Split-en-zwembad Synthese en karakterisatie van peptide Tertiaire amide Bibliotheek

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Peptide tertiaire amides (PTA) zijn een superfamilie van peptidomimetica die omvatten maar zijn niet beperkt tot, peptiden, peptoïden en N-gemethyleerd peptiden. Hier beschrijven we een synthetische methode die zowel split-en-zwembad en sub-monomeer strategieën combineert tot een kraal een-verbinding bibliotheek van PTA synthetiseren.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gao, Y., Kodadek, T. Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library. J. Vis. Exp. (88), e51299, doi:10.3791/51299 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Peptidomimetica zijn grote bronnen van eiwit liganden. De oligomere aard van deze verbindingen stelt ons in staat om grote synthetische bibliotheken op vaste fase met behulp van combinatorische chemie. Een van de meest bestudeerde klassen van peptidomimetics is peptoïden. Peptoïden zijn gemakkelijk te synthetiseren en is aangetoond dat proteolyse-resistente en celpermeable zijn. In de afgelopen tien jaar hebben veel nuttige eiwitliganden geïdentificeerd door middel van screening van peptoïde bibliotheken. Echter, de meeste van de liganden geïdentificeerd uit peptoïde bibliotheken hebben hoge affiniteit niet weergegeven, met zeldzame uitzonderingen. Dit kan ten dele, het gebrek aan chirale centra en conformationele beperkingen in peptoïde moleculen. Onlangs beschreven we een nieuwe synthetische route voor toegang peptide tertiaire amiden (PTA). PTA zijn een superfamilie van peptidomimetica die omvatten maar zijn niet beperkt tot, peptiden, peptoïden en N-gemethyleerd peptiden. Met zijketens aan beide α-koolstof en hoofdketen stikstofatomen,de conformatie van deze moleculen sterk beperkt door sterische hindering en allylische 1,3 stam. (Figuur 1) Onze studie suggereert dat deze PTA moleculen zeer gestructureerd in oplossing en kunnen worden gebruikt om eiwit liganden te identificeren. Wij geloven dat deze moleculen een toekomstige bron van hoge-affiniteit eiwitliganden zijn. Hier beschrijven we de synthetische methode combineert de kracht van beide split-en-zwembad en sub-monomeer strategieën om een ​​monster een-tje een-verbinding (OBOC) bibliotheek van PTA synthetiseren.

Introduction

Peptidomimetica zijn verbindingen die de structuur van natuurlijke peptiden nabootsen. Ze zijn ontworpen om de biologische activiteit te behouden terwijl het overwinnen van enkele van de problemen in verband met natuurlijke peptiden, waaronder celdoorlaatbaarheid en stabiliteit tegen proteolyse 1-3. Vanwege de oligomere aard van deze verbindingen kunnen grote synthetische bibliotheken gemakkelijk toegankelijk via monomere of sub-monomere syntheseroutes 4-7. Een van de meest bestudeerde klassen van peptidomimetica is peptoïden. Peptoïden zijn oligomeren van N-gealkyleerde glycines die gemakkelijk kunnen worden gesynthetiseerd met behulp van een sub-monomeer strategie 8, 9. Veel nuttige eiwitliganden zijn succes geïdentificeerd door screenen van grote bibliotheken van synthetische peptoïde tegen eiwitdoelstellingen 1, 10-14. Niettemin, "hits" geïdentificeerd uit peptoïde bibliotheken zelden archiveren zeer hoge affiniteit voor eiwit targets 1,10-14,22. Een major verschil tussen peptoïden en natuurlijke peptiden is dat de meeste peptoids algemeen niet de mogelijkheid om de secundaire structuur te vormen door het ontbreken van chirale centra en conformationele beperkingen. Om dit probleem op te lossen, zijn verschillende strategieën ontwikkeld in de afgelopen tien jaar, grotendeels gericht op de modificatie van zijketens die op de hoofdketen stikstofatomen 15-22. Onlangs hebben we een nieuwe synthetische route naar natuurlijke aminozuren zijketens introduceren op een peptoïde ruggengraat peptide tertiaire amides 23 te creëren ontwikkeld.

Peptide tertiaire amides (PTA) zijn een superfamilie van peptidomimetica die omvatten maar zijn niet beperkt tot peptiden (R2 = H), peptoïden (R1 = H) en N-gemethyleerd peptiden (R1 ≠ H, R2 = Me) . (Zie figuur 1) De syntheseweg wendt natuurlijk voorkomende aminozuren als de bron van chiraliteit en zijketens op de45, koolstof, en commercieel verkrijgbare primaire aminen N-substituties verschaffen. Daarom kan een grotere chemische ruimte dan eenvoudige peptiden, peptoiden of N-gemethyleerd peptiden onderzocht. Circulaire dichroïsme spectra blijkt dat PTA moleculen zeer gestructureerd in oplossing. Karakterisering van een van de PTA-eiwitcomplexen duidelijk dat de conformationele beperkingen PTA vereist voor binding. Recent hebben wij ook ontdekt dat sommige van de PTA moleculen bezitten verbeterde celdoorlaatbaarheid dan hun peptoïde en peptide tegenhangers. Wij geloven dat deze PTA bibliotheken een goede bron van liganden met hoge affiniteit voor eiwit targets kunnen zijn. In dit artikel gaan we de synthese van een steekproef een-tje een-verbinding (OBOC) PTA bibliotheek in detail samen met een aantal verbeterde voorwaarden voor de koppeling en de splitsing van deze verbindingen te bespreken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Basis van Split-en-zwembad Synthese

Om efficiënt genereren van een groot aantal verbindingen op vaste fase wordt split-and-pool synthese vaak gebruikt als een algemene strategie. Zoals getoond in figuur 4, TentaGel kralen worden eerst gesplitst in drie porties. Elk deel wordt omgezet met een ander reagens, genereren van de eerste rest van kralen. Na de eerste reactie worden drie porties samengevoegd, gemengd en opnieuw verdeeld in drie porties. Elk deel zal weer reageren met een ander reagens, het genereren van het tweede residu op kralen. Na twee stappen split-en-zwembad, zijn negen verbindingen gegenereerd.

In sub-monomeer synthese worden kralen eerst verdeeld in verschillende porties met verschillende broom zuren bij aanwezigheid van een koppelingsreagens. Na wassen met oplosmiddel alle kralen elkaar en gemengd worden samengevoegd, opnieuw verdeeld in meerdere porties reageren met verschillendeprimaire aminen. Na aminering worden alle kralen samengevoegd en grondig gewassen, het voltooien van een volledige monomeer op elke kraal. Dit proces kan worden herhaald totdat de gewenste diversiteit wordt bereikt.

2. Voorbereiding van zuurbromide van Natural Aminozuren

In sub-monomeer synthese, wordt de synthese van elke monomeer bestaat uit twee stappen: 1. Koppeling van zuurbromide en 2 aminering met primaire aminen (figuur 2).. Om een ​​peptide tertiair amide synthetiseren, zullen chirale zuurbromiden met zijketens op de alfa koolstof worden bereid uit natuurlijke aminozuren. Hier beschrijven we de werkwijze het transformeren van een natuurlijk aminozuur in het overeenkomstige zuur bromide met high fidelity stereo. Wij gebruiken alanine als voorbeeld; andere aminozuren zoals serine, threonine, asparaginezuur, glutaminezuur, asparagine, glutamine, glycine, valine, isoleucine, fenylalanine kan ook worden omgezet in broom zuren onder vergelijkbare conditions. Merk op dat sommige van de aminozuren met functionele groepen zoals fenol, guanidine en amine beschermd moeten worden voor de transformatie. Het reactiemengsel instelling wordt getoond in figuur 3.

Veiligheidsmaatregelen: Voor de volgende reacties met HBr, nano 2 en andere bijtende / giftige chemicaliën, de juiste veiligheidsuitrusting zoals een veiligheidsbril, laboratoriumjas, en chemisch bestendige handschoenen zijn nodig. Alle reacties dienen in een zuurkast worden uitgevoerd door ervaren chemicus.

  1. Voeg 370 ml water in 630 ml 48% HBr oplossing voor een 1 L, 30% HBr oplossing te bereiden. Voeg 500 ml ethyleenglycol in een 1 L bad container; voeg droog ijs om de temperatuur op -10 ° C te houden Let op: 48% HBr-oplossing is sterk zuur en bijtend, met zorg te behandelen. Lees het veiligheidsinformatieblad voor gebruik.
  2. D-alanine (8,9 g, 0,1 mol) en KBr (11,9 g, 0,1 mol) In een 250 ml drie-hals rondbodemkolf met een magnetische roerstaaf. Voeg 100 ml, en de 30% HBr voorbereid in thij vorige stap. Plaats de kolf in een bad ethyleenglycol bereid in stap 2.1 en houd de temperatuur op -10 ° C. Bubble argon via een lange naald uit de bodem van de kolf gedurende 10 minuten zoals getoond in figuur 3. Roer de oplossing met magnetische roerstaaf bij 300 tpm.
  3. Los NaNO 2 (8.28 g, 0.12 mol) in een bekerglas van 100 ml met 20 ml water. Voeg de oplossing in de druk druppeltrechter en sluit de druppeltrechter met een septum. Draai langzaam aan op het ventiel van de trechter met kraan en laat de Nano 2 oplossing vallen in de kolf. Controle van de klep naar de druipende tarief aan te passen tot ongeveer 2 druppels per sec. Houd het roeren bij 300 tpm en houdt het argon borrelen vanaf de bodem van de kolf. De kolf moet ethyleenglycol water worden bewaard bij -10 ° C totdat alle NaNO 2 wordt toegevoegd. Let op: Deze stap genereert warmte en gas tijdens de toevoeging van NaNO 2 oplossing. Druipend tarief moet zorgvuldig con zijngecontroleerde en het hele systeem moet open zijn door de argon stopcontact.
  4. Blijf roeren nog 3 uur en laat de temperatuur opwarmen van -10 ° C tot kamertemperatuur. De verkregen oplossing moet helder tot lichtgeel te zijn; Als de kleur te donker toepassing vacuüm de overmaat stikstofoxiden en mogelijke Br2 die tijdens de reactie te verwijderen.
  5. Extraheer het product uit de oplossing met 3x 35 ml diethylether met extractiemiddel trechter. Combineer de organische fase en was het met verzadigde pekel. De organische fase kan ook een kleine hoeveelheid NaHCO3 gewassen vóór wassen met zoutoplossing om de kleur te verwijderen als het donker is. Droog de ​​organische fase op natriumsulfaat 2 SO 4 6 uur.
  6. Filteren uit de Na 2 SO 4 en verdampen van het oplosmiddel onder vacuüm, moet ruwe product worden verkregen als duidelijk gele olie bleek. Het ruwe product kan verder worden gezuiverd door destillatie bij 115 ° C, 3 mm Hg, ofsilicakolom met 03:01 hexaan: ethylacetaat.
  7. Zuivere product verkregen als heldere olie, 6,6 g (opbrengst 74%), dichtheid = 1,69 g / ml, [α] D20 = +24 ° (methanol), 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4,41 (q, J = 7,0 Hz, 1H), 1,86 (d, J = 7,0 Hz, 3H). In het geval van (S)-2-broompropaanzuur-d 4 (bereid uit d 4-L-alanine) zuiver product verkregen als heldere olie, opbrengst 78%, dichtheid = 1,72 g / ml, [α] D20 = -19 ° (methanol). 1H NMR, is geen significante H signaal waargenomen. ESI-MS - [M-1] - = 155,1 (verwacht 154,97). Voor (S)-2-broom-4-methylpentaanzuur (bereid uit L-leucine volgens dezelfde procedure) zuiver product verkregen als heldere olie, opbrengst 89%, [α] D20 = +37 ° (methanol), 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4,30 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 1,94 (dd, J = 10,8, 3,9 Hz, 2H), 1,81 (tt, J = 13,2, 6,5 Hz, 1H), 0,96 (dd, J = 18,2, 6,6 Hz, 7H). In het geval van (S)-2-broom-3-phenylpropanoic zuur (bereid uit L-fenylalanine volgens dezelfde procedure) zuiver product verkregen als lichtgele olie, opbrengst 72%, [α] D20 = +17 ° (methanol), 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,38 - 7,19 (m, 5H), 4,42 (dd, J = 8,1, 7,3 Hz, 1H), 3,47 (dd, J = 14,2, 8,2 Hz, 1H), 3,25 (dd, J = 14,2, 7,2 Hz, 1H).

3. Isotopische labeling van alanine behulp Transaminase

In combinatorische bibliotheek synthese, vooral in de split-and-pool synthese van een-tje een-verbinding (OBOC) bibliotheken, de hoeveelheid verbinding die kan worden verkregen uit elke kraal is relatief klein. (Typisch 1 pmol tot 10 nmol). Bovendien wordt massaspectrometrie schaal gebruikt voor de identificatie en karakterisering van de uiteindelijke verbinding vanwege de hoge gevoeligheid. Om massaspectrometrie om de absolute stereochemie bepalen op de chirale centra van de uiteindelijke PTA producten moeten broomzuur enantiomeren isoto zijnpically gelabeld voor gebruik. Hier beschrijven we de methode van het gebruik transaminase en D 2 O labelen L-alanine.

  1. Los op L-alanine (300 mg, 3,36 mmol) met 10 ml D 2 O in een 50 ml polyethyleen buis. Voeg α-ketoglutarate (10 mg, 0.068 mmol) als co-substraat. Verwarm de buis tot 37 ° C en stel het Pd naar 8,5-8,7 met een 1 M NaOD soution. Opmerking: PD wordt bepaald door de pH teststrips. Traditionele electro pH-meter met glas-elektrode selectief voor H + kan geven onjuiste voorgelezen voor D +.
  2. Voeg alaninetransaminase (0,1 mg, EC 2.6.1.2 van varken hart, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) op de PD 8,5-8,7, 37 ° C oplossing bereid uit de vorige stap. Zet de buis in een 37 ° C incubator en incubeer overnacht te schudden met milde, is 10 tot 30 rpm voorkeur.
  3. Na overnacht incubatie neem 0,5 ml van de D2O oplossing en controleer de reactievoortgang door 1H-NMR. Alle proton signalen van eenlanine, δ 3,76 (q, J = 7,2 Hz, 1H), 1,46 (d, J = 7,3 Hz, 3H), 1H NMR 400 MHz, moet sterk worden onderdrukt door deuterering. Meer dan 98% van de protonen worden uitgewisseld deuterium zoals eerder 23 beschreven. Noot: D 2 O kan gedeeltelijk worden teruggewonnen door destillatie als de reactie wordt uitgevoerd op grote schaal (> 200 ml D 2 O). Gewoonlijk kan 60% tot 80% van D2O worden gedestilleerd uit de oplossing.
  4. Bevries de bovenstaande oplossing met vloeibare stikstof en lyofiliseren met behulp van een vriesdroger om witte deuterated L-alanine poeder te verkrijgen.

4. Synthese van peptoïde linkergebied

Het linkergebied is niet vereist voor PTA bibliotheek synthese. Echter, teneinde de hoge achtergrond in de laagmoleculaire bereik (100-600) van MALDI massaspectrometrie voorkomen en de ionisatie van de verbindingen te verbeteren, een peptoïde linker met meerdere polaire residuen vaak gebruikt. Dit peptoïde linker kan worden gesynthetiseerd via standaard peptoïde synthese procedure. Hier zullen we een pentameer van N-methoxyethyl glycine synthetiseren als linker (zie figuur 5).

  1. Swell 90 urn Tentagel kralen RAM linker (1 g, 0,27 mmol / g) in 10 ml DMF gedurende 3 uur in een 12 ml spuit reactor met milde schudden.
  2. Giet de DMF uit de reactor en voeg 10 ml 20% piperidine DMF oplossing voor de fmoc groep bescherming te ontdoen van de Rink amide linker. Schud de bolletjes met 20% piperidine-oplossing gedurende 30 minuten. Wassen met DMF 5x alle piperidine te verwijderen.
  3. Neem een ​​paar parels uit de spuit en test het met chloranil test. Kralen moeten donkerbruin (chloranil testen positief voor primair amine) uitschakelen als fmoc succes wordt ontschermd.
  4. Bereid de volgende oplossingen:. 1 20 ml, 2 M broomazijnzuur / DMF oplossing; 2 20 ml, 2 M DIC / DMF oplossing.; 3. 10 ml, 1 M methoxylethylamine / DMF oplossing.
  5. Voeg 5 ml 2 M broomazijnzuur / DMF oplossingde kralen, schud voorzichtig. Voeg vervolgens 5 ml 2 M DIC / DMF oplossing van de kralen; sluit de spuit met de zuiger en zet het op de shaker. Schud gedurende 10 minuten.
  6. Was de kralen met DMF grondig. Voeg 2 ml van 1 M methoxyethylamine / DMF oplossing bereid uit stap 4.4 om de kralen. Dicht de spuit met de zuiger en schud het op de shaker gedurende 30 minuten.
  7. Was de kralen met DMF 5x. Check een paar kralen met chloranil test, als positief (kralen blauw worden), ga dan verder met de volgende stap. Anders, herhaal stap 4.6.
  8. Herhaal stap 4,5-4,7, 4x het pentameer voltooien.

. 5 Split-en-zwembad Synthese van PTA Bibliotheek met (R) - en (S)-2-bromopropionic Zuren

Hier beschrijven we de synthese van een kleine PTA bibliotheek met een theoretische diversiteit van 9261 verbindingen met de 1 g korrels uit stap 4.8. Merk op dat een 90 micrometer TentaGel kraal bevat ongeveer 2.900.000 kralen per gram; daarom redundantie vande bibliotheek zal zijn 2,9 x 10 6/9261 = 312 exemplaren. We zullen broomazijnzuur, (R)-2-bromopropanoic en isotopen gelabeld (S)-2-broompropaanzuur-d4 als de zuren en 7 verschillende aminen (A1 ~ A7, zie Figuur 5 voor details) voor aminering. Spuit reactoren en een vacuüm spruitstuk wordt gebruikt om de synthese te voeren.

  1. Voeg 10 ml van 01:01 DCM: DMF om de spuit uit stap 4.8; gebruik maken van een 1000 ui pipet met een afgeknotte pipet tip om alle 1 g kralen gelijkmatig verdeeld in drie 5 ml spuit reactoren. Label deze als B (broomazijnzuur), R ((R)-2-bromopropanoic) en S ((S)-2-broompropaanzuur-d4). Was alle 3 spuiten met DCM 3x, en was spuiten gelabeld met R en S met watervrij THF 3x, wassen spuit gemerkt met B met DMF 3x.
  2. Spuit R en S. BTC koppeling van broompropaanzuur.
    1. Bereid een verse BTC / THF oplossing. Voeg eenpproximately 200 mg van BTC in het flesje in een zuurkast, sluit deze af met de dop. Weeg de hoeveelheid van BTC in de flacon. Bereken de hoeveelheid oplosmiddel nodig is en voeg watervrij THF in de flacon een 20 mg / ml BTC / THF oplossing.
    2. Bereid de broom zuren / BTC mengsel. Voeg (R)-2-broompropaanzuur (89 pl, 0,95 mmol) en (S)-2-broompropaanzuur-d 4 (89 pl, 0,95 mmol) in twee kleine flesjes apart. Om elke flacon, voeg 5 ml van de meer dan 20 mg / ml BTC / THF oplossing. Dicht de twee flacons en zet ze in -20 ° C vriezer gedurende 20 minuten.
    3. Voeg 1125 pi, 02:01 THF / DIPEA (750 pi THF, 375 ul DIPEA, 2,2 mmol) op R en S spuit afzonderlijk. Meng de kralen met de pipet tip. Laat ze gaan zitten voor 5 minuten.
    4. Neem de twee gekoelde broom zuren / BTC mengsels van stap 5.2.2, voeg 2,4,6-trimethylpyridine (356 pl, 2,7 mmol) aan elk flesjes. Wit neerslag onmiddellijk gevormd. Breng de bijbehorende schorsing directde basisch gemaakt kralen (spuit R en S in stap 5.2.3) zo snel mogelijk en zet ze op een shaker te schudden onder 120 rpm gedurende 2 uur.
      Opmerking: De oplossing in de injectiespuit reactoren zou een lichtgele suspensie gedurende het hele verloop van de reactie. Een donkere kleur is een indicatie van excessieve warmte die vrijkomt bij de eerste toevoeging van het zuurchloride oplossing. Dit kan opgelost worden door verdere afkoeling of verdunde het broom zuren / BTC mengsel.
  3. Spuit B. Broomazijnzuur koppeling met DIC
    1. Bereid een verse 20 ml, 2 M broomazijnzuur / DMF oplossing. Bereid een 20 ml, 2 M DIC / DMF oplossing.
    2. Voeg 2 ml 2 M broomazijnzuur / DMF oplossing voor spuit B, schud voorzichtig. Voeg 2 ml 2 M DIC / DMF oplossing voor spuit B, schud voorzichtig.
    3. Zet spuit B op dezelfde shaker als spuit R en S
  4. Na 2 uur, neemt injectiespuit R, S en B van de shaker. Was alle drie spuiten grondig met DCM 5x. Daarna wassen met DMF 5x. Let spuit R en S kan niet met DMF gewassen voordat het gewassen met DCM en THF eerste.
  5. Pool alle kralen uit spuiten R, S en B in een 12 ml spuit reactor. Was alle kralen met DMF 5x.
  6. Voeg 10 ml 1:1 DCM: DMF op de spuit; gebruik maken van een 1000 ui pipet met een afgeknotte pipet tip om alle kralen gelijkmatig verdeeld in 7 individuele 2 ml spuiten, ze bestempelen als A1-A7.
  7. Aminering. Bereid 10 ml, 2 M primaire amine / DMF oplossing voor elk van de 7 aminen in figuur 5 weergegeven. Voeg 5 ml each amine oplossing in de overeenkomstige injectiespuit A1-A7. Incubeer alle 7 spuiten in een 60 ° C incubator met schudden 's nachts.
  8. Na incubatie, was alle kralen grondig met DMF. Neem een ​​paar van kralen uit elke spuit en laat met chloranil test. Als de kralen groen (positief) binnen 3 minuten, ga verder met de volgende stap. Indien negatief, herhaal stap 5.7 voor de negatieve spuiten.
  9. Herhaal stap 5,1-5,8 2x de trimeer voltooien. Optionele stap: Na elke cyclus, raden we aan om de kwaliteit synthese controleren door massaspectrometrie, zoals hieronder beschreven. Alle 9261 verbindingen worden nu gesynthetiseerd op TentaGel kralen als OBOC bibliotheek.
  10. Massaspectroscopische bevestiging van PTA.
    PTA's zijn zeer gestructureerd oligomeren en bezitten vele gemeenschappelijke kenmerken van N-gemethyleerde peptiden. Een van de gemeenschappelijke problemen van vaste fase synthese van N-gemethyleerde peptiden de zure afbraak tijdens TFA klieving. Om zuur degradatie, splitsing van moleculen zoals cyclosporine uit onderdrukkenvaste drager wordt vaak uitgevoerd onder lage temperatuur uitgevoerd. We vergeleken verschillende splitsende voorwaarden voor het klieven verschillende PTA moleculen van de vaste drager. We vonden dat algemeen lage temperatuur en verminderde TFA concentratie kan effectief onderdrukken zuur afbraak en zorgen zuivere verbindingen.
    1. Bereid 10 ml 01:01 TFA / DCM oplossing in een 15 ml buis. Dicht de buis en zet het in een -20 ° C vriezer gedurende 20 minuten.
    2. Was de kralen die moeten worden gesplitst met DCM 5x. Schud de kralen in DCM gedurende 15 minuten en was de kralen opnieuw met DCM 5x.
    3. Giet de DCM uit de spuit. Gebruik een lichtmicroscoop en een pipet met afgeknotte tip om elke individuele kraal te zetten in een 96-well plaat, een kraal per putje.
    4. Bedek de plaat met 96 putjes met een dekglas. Plaats de plaat in een -20 ° C vriezer gedurende 15 minuten.
    5. Neem de afgekoelde 01:01 TFA / DCM oplossing van stap 5.10.1 en voeg 20 ul aan elk van de putjes die een kraal bevat. Plaats het deksel slip rug en put 96-well plaat op een schudder in de -20 ° C koelkast.
    6. Schud gedurende 20 minuten. Neem de 96-well plaat uit en trek het deksel slip. Föhnen van de TFA / DCM uit elk putje door te blazen lucht of argon overheen. Indien meer dan 10 korrels worden gesplitst, kan een speedvac worden droog TFA / DCM het hele bord. Merk op dat op dit moment niet alle verbindingen zijn afgesplitst de kralen, maar het gesplitste verbindingen zou meer dan genoeg om de massa spectroscopie analyse uit te voeren.
    7. Voeg 20 ul 06:04 ACN: H2O oplossing voor het gesplitste verbindingen oplossen van elk putje. Spot 0,6 ul van elke verbinding oplossing samen met 0,6 pi CHCA MALDI matrix op de MALDI plaat.
    8. Gebruik MALDI massaspectrometrie om het molecuulgewicht en sequentie (MS / MS) van elke verbinding te bepalen.

6. Chloranil Test

  1. Bereid de volgende reagentia vers voor elke test. Oplossing A: 2% chloranil (CAS: 118-75-2) in DMF. OplossingB: 2% acetaldehyde (CAS: 75-07-0) in DMF.
  2. Meng 100 ul oplossing A met 100 ul oplossing B voor de test in een 1,5 ml buis; laat de kralen in en schud. Als parels worden blauw binnen 5 min, duidt de aanwezigheid van secundaire amine op het oppervlak van de korrels. Primaire amines een donker bruine kleur in plaats van zich blauw.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hier laten we drie representatieve MALDI spectra van een PTA trimeer met linker. Zoals getoond in figuur 6A, wanneer gesplitst bij kamertemperatuur met 50% TFA / DCM oplossing, wordt significante afbraak waargenomen. In figuur 6A, pieken 593 en 484 corresponderen met de linker en PTA trimeer respectievelijk blijkt dat het hele molecuul met succes gesynthetiseerd op bead maar afgebroken tijdens splitsing. Wanneer gesplitst bij lage temperatuuromstandigheden zoals hierboven beschreven, wordt de hoeveelheid TFA-geïnduceerde degradatie sterk onderdrukt zoals getoond in figuur 6B. Het mechanisme van deze splitsing is beschreven in eerdere literatuur 24, en het wordt verondersteld om door een oxazolidine tussenproduct. PTA moleculen kunnen worden gesequenced door MS / MS fragmentatie en het patroon is vergelijkbaar met die van peptiden en peptoïden, zoals weergegeven in figuur 6C. PTA moleculen gesynthetiseerd met (S)-2-broompropaanzuur-d4 algemeen give bredere piek op MS en MS / MS spectra door de aanwezigheid van incomplete deuteringsgraad zoals (S)-2-broompropaanzuur-d 3 (figuren 7A en 7B). Dit kan gebruikt worden als een indicatie van de aanwezigheid van de R chirale centrum (omgekeerde van S tijdens aminering) tijdens sequencing procedure. We vonden ook dat PTA moleculen de neiging om sodiated adducten dan peptoïde / peptide vormen derhalve natriumarm water (zoals dionized water) en kunststof toestellen voorkeur (figuur 7C). Een ander bijproduct dat kan worden waargenomen in PTA synthese acrylamide gevormd door het schrappen van bromide in aminering (Figuur 7C). Zodra de acrylamide gevormd, wordt de sequentie beëindigd. Dit kan worden opgelost door het verlagen van de concentratie van de primaire amine tot 1 M om de basiciteit van de oplossing te verminderen. Wij raden het uitvoeren van de chloranil test na elke acyleringsstap en met behulp van massa spectroscopy het product te controleren na elke aminering Om de kwaliteit van de bibliotheek te waarborgen.

Figuur 1
Figuur 1. Structurele vergelijking peptide, peptoïde, PTA en N-gemethyleerde peptide. PTA omvat peptide (R2 = H), peptoïde (R1 = H) en N-gemethyleerde peptide (R1 ≠ H, R2 = Me) . B) PTA voorkeur trans amideband conformatie als gevolg van de sterische hindering tussen twee α-zijketen. C) PTA heeft ook een voorkeur conformatie als gevolg van 1,3 allylisch spanning tussen N-vervanger en α-zijketen. Klik hier om bekijk een grotere versie van deze figuur.


Figuur 2. Sub-monomeer synthese van peptoïde (R ­ 1 = H) en PTA (R1 ≠ H). Eerste stap is het zuur acylering van het amine. Tweede stap is aminering met primaire amines. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Reaction setup. A 250 ml drie-hals rondbodemkolf wordt in een droogijs / ethyleenglycol bad. De middelste hals is verbonden met een druk 150 ml druppeltrechter. De linker en rechter hals afgesloten zijn met een flow control adapter en een septum wet een lange naald waarmee argonstroom passeren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. Basis van split-and-pool synthese. Blanco korrels worden verdeeld in drie gedeelten, afzonderlijk behandeld met reagens A, B en C. Na de eerste reactie, de drie gedeelten kralen samen gemengd en samengevoegd. Samengevoegde kralen worden opnieuw verdeeld in drie porties en opnieuw behandeld met zelfde reagens voor elke portie. Na de tweede reactie, worden 9 verschillende verbindingen gesynthetiseerd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.


Figuur 5. Library structuur overzicht. Drie PTA's worden gesynthetiseerd na de pentamer peptoïde linker. Theoretische diversiteit, 3 3 X 7 3 = 9261. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6
Figuur 6. Typische MALDI massa spectra van een PTA trimeer. A) Trimer PTA afgesplitst met 50% TFA / DCM bij kamertemperatuur. PTA structuur zoals getoond, [M +1] + = 1077, [M + Na] + = 1,098.9, PTA fragmentatie TFA splitsing is duidelijk zichtbaar op het spectrum. B) Trimer cleaved met 50% TFA / DCM onder geoptimaliseerde voorwaarde zoals beschreven in het artikel. TFA-induceren zuur afbraak wordt sterk onderdrukt. C) MS / MS spectrum van de PTA trimeer. Zwakke Y7 (916) signaal wordt waargenomen, dit is een typisch versnippering gedrag voor PTA. Spectra geanalyseerd en gegenereerd door mMass 32. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 7
Figuur 7. MALDI spectra van PTA synthese met isotopen gelabelde monomeer en typische bijproducten. A) MS spectra vergelijking van PTA moleculen gesynthetiseerd door blauw: (R)-2-bromopropanoic [M +1] + = 760 [M + Na] + = 787 [M + K] + = 803 en rode: (S) - 2-broompropaanzuur-d 4 [M +1] + = 764 [M + Na] + = 783 [M + K] + = 799 B.) MS / MS fragmentatie patronen van de twee moleculen getoond in A). Merk op dat door de aanwezigheid van d1, d2 en d3 specerijen (incomplete deuteringsgraad van alanine), moleculen gesynthetiseerd door (S)-2-broompropaanzuur-d 4 geven doorgaans bredere pieken C) Red. Spectrum van PTA dimeer gesynthetiseerd en gesplitst onder optimale conditie. Blauw:. PTA dimeer gesynthetiseerd met 2 M methoxyethylamine oplossing en gesplitst in normale gefilterd water Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Peptide tertiaire amiden (PTA's) zijn een superfamilie van peptidomimetische oligomeren. Naast de goed bestudeerde peptiden, peptoïden en N-gemethyleerd peptiden, een groot deel van verbindingen binnen deze familie blijft understudied, majorly gebrek aan synthesemethode om algemene N-gealkyleerde peptiden. Hier een efficiënte methode beschrijven we PTA synthetiseren met chirale bouwstenen afgeleid van aminozuren. Eerder hebben we gemeld dat zij een nieuwe sub-monomeer route naar synthese bibliotheken van PTA moleculen 23 te gebruiken. We hebben aangetoond dat PTA sterk gestructureerd oligomeren conformationele weerhoudt bezitten door de netwerkverbindingen. Bij testen in vivo, PTA moleculen toonde verbeterde celdoorlaatbaarheid en dus verbeterde activiteit 25. Echter, samen met alle voordelen, PTA's ook komen met een aantal synthetische uitdagingen, vreselijk uit de acylering van secundaire amines op gehinderde posities. De α-zijketen die conformational biedtbeperking brengt ook sterische hindering voor de volgende koppelingsstap. Om deze synthetische uitdagingen te overwinnen, voerden we een uitgebreide studie en optimalisatie bepaald BTC als beste koppelingsreagens voor deze reactie 23.

De belangrijkste stap van de syntheseweg is BTC vergemakkelijkt acylering van de secundaire amine. Tijdens dit proces BTC maakt het genereren van een zuurchloride in situ 26,27. De meeste andere koppelingsmiddelen, die of actieve esters of zuuranhydriden als tussenproducten vormen geen schone acylering continue PTA synthese verschaffen. Het bestaan ​​van eerdere PTA-eenheden sterk afbreuk doet aan de koppeling efficiëntie van de volgende PTA-eenheid als gevolg van sterische hindering. Daarom is voor de synthese van meerdere PTA, een zeer actieve tussenproduct met een klein leaving groep sterk de voorkeur. Van alle koppeling voorwaarden die we hebben getest, in situ gegenereerd zuurchloride door BTC werkt de best in onze hand. Echter, zelfs bij de zeer actieve zuurchloriden, raden wij sterk sterische gehinderde aminen zoals α-vertakte primaire aminen in bibliotheek synthese voorkomen tenzij vooraf getest. Aromatische aminen zoals Anile leiden vaak onvolledig vervanging en dus moeten worden vermeden. Tijdens de BTC koppelingsstap, moet de oplossing altijd een lichtgele tot oranje kleur; een donkere gekleurde oplossing is een indicatie van oververhitting en kan leiden tot lagere opbrengst en een verhoogde vorming van nevenproducten. Dit kan in het algemeen worden opgelost door verdere koeling van de BTC oplossing, de grootte van de reactie en snellere overdracht van de geactiveerde BTC / zuuroplossing. Bovendien BTC, N-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1 ,2-dihydrochinoline (EEDQ) is een koppelingsreagens voor uiteen PTA synthese. Het sleuteltussenproduct is een gemengd Koolzuuranhydride met een relatief klein leaving groep. Bij EEDQ wordt 3 equivalent van EEDQ opgelost samen met het zuur in DCM en vervolgens apgetwijnd tot de hiel bij kamertemperatuur. De reactie wordt gewoonlijk uitgevoerd in 2 uur met milde schudden. Deze reactie komt CO 2 tijdens de reactie; dus het reactiesysteem niet gesloten.

Een andere belangrijke stap is de splitsing en de karakterisering van PTA moleculen. Een onderscheidend MS / MS fragmentatie patroon werd waargenomen toen sequentie PTA moleculen via MALDI-MS/MS (figuur 6). Het bestaat met een lage intensiteit van de laatste y ionen (getoond in paars in figuur 6C en toegenomen intensiteit van Y6, Y5, Y4, b2, b3 ionen). Analoog patronen zijn waargenomen van N-gemethyleerde peptidefragmentatie in het vorige verslag 28. Vanwege de verhoogde stabiliteit van het tussenproduct oxazolidine, N-gemethyleerd peptiden vaak sterke b ionen geven 28. Bovendien is het bekend dat N-gemethyleerde peptide zuurgevoelige zowel tijdens TFA klieving en MALDI massaspectrometrie 24,28, 29. Mechanistisch onderzoek heeft aangetoond dat door de conformationele beperking van de ruggengraat, het carbonyl zuurstofatoom van de voorgaande residu vaak in de nabijheid van de carbonylgroep op de splitsingsplaats, dus het bevorderen van de vorming van de oxazolidine tussenproduct 29. Om bovengenoemde redenen, zowel PTA en N-gemethyleerd peptiden moeten worden gesplitst van vaste dragers bij lage temperatuur met gereguleerde concentraties van TFA 26, 30. In onze ervaring, de meest geschikte splitsingsmethode afzonderlijke PTA residuen optreedt bij -20 ° C met een voorgekoeld, -20 ° C oplossing van 50% TFA / DCM. Deze procedure sterk onderdrukt de vorming van zuur afgebroken producten.

Na het beheersen van deze techniek, kan de bibliotheek met PTA monomeer afgeleid van andere natuurlijke aminozuren zoals leucine, fenylalanine, glutamine, enz. worden gesynthetiseerd. Een hoge kwaliteit PTA bibliotheek kan worden gescreend against diverse eiwit targets met behulp van onze eerder gepubliceerde on-bead screeningsprotocollen 31. Hit verbindingen geïdentificeerd van de screening kan worden gekarakteriseerd door massaspectroscopie en opnieuw gesynthetiseerd verdere test met de hierboven beschreven protocol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgements

De auteurs willen graag Dr Jumpei Morimoto en Dr Todd Doran bedanken voor waardevolle hulp. Dit werk werd ondersteund door een contract van de NHLBI (NO1-HV-00242).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,4,6 trimethylpyridine ACROS 161950010 CAS:108-75-8
2-morpholinoethanamine Sigma-Aldrich 06680 CAS:2038-03-1  
48% HBr water solution ALFA AESAR AA14036AT CAS:10035-10-6
Acetaldehyde Sigma-Aldrich 402788 CAS:75-07-0  
Acetonitrile Fisher SR015AA-19PS CAS:75-05-8
Anhydrous tetrahydrofuran (THF) EMD EM-TX0277-6 CAS:109-99-9
Benzylamine Sigma-Aldrich 185701 CAS:100-46-9
bis(Trichloromethyl) carbonate (BTC) ACROS 258950050 CAS:32315-10-9
Bromoacetic acid ACROS 106570010 CAS:79-08-3
Chloranil Sigma-Aldrich 23290 CAS:118-75-2
Cyclohexanemethylamine Sigma-Aldrich 101842 CAS:3218-02-8
D2O Cambridge Isotope DLM-4-99.8-1000 CAS:7789-20-0
D-Alanine Anaspec 61387-100 CAS:338-69-2
Dichloromethane (DCM) Fisher BJ-NS300-20 CAS:75-09-2
Dimethylformamide (DMF) Fisher BJ-076-4 CAS:68-12-2
Ethylene glycol Oakwood 44710 CAS:107-21-1
Isopentylamine Sigma-Aldrich W321907 CAS:107-85-7
KBr ACROS 424070025 CAS:7758-02-3
L-Alanine Anaspec 61385-100 CAS:56-41-7
3-Methoxypropylamine Sigma-Aldrich M25007 CAS:5332-73-0
2-Methoxyethylamine Sigma-Aldrich 143693 CAS:109-85-3
N-(3-Aminopropyl)-2-pyrrolidinone Sigma-Aldrich 136565 CAS:7663-77-6 
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC) ACROS 115211000 CAS:693-13-0
N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Sigma-Aldrich D125806 CAS:7087-68-5
NaNO2 ACROS 424340010 CAS:7631-99-4
NAOD 40% solution in water ACROS 200058-506 CAS:7732-18-5
Piperidine ALFA AESAR A12442-AE CAS:110-89-4
Piperonylamine Sigma-Aldrich P49503 CAS:2620-50-0
Propylamine Sigma-Aldrich 240958 CAS:107-10-8
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich 299537 CAS:76-05-1
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma-Aldrich 39468 CAS:28166-41-8  
α-Ketoglutarate ALFA AESAR AAA10256-22 CAS:328-50-7
Tentagel Resin with RINK linker Rapp-Polymere S30023
Alanine transaminase Roche 10105589001 AKA: Glutamate-Pyruvate Transaminase (GPT)
Incubator New Brunswick Scientific Innova44
NMR Bruker 400 MHz
MALDI mass spectrometer Applied Biosystems 4800 MALDI-TOF/TOF
Lyophilizer SP Scientific VirTis benchtop K
Syringe reactor INTAVIS Reaction Column 3 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml
Vacuum manifold Promega A7231 Vac-Man

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xiao, X., Yu, P., Lim, H. -S., Sikder, D., Kodadek, T. Design and Synthesis of a Cell-Permeable Synthetic Transcription Factor Mimic. Journal of Combinatorial Chemistry. 9, 592-600 (2007).
  2. Miller, S. M., et al. Proteolytic Studies of Homologous Peptide and N-Substituted Glycine Peptoid Oligomers. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 4, 2657-2662 (1994).
  3. Grauer, A., Konig, B. Peptidomimetics - A Versatile Route to Biologically Active Compounds. European Journal of Organic Chemistry. 30, 5099-5111 (2009).
  4. Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. Efficient method for the preparation of peptoids [oligo(N-substituted glycines)] by submonomer solid-phase synthesis. Journal of the American Chemical Society. 114, 10646-10647 (1992).
  5. Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S. C., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. Synthesis of N-substituted glycine peptoid libraries. Methods in Enzymology. 267, 437-447 (1996).
  6. Seebach, D., et al. beta-peptides: Synthesis by Arndt-Eistert homologation with concomitant peptide coupling. Structure determination by NMR and CD spectroscopy and by X-ray crystallography. Helical secondary structure of a beta-hexapeptide in solution and its stability towards pepsin. Helv Chim Acta. 79, 913-941 (1996).
  7. Lam, K. S., et al. A New Type of Synthetic Peptide Library for Identifying Ligand-Binding Activity. Nature. 354, 82-84 (1991).
  8. Simon, R. J., et al. Peptoids - a Modular Approach to Drug Discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 9367-9371 (1992).
  9. Burkoth, T. S., et al. Toward the synthesis of artificial proteins: the discovery of an amphiphilic helical peptoid assembly. Chem Biol. 9, 647-654 (2002).
  10. Alluri, P. G., Reddy, M. M., Bachhawat-Sikder, K., Olivos, H. J., Kodadek, T. Isolation of protein ligands from large peptoid libraries. Journal of the American Chemical Society. 125, 13995-14004 (2003).
  11. Lim, H. S., Archer, C. T., Kodadek, T. Identification of a peptoid inhibitor of the proteasome 19S regulatory particle. Journal of the American Chemical Society. 129, 7750-7751 (2007).
  12. Wrenn, S. J., Weisinger, R. M., Halpin, D. R., Harbury, P. B. Synthetic ligands discovered by in vitro selection. Journal of the American Chemical Society. 129, 13137-13143 (2007).
  13. Aina, O. H., Marik, J., Liu, R. W., Lau, D. H., Lam, K. S. Identification of novel targeting peptides for human ovarian cancer cells using "one-bead one-compound" combinatorial libraries. Mol Cancer Ther. 4, 806-813 (2005).
  14. Udugamasooriya, D. G., Dineen, S. P., Brekken, R. A., Kodadek, T. A Peptoid “Antibody Surrogate” That Antagonizes VEGF Receptor 2 Activity. Journal of the American Chemical Society. 130, 5744-5752 (2008).
  15. Shah, N. H., et al. Oligo( N-aryl glycines): A New Twist on Structured Peptoids. Journal of the American Chemical Society. 130, 16622-16632 (2008).
  16. Chongsiriwatana, N. P., et al. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 2794-2799 (2008).
  17. Paul, B., et al. N-Naphthyl Peptoid Foldamers Exhibiting Atropisomerism. Organic Letters. 14, 926-929 (2012).
  18. Crapster, J. A., Guzei, I. A., Blackwell, H. E. A peptoid ribbon secondary structure. Angewandte Chemie. 52, 5079-5084 (2013).
  19. Gorske, B. C., Stringer, J. R., Bastian, B. L., Fowler, S. A., Blackwell, H. E. New strategies for the design of folded peptoids revealed by a survey of noncovalent interactions in model systems. J Am Chem Soc. 131, 16555-16567 (2009).
  20. Stringer, J. R., Crapster, J. A., Guzei, I. A., Blackwell, H. E. Extraordinarily robust polyproline type I peptoid helices generated via the incorporation of alpha-chiral aromatic N-1-naphthylethyl side chains. J Am Chem Soc. 133, 15559-15567 (2011).
  21. Huang, K., et al. A threaded loop conformation adopted by a family of peptoid nonamers. Journal of the American Chemical Society. 128, 1733-1738 (2006).
  22. Lee, J. H., Kim, H. S., Lim, H. S. Design and Facile Solid-Phase Synthesis of Conformationally Constrained Bicyclic Peptoids. Organic Letters. 13, 5012-5015 (2011).
  23. Gao, Y., Kodadek, T. Synthesis and Screening of Stereochemically Diverse Combinatorial Libraries of Peptide Tertiary Amides. Chem Biol. 20, 360-369 (2013).
  24. Urban, J., Vaisar, T., Shen, R., Lee, M. S. Lability of N-alkylated peptides towards TFA cleavage. Int J Pept Protein Res. 47, 182-189 (1996).
  25. Rzuczek, S. G., Gao, Y., Tang, Z., Thornton, C. A., Kodadek, T., Disney, M. D. Features of Modularly Assembled Compounds That Impart Bioactivity Against an RNA Target. ACS Chemical Biology. 8, (10), 2312-2321 (2013).
  26. Thern, B., Rudolph, J., Jung, G. Triphosgene as highly efficient reagent for the solid-phase coupling of N-alkylated amino acids—total synthesis of cyclosporin O. Tetrahedron Letters. 43, 5013-5016 (2002).
  27. Sleebs, M. M., Scanlon, D., Karas, J., Maharani, R., Hughes, A. B. Total Synthesis of the Antifungal Depsipeptide Petriellin A. J Org Chem. 76, 6686-6693 (2011).
  28. Vaisar, T., Urban, J. Gas-phase fragmentation of protonated mono-N-methylated peptides. Analogy with solution-phase acid-catalyzed hydrolysis. Journal of Mass Spectrometry. 33, 505-524 (1998).
  29. Creighton, C. J., Romoff, T. T., Bu, J. H., Goodman, M. Mechanistic studies of an unusual amide bond scission. Journal of the American Chemical Society. 121, 6786-6791 (1999).
  30. Sewald, N., Sewald, N. Efficient, racemization-free peptide coupling of N-alkyl amino acids by using amino acid chlorides generated in situ--total syntheses of the cyclopeptides cyclosporin O and omphalotin A. Angewandte Chemie (International ed. in English). 41, 4661-4663 (2002).
  31. Astle, J. M., et al. Seamless Bead to Microarray Screening: Rapid Identification of the Highest Affinity Protein Ligands from Large Combinatorial Libraries. Chem Biol. 17, 38-45 (2010).
  32. Strohalm, M., Kavan, D., Novak, P., Volny, M., Havlicek, V. mMass 3: a cross-platform software environment for precise analysis of mass spectrometric data. Anal Chem. 82, 4648-4651 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics