derreter plásticos).
  5. Colocar a proveta e o conteúdo para um vácuo de sino (24 psi) S / N (16 horas). Nota: Até o resíduo é reagido com isopropílico vai oxidar para ter certeza que não entra em contato com o oxigênio.
  6. Pesar no copo para estabelecer o peso do PNIPAAm.
  7. Adicionar álcool isopropílico para a PNIPAAm, criando uma 50/50 w / w solução.
  8. Coloque 2 ml da solução sobre a superfície da placa de cultura de tecidos, e no revestimento, durante 5 min, sob luz UV.
  9. Lava-se a placa com 2 ml de PBS quente duas vezesantes de usar para cultura de células.

2 Criação de Fichas de celulares

Nota: as folhas da pilha de células primárias para o órgão-alvo podem ser criadas através de um número de métodos diferentes, ou por revestimento de superfícies de cultura de tecidos com o polímero termo-sensível, tal como descrito aqui. Placas termossensíveis Pré-revestidos também são oferecidos por um número de fornecedores.

Nota: Este protocolo é para a cultura usando um prato de 35 mm. Resumidamente, as células são primeiro incubadas a 37 ° C durante um mínimo de 24 horas à confluência para estabelecer conexões laterais entre as células adjacentes. Para soltar as folhas de células, as placas são sujeitas a temperaturas inferiores a 32 ° C. A camada de células é então transferido para a matriz fibrosa base forte contendo um hidrogel permissiva neovascular com as células endoteliais vasculares.

  1. Isolar a população de células. Nota: Este método é dependente dos procedimentos de derivação individuais e o tipo de células. Rato mu liso aórticocélulas LECSA (RASMC) são utilizadas neste exemplo. Estas são células primárias de músculo liso isoladas a partir da aorta abdominal de um rato.
  2. Lavam-se as células com 2 ml de PBS quente.
  3. Adicionar 3 ml de tripsina (ou outro / solução dissociando clivagem) para as células durante 5 min.
  4. Inibir a tripsina por adição de 3 ml do meio de cultura, ou uma solução tampão de fosfato (PBS) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS).
  5. Recolher as células num tubo cónico e contagem de uma alíquota.
  6. Rodar as células a 1.000 rpm (228 xg) durante 5 min.
  7. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células no seu meio de crescimento (mais SmGM2 kit bala meio de cultura é usada para RASMC).
  8. Coloque a mídia que contém as células em um termo-sensível placa 35 mm - PNIPAAm placa revestida com uma concentração que vai atingir 100% de confluência. Nota: Para RASMCs que o número foi determinado como sendo de 100.000 células / cm 2. No entanto, devido à perda de células durante a passagem, 120% do que va lue é usado.
  9. Colocar numa incubadora a 37 ° CO / N. Nota: É importante manter as células a 37 ° C, para manter a adesão de células à placa.

3: Preparação da Matriz Fundamental

Nota: Várias matrizes fibrosas em 3D podem ser utilizados para a camada de matriz fibrosa forte entre as camadas de células delicadas. Alguns exemplos incluem: gelfoam, biovidro, materiais naturais acellularized 26 ou nanospun materiais 27,28 A matriz de bexiga do porco (UBM) utilizada nesses estudos foi generosamente fornecidos a partir de nosso colaborador, o Dr. Badylak 29.

  1. Antes de usar, determinar as características da matriz, incluindo a falta de conteúdo celular se descelularizados matriz é usado, 27,28 viabilidade celular específica, e o espaço vazio 22.
  2. Cortar a matriz pré-esterilizados em um tamanho e forma desejados. Nota: Aqui, um furador é utilizada para cortar um círculo diâmetro de 4 mm.
ve_title "> 4. células endoteliais de semeadura em um Neovascular Permissivo Hidrogel

Nota: As células endoteliais podem ser obtidos a partir de uma variedade de fontes, incluindo a diferenciação de células estaminais ou progenitoras. Aqui, são utilizadas células HUVEC.

  1. Use qualquer hidrogel permissiva (fibrina, géis de colagénio), enquanto o tempo de reticulação é suficientemente curto para permitir que as células permanecem viáveis. Nota: Aqui, um gel de hialuronano (HA), com base reticulados com uma ponte de dissulfureto é utilizado.
  2. Prepare o hidrogel de HA, de acordo com o protocolo da empresa.
  3. Recolher as células endoteliais e dispersam-se numa solução de uma única célula utilizando tripsina 1x. Nota: Accutase ou dissociação celular Tampão também poderia ser utilizada para a dispersão de células individuais.
  4. Desactivar a enzima tripsina, utilizando uma quantidade igual de inibidor de tripsina de soja (que é importante que as células não entram em contacto com o soro) ou 10% de FBS em PBS, recolhendo a solução / células para um tubo de 15 ml.
  5. CONT as células, e calcular o volume necessário para as dimensões de emenda (previamente quantificada). Nota: Para um patch 4 milímetros, aqui de 2 milhões de células endoteliais são usados.
  6. Extrato de 2 milhões de células, e coloque em um novo tubo de 15 ml.
  7. Giram em (228 xg) por 5 min.
  8. Aspirar o sobrenadante, deixando as células como um sedimento num tubo cónico.
  9. Misturar os materiais líquidos de HA e de gelatina numa proporção de 1: 1 ração. Em seguida, adicionar 80% do volume total dentro do tubo cónico contendo o sedimento.
  10. Ressuspender as células endoteliais na mistura 1: 1 HA / Gelatina
  11. Colocar as células em suspensão na mistura de HA / gelatina para a base de matriz fibrosa a partir do Passo 2.
  12. Adicionar 1/5 (20 por cento) do volume total desejada do agente de reticulação
  13. Incubar durante 1 hora a 37 ° C.

5. Isolamento de Folhas Celulares

  1. Retirar as placas tratadas com PNIPAAm 35 milímetros contendo as células a partir do incubador e colocar num capuz de cultura de células emRT.
  2. Aspirar rapidamente o meio das células, e adicionar 2 ml de 6% de gelatina normal que foi aquecido a 37 ° C.
  3. Enquanto que a gelatina está ainda quente, coloque a estrutura de metal em que a gelatina, submergindo-a abaixo da superfície da gelatina normal (Filme 1).
  4. Coloque a totalidade da placa em gelo durante 5 a 7 minutos, permitindo que a gelatina endureça.
  5. Após 7 min, uma espátula para separar cuidadosamente os bordos de gelatina do lado da placa, e em seguida utilizar uma pinça para levantar a estrutura de metal da placa Nota: A gelatina 6%, e a folha de célula deve levantar com a estrutura.
  6. Mover a lâmina da célula para o prato e colocar na parte superior do conjunto de matriz de hidrogel de base fibrosa, ajustando cuidadosamente a estrutura no topo da construção. Nota: O lado apical da camada de células ainda estará na posição superior.
  7. Adicionar 2 ml de meio morno (37 ° C).
  8. Incubar S / N permitindo que a folha de células para aderirem à superfície do hidrogel.
  9. Remover tele grade metálica após a solução aquece (aproximadamente 1 hora), ou no dia seguinte.

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Representative Results

O diagrama de fluxo (Figura 1) mostra o método geral para fazer o penso multicamadas. Folhas de células são separadas da placa tratada PNIPAAm por baixar a temperatura abaixo de 32 ° C. Em seguida, a camada de células é colocada em cima do hidrogel reticulado contendo as células endoteliais semeadas na matriz fibrosa subjacente (Figura 1). As placas pré-tratados termossensíveis, também podem ser utilizados para criar as camadas de células. Superfícies topológicas especiais são usados ​​para especificamente padrão (ou seja, alinhar) as células 30.

A matriz fibrosa de base podem ser gerados a partir de descelularizante matriz tecidual nativo ou electrospun. Aqui, a folha de material fibroso foi cortado para um diâmetro de 4 mm para a base de correcção (Figura 2A). A caracterização do material é importante para a determinação da quantidade de hidrogel que pode ser usado para preencher os espaços vazios. A matriz usada aqui foi Previously caracterizados e publicado. 22

Os hidrogeles que contêm as células endoteliais são reticulados após a aplicação dos componentes líquidos de hidrogel de HA para a matriz fibrosa. A microscopia de fluorescência / transmissão mostra células coradas com Calceina AM (Figura 2B) que tenham sido capturadas na hidrogel reticulado vivo.

O processo de criação da camada de células é fotografada (Figura 3), incluindo a comparação entre nossas próprias placas PNIPAAm-revestidos e chapas pré-revestidas comprados de um fornecedor. RASMC são colocadas sobre a superfície PNIPAAm tratados durante pelo menos 16 horas a 37 ° C. Este tempo mínimo permite que as células para estabelecer os seus aderências boarder laterais com células vizinhas (Figura 3A). Nota: As células devem estar em confluência de estabelecer essas bordas laterais. Após cultura durante pelo menos 16 horas, a placa de células deve ser movido para a TA, durante uma queda abaixo de 32 ° C, e usando gelo f5-8 min ou acelera o processo de arrefecimento (Figura 3B). A queda de temperatura altera o ângulo de contacto de conformação do material de revestimento, permitindo a camada de células para levantar da placa. Figura 3C mostra a folha de elevação de células a partir da placa.

As placas revestidas em laboratório funcionou bem, depois de alguma optimização, para criar e mover as folhas de células. Figura 4D mostra uma monocamada confluente de RASMC antes da transferência. Quando as células foram deixadas a levantar, as folhas tendem a dobrar e manter a si própria (Figura 3E). De facto, a manipulação das camadas de células em internamente criada PNIPAAm ou aqueles que foram adquiridos era difícil e muitas vezes resultou em rasgamento das folhas (Figura 3F). Portanto, uma solução para a transferência das folhas foi desenvolvido. Uma vez que as células são removidas da incubadora e começar a fresco, 6% de gelatina foi utilizada para cobrir as células com um metal adicional lattice incorporado no gel (Figura 3G). À medida que a placa de refrigeração, as células levantado, e a gelatina endureça. Usando fórceps, a estrutura celular e folha gelatin- pode ser removido em conjunto da placa de cultura; ao mesmo tempo (Figura 3H). Em seguida, estes três componentes são colocados no topo da construção com base (Figura 3I). Aqui, a camada de células (rosa) é muito maior do que a matriz de base subjacente (matriz branca grossa sob a camada de células-de-rosa). A camada de células pode ser facilmente cortada ao tamanho.

O remendo de células final (Figura 4) é criada por camadas da camada de células para o complexo pré-formado de adesivo a base de hidrogel e permissiva. De baixo para cima, o adesivo é constituído por uma matriz fibrosa semeada com hialuronano hidrogel contendo as células endoteliais, e, em seguida, a camada de células é colocado em camadas sobre essa matriz. As primeiras tentativas de manipular as camadas de células, sem a utilização de gelatina / Appar treliçaatus resultou em folhas de células muito pequenas, que muitas vezes dobradas e foram rasgadas (Figura 4A-D visto de cima). Figura 4A representa uma imagem composta precoce remendo desenho combinando o Mitotracker vermelho tingido RASMC (Figura 4B), calceina AM verde HUVECs fluorescentes (figura 4C), e a imagem transmitida luz (Figura 4D). O estreitamento 10x imagens são fornecidos para a folha de célula e HA / hidrogel sem matriz (Figura 4E-H). Figura 4E é o composto do vermelho mitotraker (figura 4F), o Calceina AM verde HUVEC (Figura 4G) e da luz transmitida ( A Figura 4H). A vista de baixo (matriz base, HA / HUVEC), e as imagens camada de células de cada componente é mostrado na Figuras 4I-L. As imagens compostas é Figura 4I, com as peças individuais representados na Figura 4J-L, Figura 4J shows a lâmina da célula (vermelho), as células endoteliais (verde) estão na Figura 4K, e a imagem de transmissão (Figura 4D) O composto imagem (Figura 4 M) mostra a mancha com uma camada de células uniforme que cobre toda a área da matriz sem dobrar ou rasgar. Figuras 4M-P também são de baixo olhando para a matriz. Figura 4 N é a camada de células, contendo vermelho neutro. Mais uma vez, vermelhos tiras grossas aparecem em torno da matriz, porque a folha de dobras nestas áreas directamente adjacentes ao bordo da matriz. Imagiologia de transmissão de luz (Figura 4O) mostra a morfologia das células, e a estrutura da matriz. Finalmente (Figura 4P), a matriz tem uma qualidade especial de fluorescência no mesmo comprimento de onda que DAPI. Portanto, a excitação ultravioleta da matriz é usada para visualizá-lo claramente separada da camada de células (vermelho vivo). Os bordos do penso podem ser aparadas pararemover todas as bordas da folha que pairam sobre as bordas da matriz.

Figura 1
1 Fluxo Figura Plano de Tissue Assembleia. Celulares folhas são criados por semear as células nas placas PNIPAAm revestidos thermoresponsive, e permitindo tempo suficiente para que as células atingem confluência e estabelecer conexões laterais de células vizinhas. A camada de células é libertado através da redução da temperatura (disco amarelo). Concomitantemente, as células endoteliais são incorporados num hidrogel neovascular permissiva HA, injectado no espaço de vazios da matriz fibrosa de base mais forte, e quimicamente reticulado (disco branco). A camada de células (disco amarelo) é, em seguida, a combinação de camadas com matriz endotelial (branco), conforme necessário. favor aqui avisualizar uma versão maior dessa figura.

Figura 2
Figura 2 Imagens da matriz de base e endotelial encapsulamento. (A) A matriz fibrosa base mais forte é perfurado em uma forma redonda. Aqui, um de 4 mm de diâmetro é utilizada com base no modelo animal in vivo. (B) HUVEC coradas com Mitotracker verde (Calceina-AM) suspenso em hidrogéis de HA sobre a superfície da matriz de base (10X). favor clique aqui para ver um maior versão desta figura.

Figura 3
Figura 3 Criação de Fichas de celulares. (A) c RASMCultured em PNIPAAm tratados com 35 milímetros-pratos durante 16 horas (10X). (B) RASMC levantada depois de colocar a placa em gelo durante 5-7 minutos. (C) Imagem da borda de uma folha de libertação de células a partir do comercialmente adquirido thermoresponsive prato de cultura de células (10X). (DF) Imagens mostram resultados semelhantes para a produção de folhas de células a partir de pratos internamente criada PNIPAAm-revestidos. (D) RASMC confluentes cultivadas em placas de 35 milímetros de cultura de tecidos (4X). (E ) Após o resfriamento, as folhas de celulares contratados e dobrado como eles destacavam (4X). (F) Devido à fragilidade da folha de uma única célula, as folhas da pilha são frequentemente danificados durante a elevação ou outras manipulações (4X). (G) Em Para mitigar perfurações na camada de células, uma tela de metal foi usada como um suporte físico para auxiliar a transferência das camadas de células. RASMC foram coradas com vermelho neutro, coberto com 6% de gelatina e um suporte de tela metálica porosa, umand deixado endurecer. (H) com o apoio da tela, folhas de células são transferidas com danos mínimos (4X). (I) A maior camada camada de células RASMC (cor de rosa) foi, então, colocado em cima da combinação patch-hidrogel fibroso base mais forte (seta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Imagens de camadas celulares do remendo. Células foram cultivadas numa superfície revestida pNIPPAM e, em seguida, mudou-se como uma folha sobre a superfície da matriz fibrosa. As primeiras experiências que não foram transferidos com a rede de gelatina / metal resultou em pequenas manchas esfarrapadas (AD). (A) Imagem composta de (BD),(B) RASMCs em duas folhas manchadas com imagem composta de uma camada de células-combinado com a combinação de matriz de hidrogel fibroso base mais forte contendo Mitotracker Red, e (C) células HUVEC coradas com verde, e (D) em luz transmitida (E). Calceing AM coradas HUVECs (verde), e (F) Mitotracker Red RASMCs. (L) HUVECs fluorescentes verdes suspenso num hidrogel. (H) da imagem do conjunto de matriz de hidrogel fibroso base mais forte de transmissão. (I) A imagem composta a partir da procura inferior do remendo para cima através da matriz fibrosa de base forte (não manchado), HA contendo HUVECs (verde), e a folha de células da RASMCs (vermelho), respectivamente. (J) Vermelho folha RASMCs fluorescentes, como visto através da base fibrosa Matrix combinação de hidrogel. (K) HUVECS verde fluorescente. (L) imagem Transmissão da construção patch.(M) imagem composta de células-folhas (vermelho) sobre a base de combinação matriz de hidrogel fibroso (autofluorescent-azul). (N) As células do cobrir da folha da base combinação mostram um aumento de fluorescência matriz de hidrogel fibroso nas bordas é devido a aglomeração das células. (O) imagem da construção de Transmissão. (P) matriz de base fibrosa Natural é autofluorescente no DAPI (azul de comprimento de onda). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Filme 1 . O processo de transferência das folhas de células é destacada no filme suplementar submetido com o documento. As mostras de filme, no processo de passo a passo, a remoção das células a partir do incubador; substituição da mídia com 6% de gelatina, a inserção de the tela de metal, a refrigeração das células em gelo, a transferência das células a partir da placa PNIPAAm revestido para outro prato, uma imagem das células durante a transferência e, finalmente, a remoção da tela a partir da folha.

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Discussion

Os passos críticos no protocolo incluem: revestimento das superfícies das placas com o polímero thermoresponsive e manipular as folhas de células após o arrefecimento das placas. Como as células diferentes apresentam diferentes propriedades físicas, como adesividade, o tempo de elevação deve ser otimizado para cada tipo de célula diferente. O segundo, e mais importante desafio componente deste protocolo, centra-se na manipulação da camada de células, um aspecto crítico dos métodos para a montagem do tecido. A camada única de células na camada de células é bastante frágil e pode rasgar-se facilmente manipulado com uma pinça. Além disso, quando as folhas de celulares não são mantidos no lugar, eles tendem a se contrair e pode dobrar facilmente. A folha de transferência de célula proposto usando uma tela de suporte ajuda a manipulação da camada de células frágil.

A metodologia de concepção apresentado neste trabalho prevê uma abordagem bastante baixo custo para a criação de uma camada de células para uma variedade de apli engenharia de tecidoscátions. Além disso, a criação de placas revestidas PNIPAAm num laboratório da universidade pode ser padronizada com este método e modificações ao protocolo pode ser feita para acomodar vários tipos de células, e as superfícies. O uso de folhas de células, em vez de uma única célula não-organizados, ajuda a montagem de tecidos, e também pode aumentar a probabilidade de sobrevivência e integração dos tecidos implantados. No entanto, o método in vivo de entrega (não mencionado neste protocolo) dessas construções terão de ser otimizado para cada tipo de tecido. As aplicações futuras incluem explorações e metodologias otimizadas para gerar tecidos para sistemas de órgãos específicos.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Calcein-AM Invitrogen C3099 Cell tracker / live dye
Lysotracker Red Invitrogen L7528 Cell tracker
Neutral Red Sigma N7005 Visible Cell dye
pNIPAAM Sigma Aldrich 412780250 Poly(N-isopropylacrylamide)
Toluene Sigma Aldrich 244511-1L
Hexane Sigma Aldrich 296090-1L
RAOSMC Lonza R-ASM-580 Rat Aortic Smooth Muscle Cells
SmGM2 Lonza CC-4149 Smooth Muscle Media
HUVEC Invitrogen C-003-5C Human Venous Endothelial Cells
HyStem Glycosan/Biotime
Isopropyl alcohol VWR International BDH1133-4LP
Trypsin Corning Cellgro 25-053-C1
PBS Gibco 14287-072
FBS Gibco 16140-071
Specific Equipment
Filter paper Ahlstrom  6310-0900 
Buchner Funnel  Sigma Aldrich  Z247308 
UpCell Plates  Nunc  2014-11 
UV light Jelight Company  UVO Cleaner Model No.42

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References

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