Tissue Engineering: Aufbau eines Multizelluläre 3D Gerüst für die Lieferung von Layered Zellschichten

1School of Engineering, University of California, Merced
Bioengineering

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Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets. J. Vis. Exp. (92), e51044, doi:10.3791/51044 (2014).

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Abstract

Vielen Geweben, wie die erwachsenen menschlichen Herzen, sind nicht in der Lage nach der Beschädigung ausreichend zu regenerieren. 2,3 Strategies in Tissue Engineering vorschlagen Innovationen, um den Körper bei der Wiederherstellung und Reparatur zu unterstützen. Zum Beispiel kann TE Ansätze in der Lage, Herz Remodeling nach Myokardinfarkt (MI) zu dämpfen und möglicherweise erhöhen insgesamt die Herzfunktion zu einer fast normalen Pre-MI Ebene. 4 Wie bei jedem Funktionsgewebe, eine erfolgreiche Regeneration von Herzgewebe umfasst die ordnungsgemäße Lieferung von mehrere Zelltypen mit Umweltreize Begünstigung Integration und das Überleben der implantierten Zellen / Gewebetransplantat. Löslichen Signale Zell-Zell-Wechselwirkungen und Matrixmaterialien als Lieferfahrzeuge, deren Auswirkungen auf das Überleben der Zelle, der Materialfestigkeit, und Erleichterung der Zell-Gewebeorganisation ausgewertet: mehrere Parameter einschließlich sollte konstruiert Gewebe richten. Studien mit direkten Einspritzen von Transplantat-Zellen nur diese wesentlichen Elemente ignorieren. 2,5,6Eine Gewebe Design kombiniert diese Zutaten noch entwickelt werden. Hier präsentieren wir ein Beispiel von integrierten Designs mit Schichtung von gemusterten Zellschichten mit zwei verschiedenen Arten von biologischen Materialien, die abgeleitete das Zielorgan Zelltyp und Endothelzellen für die Verbesserung neuer Schiffe Bildung in der "Gewebe". Obwohl diese Studien konzentrieren sich auf die Erzeugung von Herz-ähnliches Gewebe, kann dieses Gewebe Design zu vielen anderen als Herz mit minimalen Design-und Materialwechsel Organe angelegt werden und soll ein Off-the-shelf-Produkt für regenerative Therapien sein. Das Protokoll enthält fünf detaillierte Schritte. Ein temperaturempfindlichen Poly (N -isopropylacrylamide) (PNIPAAm) wird zur Beschichtung Gewebekulturschalen verwendet. Dann werden gewebespezifische Zellen auf der Oberfläche der beschichteten Platten / Mikroflächen kultiviert, um die Zellplatten mit starken seitlichen Adhäsionen bilden. Drittens wird eine Basismatrix für das Gewebe durch Kombination von porösen Matrix mit neovaskulärer Permissi geschaffenve Hydrogele und Endothelzellen. Schließlich werden die Zellschichten von den PNIPAAm beschichteten Schalen angehoben und übertragen zu dem Basiselement, so dass die gesamte Konstruktion.

Protocol

1. Schaffung PNIPAAm-beschichteten Platten

  1. Man löst 2,6 g PNIPAAm in 2 ml einer 60% Toluol / Hexan-Lösung 40%.
  2. Das Gemisch wird auf 60 ° C für 10 min gerührt, bis die PNIPAAm gelöst.
  3. Cut Filterpapier in ein 60 mm Durchmesser-Kreis und Ort Papier in der Büchner-Trichter.
  4. Die Lösung wird über Büchner-Trichter in die vorgewogen Becherglas (keine Kunststoffe, wie Hexan wird Kunststoffschmelze).
  5. Das Becherglas und den Inhalt in eine Vakuumglocke (24 psi) O / N (16 h). Hinweis: Bis der Rückstand mit Isopropyl reagierte sie oxidieren, so stellen Sie sicher, dass es nicht in Kontakt mit Sauerstoff kommen.
  6. Wiegen Sie das Becherglas, das Gewicht des PNIPAAm herzustellen.
  7. Fügen Sie Isopropylalkohol auf die PNIPAAm, die Schaffung eines 50:50 w / w Lösung.
  8. Je 2 ml der Lösung auf die Oberfläche der Gewebekulturplatte und Mantel für 5 Minuten unter UV-Licht.
  9. Zweimal waschen Sie die Platte mit 2 ml warmem PBSvor der Verwendung für die Zellkultur.

2. Schaffung von Zellschichten

Hinweis: Zellschichten von Primärzellen für das Zielorgan unter Verwendung einer Anzahl von verschiedenen Verfahren erzeugt werden, oder durch Beschichten Gewebekulturflächen mit thermo-reaktive Polymer, wie hier beschrieben. Vorbeschichtete thermosensitiven Platten werden auch von einer Reihe von Herstellern angeboten.

Hinweis: Dieses Protokoll ist für die Kultur mit Hilfe eines 35-mm-Schale. Kurz gesagt, Zellen werden zuerst bei 37 ° C für mindestens 24 Stunden bei Konfluenz inkubiert, um Querverbindungen zwischen benachbarten Zellen zu schaffen. Um Zellschichten zu lösen, werden die Platten auf Temperaturen unterhalb 32 ° C unterzogen. Die Zellschicht wird dann auf die starke Base, die eine Fasermatrix neovaskulären permissive Hydrogel mit vaskulären Endothelzellen übertragen.

  1. Isolieren Sie die Zellpopulation. Hinweis: Dieses Verfahren ist abhängig von den einzelnen Ableitungsverfahren und der Art der Zellen. Rattenaorta glatt muSCLE Zellen (RASMC) werden in diesem Beispiel verwendet. Dies sind primäre glatte Muskelzellen aus der Aorta einer Ratte isoliert.
  2. Mit 2 ml warmem PBS waschen der Zellen.
  3. 3 ml Trypsin (oder anderen Abspaltungs / distanziert Lösung) auf die Zellen für 5 min.
  4. Hemmung der Trypsin durch Zugabe von 3 ml des Kulturmediums oder der Phosphatpufferlösung (PBS), enthaltend 10% fötales Rinderserum (FBS).
  5. Sammeln Sie die Zellen in einem konischen Rohr und zählen einen aliquoten.
  6. Dreh die Zellen bei 1000 Upm (228 × g) für 5 min.
  7. Aspiration des Überstands und Resuspendieren der Zellen in der Wachstumsmedien (SmGM2 und Kugel Kit Kulturmedium für RASMC verwendet).
  8. Legen Sie die Medien mit den Zellen auf einer 35 mm wärmeempfindliche Platte - PNIPAAm beschichtete Platte in einer Konzentration, die 100% zu erreichen, wird Zusammenfluss. Hinweis: Für RASMCs dass Zahl bestimmt zu 100.000 Zellen / cm 2 betragen. Jedoch durch den Verlust von Zellen bei der Weitergabe, 120% des VA lue verwendet.
  9. Platzieren in einen Inkubator bei 37 ° CO / N. Hinweis: Es ist wichtig, die Zellen bei 37 ° C zu halten, um die Zellhaftung an der Platte zu halten.

3. Vorbereitung der Grundlagen Matrix

Hinweis: Verschiedene 3D-Faser Matrizen können verwendet werden, um starke Fasermatrix zwischen den zarten Zellschichten Schicht sein. Einige Beispiele: Gelschaum, Bioglas, natürliche Materialien azellularisierten 26 oder nanospun Materialien 27,28 Schweine Harnblase Matrix (UBM) in diesen Studien verwendet wurde großzügig von unserem Mitarbeiter, Dr. Badylak 29 versehen.

  1. Vor der Verwendung bestimmen Matrixeigenschaften, einschließlich des Fehlens von Zellinhalts wenn dezellularisierte Matrix verwendet, 27,28 zellspezifischen Lebensfähigkeit und Hohlraum. 22
  2. Schneiden die vorsterilisiert Matrix in eine gewünschte Größe und Form. Hinweis: Hier wird eine Loch verwendet, um eine 4 mm Durchmesser-Kreis geschnitten.
ve_title "> 4. Seeding Endothelzellen in einen Neovaskuläre Tolerant Hydrogel

Anmerkung: Die Endothelzellen können aus einer Vielzahl von Quellen, einschließlich Differenzierung von Stammzellen oder Vorläuferzellen erhalten werden. Hier HUVECs verwendet.

  1. Verwenden Sie eine permissive Hydrogel (Fibrin, Kollagen Gele), solange die Vernetzungszeit ist kurz genug, um die Zellen lebensfähig zu bleiben. Anmerkung: Hier wird ein Hyaluronsäure (HA), bezogen Gel mit einer Disulfid-Brücke verwendet wird vernetzt.
  2. Vorbereiten des HA-Hydrogel gemäß der Firma Protokoll.
  3. Sammeln Sie die Endothelzellen und verteilen in eine einzelne Zelle Lösung mit 1x Trypsin. Hinweis: Accutase oder Zelldissoziationspuffer könnte auch als Einzelzelldispersion verwendet werden.
  4. Deaktivieren des Enzyms Trypsin durch Verwendung einer gleichen Menge des Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (wenn es wichtig ist, dass die Zellen nicht in Berührung kommen mit Serum) oder 10% FBS in PBS, das Sammeln der Lösung / Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen.
  5. Count die Zellen, und die Berechnung der für die Patch-Abmessungen benötigte Volumen (vorher quantifiziert). Hinweis: Für eine 4 mm-Patch, hier 2 Millionen endothelialen Zellen verwendet werden.
  6. Auszug 2 Millionen Zellen, und in einen neuen 15 ml konischen Röhrchen.
  7. Drehen sich mit (228 × g) für 5 min.
  8. Saugt den Überstand, so dass die Zellen als Pellet in einem konischen Röhrchen.
  9. Mischen Sie die HA und Gelatine flüssigen Materialien in einer 1: 1-Verhältnis. Dann werden 80% des Gesamtvolumens in der konischen Röhrchen, Pellets.
  10. Resuspendieren der Endothelzellen in dem 1: 1-HA / Gelatine-Mischung
  11. Legen Sie die suspendierten Zellen im HA / Gelatine-Mischung in die Basis Fasermatrix aus Schritt 2.
  12. Hinzufügen 1/5 (20 Prozent) der der Vernetzer gewünschte Gesamtvolumen
  13. Inkubation für 1 h bei 37 ° C aufweist.

5. Isolierung von Zellschichten

  1. Entfernen Sie die 35 mm PNIPAAm-behandelten Platten die Zellen aus dem Inkubator und Ort enthalten, in einer Zellkultur Haube anRT.
  2. Absaugen schnell die Medien aus den Zellen, und 2 ml 6% normaler Gelatine, die auf 37 ° C erhitzt wurde.
  3. Während die Gelatine noch warm ist, setzen das Metallgitter in die Gelatine, Eintauchen unter die Oberfläche der normalen Gelatine (Film 1).
  4. Zeigen die gesamte Platte auf Eis für 5 bis 7 min, so dass die Gelatine zu härten.
  5. Nach 7 min, verwenden Sie einen Spachtel, um sorgfältig trennen die Gelatine Kanten von der Seite der Platte, und verwenden Sie dann Zange, um die Metallgitter von der Platte heben Hinweis: Die 6% Gelatine, und die Zellschicht sollte mit dem Gitter zu heben.
  6. Bewegen Sie die Zellschicht auf der Schale und auf der Oberseite der Basisfasermatrix-Hydrogel Kombination sorgfältig Einstellen der Gitter auf der Oberseite des Konstrukts. Anmerkung: Die apikale Seite der Zellschicht noch in der oberen Position sein.
  7. 2 ml warmem Medium (37 ° C).
  8. Inkubieren O / N so dass die Zellschicht auf dem Hydrogel Oberfläche haften.
  9. T entfernener Metallgitter, nachdem die Lösung erwärmt (etwa 1 h), oder am nächsten Tag.

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Representative Results

Das Flussdiagramm (Figur 1) zeigt das gesamte Verfahren zur Herstellung des mehrschichtigen Patch. Zellschichten werden aus dem PNIPAAm behandelte Platte durch Senken der Temperatur unter 32 ° C abgelöst. Dann wird die Zellschicht auf der Oberseite des vernetzten Hydrogels der Endothelzellen in die darunterliegende faserige Matrix (Figur 1) enthält, beimpft platziert. Die vorbehandelten wärmeempfindlichen Platten können auch zur Erzeugung der Zellschichten eingesetzt werden. Sonder topologischen Oberflächen verwendet werden, um speziell Muster (dh ausrichten) die Zellen 30.

Die Basis Fasermatrix aus Dezellularisieren nativen Gewebematrix oder elektro erzeugt werden. Hier wurde der Fasermaterialblatt zu einer 4 mm Durchmesser für die Plattenbasis (2A) geschnitten. Die Charakterisierung dieses Materials ist wichtig für die Bestimmung der Menge an Hydrogel, das verwendet werden kann, um die Hohlräume zu füllen. Der hier verwendete Matrix ist früschlau gekennzeichnet und veröffentlicht. 22.

Die Hydrogele, die Endothelzellen vernetzten nach Anwendung der HA-Hydrogel flüssigen Komponenten in die Fasermatrix. Fluoreszenz / Transmissionsmikroskopie zeigt lebende Zellen mit Calcein AM (2B), die in dem vernetzten Hydrogel aufgenommen wurden gefärbt.

Der Prozess der Erstellung der Zellschicht abgebildet wird (Abbildung 3), einschließlich Vergleich zwischen unserer eigenen PNIPAAm-beschichteten Platten und Pre-beschichtete Platten bei einem Händler gekauft. RASMC auf der PNIPAAm behandelten Oberfläche für mindestens 16 h bei 37 ° C plattiert. Diese Mindestzeit ermöglicht es den Zellen, um ihre seitliche Grenze Adhäsionen mit benachbarten Zellen (3A) herzustellen. Hinweis: Die Zellen müssen bei Zusammenfluss sein, diese seitlichen Grenzen zu etablieren. Nach Kultivierung für mindestens 16 h, muß die Platte von Zellen auf RT für einen Abfall unter 32 ° C, und unter Verwendung von Eis f bewegt werdenoder 5-8 min beschleunigt den Kühlprozeß (3B). Der Temperaturabfall ändert die Konformationsänderung Kontaktwinkel der Beschichtungsmaterial so dass der Zellschicht um von der Platte anheben. 3C zeigt die Zellschicht von der Hebeplatte.

Platten im Labor beschichtet funktionierte gut, nach einiger Optimierung, für das Erstellen und Verschieben der Zellschichten. 4D zeigt eine konfluente Monolage von RASMC vor der Übertragung. Wenn die Zellen wurden zu heben, neigten die Blätter zu falten und zu kleben, um sich (3E). In der Tat, die Manipulation der Zellschichten auf in-house erstellt PNIPAAm oder solche gekauft war schwierig und oft in Reißen der Blätter geführt (Abbildung 3F). Daher ist eine Lösung für die Übertragung der Blätter entwickelt. Sobald die Zellen aus dem Brutschrank entnommen und beginnen zu kühlen, wurde 6% Gelatine verwendet, um die Zellen mit einer zusätzlichen Metall l deckenattice im Gel (Figur 3G) eingebettet ist. Da die Platte abgekühlt ist, werden die Zellen aufgehoben, und die Gelatine härtet. Mit einer Pinzette, können die Gitter gelatin- und Zellschicht gemeinsam von der Kulturplatte entfernt werden kann; alle gleichzeitig (Figur 3H). Dann werden diese drei Komponenten werden auf der Grundlage des Konstrukts (Figur 3i) angeordnet ist. Hier ist die Zellschicht (pink) viel größer als die zugrunde liegenden Basismatrix (dicke weiße Matrix unter dem rosa Zelle Blatt). Die Zellschicht kann leicht auf Größe getrimmt werden.

Die endgültige Zell Patch (4) durch Überlagerung der Zellschicht auf dem vorgeformten Komplex der Plattenbasis und permissive Hydrogel erzeugt. Von unten nach oben, das Pflaster besteht aus einer Fasermatrix mit Hyaluronan Hydrogel mit den Endothelzellen, und dann wird die Zellschicht auf der Oberseite dieser Matrix geschichtet ausgesät. Frühe Versuche, die Zellschichten ohne die Verwendung von Gelatine / Gitter appar manipulierenATUS führte zu sehr kleinen Zellschichten, die oft gefaltet und zerrissen (4A-D von oben gesehen). 4A stellt einen frühen Patch-Design Composite-Bild Kombination der MitoTracker rot gefärbt RASMC (4B), Calcein AM grün fluoreszierenden HUVECs (Abbildung 4C), und das übertragene Lichtbild (Figur 4D). Näher 10x Bilder für die Zellschicht zugeführt und HA / Hydrogel ohne Matrix (4E-H). 4E ist der Verbundstoff der mitotraker rot (4F), die Calcein AM grün HUVECs (4G), und das übertragene Licht ( 4H). Der Blick von unten (Grundmatrix, HA / HUVEC) und Zellschicht Bilder der einzelnen Komponenten ist in den Abbildungen zeigen 4E-L. Die zusammengesetzten Bilder 4I ist, mit den in Figur 4J-L dargestellten Einzelteile, 4J SHOWS Zellschicht (rot), die Endothelzellen (grün) sind in Figur 4K und das Transmissionsbild (Figur 4L) Das zusammengesetzte Bild (Abbildung 4 M) zeigt den Patch mit einer einheitlichen Zellblech über die gesamte Fläche der Matrix ohne Falten oder Reißen. Fakten 4M-P sind ebenfalls von unten nach oben in die Matrix. Abbildung 4 N ist die Zellschicht, enthalten Neutral Red. Wiederum erscheint dicke rote Streifen auf der Matrix, da die Folie Falten in diesen unmittelbar benachbart zum Rand der Matrix Bereichen. Sendelichtabbildungs ​​(Abbildung 4A) zeigt die Morphologie der Zellen und die Struktur der Matrix. Schließlich (Figur 4p), hat die Matrix eine besondere Qualität von fluoreszierenden bei der gleichen Wellenlänge wie Dapi. Daher wird die UV-Anregung der Matrix verwendet, um deutlich anzuzeigen und aus der Zellschicht (hellrot) zu trennen. Die Kanten des Pflasters kann getrimmt werdenentfernen alle Kanten des Bogens, die über die Kanten der Matrix hängen.

Figur 1
Abbildung 1. Flussdiagramm der Gewebeanordnung. Zell-Blätter werden durch Impfen Zellen auf den thermoresponsiven PNIPAAm-beschichteten Platten, und genügend Zeit für die Zellen bis zur Konfluenz zu erreichen und zu etablieren seitlichen Verbindungen zu Nachbarzellen erstellt. Die Zellschicht wird durch Verringerung der Temperatur (gelber Festplatte) freigesetzt. Gleichzeitig werden Endothelzellen in einer neovaskulären permissive HA Hydrogel eingebettet ist, in Hohlräume Raum der stärkeren Base Fasermatrix und chemisch vernetzt (weiße Platte) injiziert. Die Zellschicht (gelb Platte) ist dann mit der geschichteten endothelialen Matrix-Kombination (weiß), je nach Bedarf. Bitte klicken Sie hier, umsehen Sie eine größere Version dieser Figur.

Figur 2
Abbildung 2. Bilder von Grundmatrix und Endothelial Encapsulation. (A) Die stärkere Base Fasermatrix ist in einer runden Form gestanzt. Hier wird ein 4 mm Durchmesser wird auf Basis der In-vivo-Tiermodell (B) HUVECs mit MitoTracker grün (Calcein AM) in HA-Hydrogelen auf der Oberfläche der Basismatrix (10x) suspendiert gefärbt verwendet.. Bitte klicken Sie hier ein, um zu vergrößern Version dieser Figur.

Figur 3
Abbildung 3. Erstellung von Zellschichten. (A) c RASMCultured auf PNIPAAm behandelten 35 mm-Gerichte für 16 Stunden (10x). (B) RASMC angehoben, nachdem man die Platte auf Eis für 5-7 min. (C) Bild von der Kante einer Zellschicht Freigabe von der kommerziell erworben thermoresponsiven Zellkulturschale (10x). (DF) Bilder zeigen ähnliche Ergebnisse für die Erzeugung von Zellschichten von in-house erstellt PNIPAAm-beschichteten Schalen. (D) Confluent RASMC auf 35 mm Standard-Gewebekulturplatten (4x) gewachsen. (E ) Nach dem Abkühlen schrumpfte die Zellschichten und gefaltet, als sie freistehend (4x). (F) Aufgrund der Zerbrechlichkeit der Einzelzellschicht werden die Zellschichten oft beim Heben oder andere Manipulationen (4X) beschädigt. (g) in Um Perforationen in der Zellschicht zu reduzieren, wurde ein Metallgitter als physikalischer Träger verwendet, um den Transfer der Zellschichten zu unterstützen. RASMC wurden mit Neutralrot gefärbt, mit 6% Gelatine und einem porösen Metallbild-Unterstützung, eine überdachtend aushärten. (H) mit dem Schirmträger werden Zellplatten mit minimaler Schädigung (4x) übertragen. (i) die größer RASMC Zellschicht Schicht (rosa Farbe) wurde dann auf der stärkeren Base Faser Patch-Hydrogel-Kombination (Pfeil) platziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Abbildung 4. Bilder Layered Cellular Flecken. Zellen wurden auf einem pNIPPAM beschichtete Oberfläche kultiviert und bewegt wird, wie ein Blatt auf die Oberfläche der faserigen Matrix dann. Frühe Studien, die nicht mit der Gelatine / Metallgitter übertragen wurden geführt in kleinen zerlumpten Patches (AD). (A) Composite-Bild von (BD),(B) RASMCs in zwei Blättern mit Mitotracker Rot, und (C) HUVECs mit grünen gefärbt, und (D) in Durchlicht. (E) Composite-Bild von einer Zelle-Blatt in Verbindung mit der stärkeren Base Fasermatrix-Hydrogel-Verbindung enthaltenden gefärbten Calceing AM gefärbt HUVECs (grün), und (F) Mitotracker Red RASMCs. (G) grün fluoreszierende HUVECs in einem Hydrogel suspendiert. (H) Übertragungs Bild der stärkeren Base Fasermatrix-Hydrogel-Kombination. (I) Composite-Bild Blick von der Boden der Patch nach oben durch die stärkere Base Fasermatrix (nicht gefärbt), HA enthält HUVECs (grün) und Zell Blatt RASMCs (rot) sind. (J) Rot fluoreszierende RASMCs Blatt, als durch die Basis Faser matrix- gesehen Hydrogel-Kombination. (K) Grün fluoreszierende HUVECs. (L) Transmissionsbild des Patch-Konstrukt.(M) zusammengesetztes Bild von Zell-Blatt (rot) über der Basisfasermatrix-Hydrogel-Kombination (Autofluoreszenz blau). (N) Zellen in der Bandabdeckung durch die Basisfasermatrix-Hydrogel-Verbindung zeigen eine erhöhte Fluoreszenz bei den Rändern Bündelung der Zellen. (O) Transmissionsbild des Konstrukts. (P) Naturfaserbasis Matrix wird in der DAPI (blau Wellenlänge) autofluoreszierenden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Film 1 . Der Prozess der Übertragung der Blätter von Zellen in der zusätzlichen Film mit dem Dokument vorgelegt hervorgehoben. Der Film zeigt, in stufenweisen Verfahren wird die Entfernung der Zellen aus dem Inkubator; Ersatz der Medien mit 6% Gelatine, die Einfügung the Metallschirm, Kühlen der Zellen auf Eis, die Übertragung von Zellen aus der PNIPAAm beschichtete Schale zu einem anderen Gericht, ein Bild von den Zellen während der Übertragung, und schließlich die Entfernung des Bildschirms von dem Blatt.

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Discussion

Die kritischen Schritte im Protokoll enthalten: die Beschichtung der Plattenoberflächen mit dem Polymer und thermoresponsiven Manipulation der Zellschichten nach dem Abkühlen der Platten. Da verschiedene Zellen weisen unterschiedliche physikalische Eigenschaften, wie Haftfähigkeit, die Hebezeit sollte für jeden anderen Zelltyp optimiert werden. Die zweite und am meisten deutlich anspruchs Komponente dieses Protokoll, konzentriert sich auf die Manipulation der Zellschicht, ein kritischer Aspekt der Verfahren zur Gewebeanordnung. Die Einzelzellschicht in der Zellschicht ist sehr empfindlich und kann leicht reißen, wenn sie mit einer Pinzette manipuliert. Außerdem, wenn die Zell Blätter sind nicht an Ort und Stelle gehalten werden, neigen sie dazu, sich zusammenzuziehen und kann leicht zu falten. Die vorgeschlagene Zellschicht Übertragung über eine unterstützende Bildschirm unterstützt die Manipulation des fragilen Zellschicht.

Die Design-Methodik in dieser Handschrift präsentiert eine ziemlich niedrige Kostenansatz für die Schaffung einer Zellschicht für eine Vielzahl von Tissue-Engineering-AnwenKationen. Außerdem schaffen PNIPAAm beschichteten Platten in einem Universitätslabor kann mit diesem Verfahren und Modifikationen des Protokolls können, um mehrere Zelltypen und Oberflächen aufzunehmen standardisiert werden. Die Verwendung von Zellschichten, anstatt unorganisierten Einzelzellen, Gewebeanordnung unterstützt, und kann auch die Wahrscheinlichkeit des Überlebens und der Integration der implantierten Geweben erhöhen. Jedoch wird die in vivo-Abgabe-Verfahren (in diesem Protokoll angegeben) dieser Konstrukte müssen für jeden Gewebetyp optimiert werden. Zukünftige Anwendungen gehören Erkundungen und optimierte Methoden zur Erzeugung von Geweben für spezifische Organsysteme.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Calcein-AM Invitrogen C3099 Cell tracker / live dye
Lysotracker Red Invitrogen L7528 Cell tracker
Neutral Red Sigma N7005 Visible Cell dye
pNIPAAM Sigma Aldrich 412780250 Poly(N-isopropylacrylamide)
Toluene Sigma Aldrich 244511-1L
Hexane Sigma Aldrich 296090-1L
RAOSMC Lonza R-ASM-580 Rat Aortic Smooth Muscle Cells
SmGM2 Lonza CC-4149 Smooth Muscle Media
HUVEC Invitrogen C-003-5C Human Venous Endothelial Cells
HyStem Glycosan/Biotime
Isopropyl alcohol VWR International BDH1133-4LP
Trypsin Corning Cellgro 25-053-C1
PBS Gibco 14287-072
FBS Gibco 16140-071
Specific Equipment
Filter paper Ahlstrom  6310-0900 
Buchner Funnel  Sigma Aldrich  Z247308 
UpCell Plates  Nunc  2014-11 
UV light Jelight Company  UVO Cleaner Model No.42

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References

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