Una strategia per sensibili, su larga scala quantitative Metabolomica

1Division of Nutritional Sciences, Cornell University, 2Field of Biochemistry, and Molecular Cell Biology, Cornell University
Published 5/27/2014
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Biology

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Summary

Metabolita profiling è stato un bene prezioso per lo studio del metabolismo in salute e malattia. Utilizzando cromatografia normale fasi liquida accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione con commutazione di polarità e un ciclo rapido, si descrive un protocollo per analizzare la composizione metabolica polare di materiale biologico con elevata sensibilità, precisione e risoluzione.

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Liu, X., Ser, Z., Cluntun, A. A., Mentch, S. J., Locasale, J. W. A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics. J. Vis. Exp. (87), e51358, doi:10.3791/51358 (2014).

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Abstract

Metabolita profiling è stato un bene prezioso per lo studio del metabolismo in salute e malattia. Tuttavia, piattaforme attuali hanno diversi fattori limitanti, come il lavoro intensivo preparazione del campione, limiti di rilevabilità bassi, velocità di scansione lenta, ottimizzazione del metodo intensivo per ciascun metabolita, e l'incapacità di misurare sia positivamente e ioni negativi in ​​singoli esperimenti. Pertanto, un nuovo protocollo metabolomica potrebbe avanzare gli studi di metabolomica. Cromatografia idrofilo a base di ammide consente analisi metabolita polare senza derivatizzazione chimica. Alta risoluzione MS utilizzando il Q-Exactive (QE-MS) ha migliorato ottica ionica, maggiore velocità di scansione (256 msec alla risoluzione di 70.000), e ha la capacità di svolgere / commutazione positiva e negativa. Utilizzando una strategia di estrazione metanolo freddo, e accoppiando una colonna ammide con QE-MS consente robusta rilevamento di 168 metaboliti polari mirati e migliaia di funzionalità aggiuntive contemporaneamente. Datun trattamento avviene con il software disponibile in commercio in un modo altamente efficiente, e caratteristiche sconosciute estratte dagli spettri di massa può essere interrogato in database.

Introduction

Metabolomica, definiti come un esperimento che misura più metaboliti contemporaneamente, è stata una zona di forte interesse. Metabolomica fornisce una lettura diretta di fisiologia molecolare e ha fornito intuizioni in sviluppo e malattie come il cancro 1-4. Risonanza magnetica nucleare (NMR) e spettrometria cromatografia-massa del gas (GC-MS) sono tra gli strumenti più comunemente utilizzati 5-9. NMR, in particolare è stato utilizzato per esperimenti di flusso in quanto composti marcati con isotopi pesanti, come ad esempio 13 metaboliti C etichettati, sono NMR attivo 10,11. Tuttavia, questa strategia richiede relativamente elevata purezza del campione e grandi quantità di campione, il che limita le sue applicazioni in metabolomica. Nel frattempo, i dati raccolti da NMR analisi delle esigenze intensiva e assegnazione composta di spettri NMR complesso è difficile. GC-MS è stato ampiamente utilizzato per metaboliti polari e studi lipidici, ma richiede componen volatilids e quindi spesso derivatizzazione dei metaboliti, che a volte coinvolge la chimica complessa che può richiedere molto tempo e introduce rumore sperimentale.

Cromatografia liquida (LC) accoppiato a tripla spettrometria di massa a quadrupolo utilizza il primo quadrupolo per selezionare gli ioni madri intatte, che vengono poi frammentate nel secondo quadrupolo, mentre il terzo quadrupolo viene utilizzato per selezionare frammenti caratteristici o ioni figlia. Questo metodo, che registra il passaggio da ioni madri a specifici ioni figlia, è denominata multiple reaction monitoring (MRM). MRM è un metodo molto sensibile, preciso e robusto sia per piccole molecole e proteine ​​quantificazione 12-15,21. Tuttavia, MRM ha i suoi limiti. Per ottenere un'elevata specificità di un metodo MRM deve essere costruita per ogni metabolita. Questo metodo consiste nell'identificare un frammento specifico e corrispondente energia di collisione ottimizzata, che richiede pre-conoscenza della propeproprietā dei metaboliti di interesse, come ad esempio informazioni di struttura chimica. Pertanto, con alcune eccezioni che comportano la perdita neutro di frammenti comuni, non è possibile identificare metaboliti non noti con questo metodo.

Negli ultimi anni, la spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS) strumenti sono stati rilasciati, come la serie LTQ-Orbitrap e Exactive, il QuanTof, e TripleTOF 5600 16-18,22. HRMS possono fornire una massa rapporto carica (m / z) degli ioni intatto, per un errore di pochi ppm. Pertanto, uno strumento HRMS operato da rilevare tutti gli ioni precursori (cioè modalità di scansione completa) può ottenere informazioni strutturali diretto dalla massa esatta e la composizione elementare risultante dell'analita, e queste informazioni possono essere utilizzate per identificare potenziali metaboliti. Infatti, tutte le informazioni relative ad un composto può essere ottenuta con una massa esatta, fino al livello di isomeri strutturali. Inoltre, una completametodo di scansione non richiede conoscenza precedente dei metaboliti e non richiede l'ottimizzazione metodo. Inoltre, poiché tutti gli ioni con m / z compreso nel range di scansione possono essere analizzati, HRMS ha una capacità praticamente illimitata in termini di numero di metaboliti che possono essere quantificati in una sola passata rispetto al metodo MRM. HRMS è paragonabile ad un MRM triplo quadrupolo capacità quantitativa causa del breve ciclo di lavoro con un conseguente numero paragonabile di punti di dati che possono essere ottenuti in una MS scansione completa. Pertanto, HRMS offre un approccio alternativo per metabolomica quantitativi. Recentemente, una versione migliorata del HRMS chiamato spettrometria di massa Q-Exactive (QE-MS) può essere utilizzato sotto la commutazione tra i modi positivi e negativi con tempi di ciclo sufficientemente veloce in un unico metodo, che amplia il campo di rilevamento 19. Qui si descrive la nostra strategia metabolomica utilizzando il QE-MS.

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Protocol

1. Preparazione di LC-MS Reagenti, Istituzione di un metodo cromatografico, e Istituzione di strumenti procedure operative

  1. Preparazione di solventi LC
    1. Preparare 500 ml fasi mobili. A è acetato di ammonio 20 mM e 15 mM idrossido di ammonio in 3% acetonitrile / acqua, pH finale 9.0; e B è 100% acetonitrile.
    2. Liberamente tappo della bottiglia, metterla in un sonicatore bagnomaria, e sonicare per 10 minuti senza riscaldamento supplementare. (Questo passaggio è quello di garantire che tutti i sali di ammonio dissolvono completamente e che non ci siano bolle d'aria residue.)
    3. Trasferire 250 ml di solvente per una bottiglia di vetro da 250 ml per uso LC-MS, e mantenere il resto a 4 ° C.
  2. Preparare la soluzione di taratura gamma bassa di massa. E 'importante utilizzare una gamma bassa massa miscela personalizzata calibrazione per applicazioni metabolomica per garantire che masse accurate vengono rilevati a basso peso molecolare.
    1. Pesare 5 mg sia sodium fluoroacetate e acido omovanillico e sciogliere in 5 ml di acqua per fare una concentrazione finale di 1 mg / ml. Sciogliere diazinon in metanolo per effettuare una concentrazione finale di 10 mg / ml.
    2. Per preparare 1 ml di soluzione negativa basso calibrazione di massa, mescolare 960 ml di soluzione negativa termo calibrazione con 20 ml di fluoroaceate sodio e soluzione di acido omovanillico. Per fare 1 ml di soluzione positiva a basso calibrazione di massa, mescolare 990 ml di termo soluzione di calibrazione positivo e 10 ml di soluzione diazinone. (La soluzione di taratura massa bassa deve essere conservato a 4 ° C ed essere preparato fresco ogni 2 mesi).
  3. Taratura di QE-MS ad una Messa Low Range
    1. Prima di eseguire la calibrazione gamma bassa massa, effettuare una calibrazione massa standard (m / z, 150-2,000) in modalità sia positivi che negativi in ​​base alle istruzioni del produttore.
    2. Una volta che passa una calibrazione di massa regolare, regolare l'intervallo di scansione a 60-900 m / z nel pannello di controllo dello strumentoe viene applicato un CID fonte di 25 eV per modalità positiva e 35 eV per modalità negativa. (Questo darà segnali stabili del frammento ione caffeina e lo ione solfato. L'intervallo di scansione qui è fisso, perché l'ultima m / z non deve essere maggiore di 15x del partendo m / z)
    3. Una volta che la sorgente di ioni è stabile, quindi eseguire la calibrazione personalizzato. Nota: Una fonte stabile è definita come meno del 10% della variazione corrente ionica totale in modalità positiva, e meno del 15% in modo negativo. Gli ioni di calibrazione personalizzati e corrispondenti m / z sono elencati nella Tabella 1.
  4. Stabilire la strumentazione LC-MS per l'analisi metabolita polare. LC è accoppiato ad un QE-MS per la separazione metabolita e rilevamento.
    1. Dotare il QE-MS con una sonda di ionizzazione elettrospray riscaldata (H-ESI). Impostare i parametri di ottimizzazione rilevanti per la sonda elencati: temperatura del riscaldatore, 120 ° C; gas guaina, 30; gas ausiliario, 10; spazzare gas, 3; spruzzo di tensione, 3,6 kV permodalità positiva e 2,5 kV per modalità negativa. Impostare la temperatura capillare a 320 ° C, e S-lente a 55.
    2. Costruire un metodo di scansione completa come segue: Fascia Scansione completa: da 60 a 900 (m / z); Risoluzione: 70.000; tempo massimo di iniezione: 200 msec con tempi di iniezione tipici intorno a 50 msec; controllo automatico del guadagno (AGC): 3.000.000 di ioni. Queste impostazioni determinano un ciclo di lavoro di circa 550 msec per eseguire scansioni in modalità sia positivi che negativi.
    3. Stabilire il metodo cromatografico. Impiegare una colonna ammide (100 x 2,1 mm di diametro, 3.5 mm) per la separazione composto a temperatura ambiente 13,15. La fase mobile A è come sopra descritto, e la fase mobile B è acetonitrile. Utilizzare un gradiente lineare come segue: 0 min, 85% B; 1.5 min, 85% B, 5.5 min, 35% B; 10min, 35% B, 10.5 min, 35% B, 14.5 min, 35% B, 15 min, 85% B e 20 min, 85% B. La portata è di 0,15 ml / min tra 0 e 10 min e 15 per 20 min, e 0,3 ml / min 10,5-14,5 min.

2. Preparation del metabolita Campioni

  1. Preparare un solvente di estrazione. Miscelare 40 ml di metanolo (LC-MS grado) e 10 ml di acqua (grado LC-MS) in un tubo da 50 ml, e tenerlo in freezer -80 ° C per almeno 1 ora prima dell'uso. Nota: Questa procedura e alle fasi che seguono possono essere modificati per l'estrazione di tessuto biologico e di campioni di fluido.
    1. Culture cancro colon HCT 8 cellule in tre 10 centimetri piatti o piastre da 6 pozzetti con terreno di coltura completo, RPMI 1640 supplementato con 10% inattivato al calore siero fetale bovino e 100.000 unità / L penicillina e 100 mg / L streptomicina.
    2. Quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza, rimuovere rapidamente il mezzo, e posizionare il piatto o piatto sulla parte superiore del 13,15 ghiaccio secco. Aggiungere estrazione 1 ml di solvente immediatamente (80% metanolo / acqua), e trasferire la piastra al -80 ° C freezer. Per un piatto 10 cm e aggiungere 3 ml di solvente di estrazione per ciascun pozzetto. (Prova per rimuovere il mezzo più possibile per evitare l'effetto di soppressione ionica causa di sali residui di mezzo.)
    3. Lasciare la piastra per 15 min. Togliere dal freezer, e raschiare le cellule nel solvente in ghiaccio secco. Trasferire la soluzione in 1,7 ml provette Eppendorf e centrifugare con la velocità di 20.000 xga 4 ° C per 10 min. (Preparare metaboliti cellulari da tre piatti separati per fare tre campioni replicati. Lo scopo di mantenere due tubi è di avere uno come backup.)
    4. Trasferire il supernatante in due nuove provette Eppendorf, e asciugarli nel vuoto velocità. Questo richiede circa 3-6 ore a seconda della velocità di aspirazione utilizzata. (I campioni possono anche essere essiccate per una notte sotto gas azoto.)
    5. Dopo tubi di essiccazione, negozio di ciascun campione nel -80 ° C freezer. Quando si è pronti, ricostituire un campione in 20 ml di acqua (LC-MS grado), e iniettare 5 ml di LC-QE-MS per l'analisi.

3. Impostazione di Sequenza Campione

  1. Una volta che la taratura è stata correttamente effettuata sul QE-MS, LC colonna equilibrare per 5 minuti con il 85% e ad un flussovelocità di 0,15 ml / min, che è la condizione iniziale della sfumatura LC.
  2. Impostare la sequenza di esempio in ordine casuale. Nota: In questo modo, distribuisce le fluttuazioni introdotte dal LC-MS per ogni campione e assicura confronto più accurato tra diversi campioni. Ogni 6 campioni, aggiungere una pista di lavaggio, che condivide lo stesso metodo MS, tranne il gradiente LC è 95% A per 10 min e seguita da un 5 min colonna equilibrazione al 85% A con una portata di 0,15 ml / min. Aggiungere campioni bianchi (100% acqua) dopo ogni corsa lavaggio di valutare lo sfondo del sistema e riportare i livelli.
  3. Salvare la sequenza e una volta che la colonna LC mostra la pressione stabile, circa 400 psi, inizia la corsa sequenza. Se non c'è altro campione è da eseguire dopo questa sequenza, quindi aggiungere una corsa di arresto alla fine della sequenza, che ha una portata di 0 ml / min alla fine del gradiente e scegliere "stand-by" dopo aver terminato l' sequenza.
  4. Eseguire nuovamente lo stesso campione fissato 12 ore dopo la calibrazione. (Questo is per valutare la fluttuazione errore massa dopo la calibrazione.)

4. Post Analisi Strumento di pulizia e manutenzione

  1. Al termine della sequenza, lavare la colonna con 95% Un ad una portata di 0,2 ml / min per 2 h, e se necessario, invertire la colonna prima del lavaggio.
  2. Rimuovere la colonna LC e collegare direttamente il LC alla sorgente di ioni da un sindacato. Preparare detergente, acqua / metanolo / acido formico (v: v: v, 90:10:0.2), impostare MS in modalità standby, e sistema di lavaggio LC-MS ad una portata di 0,1 ml / min per 1 ora per rimuovere il residuo precipitato sali o altre impurità. Abbassare la portata se c'è pressione dell'impianto troppo.
  3. Impostare la temperatura capillare a 50 ° C, e rimuovere la gabbia ione. Estrarre con attenzione il cono ione sweep e il condotto di trasferimento ionico dopo che la temperatura capillare scende a 50 ° C. Utilizzare una maglia ruvida come carta vetrata, per rimuovere le impurità lasciati sulla superficie del cono ione sweep.
  4. Posizionare il trasferimento di ionitubo in un tubo Falcon da 15 ml contenente 10 ml di 90% di acqua / metanolo contenente 0,1% di acido formico. Dopo sonicating la provetta in un bagno sonicatore acqua per 20 minuti, decantare il solvente all'interno, sostituirlo con 10 ml di metanolo puro e con ultrasuoni per altri 20 min. (Se necessario, la sonicazione può essere effettuata a 40 ° C o una temperatura ancora più elevata per ottenere migliori risultati di lavaggio.)

5. Analisi LC-MS Data

  1. Per la sequenza del campione senza intoppi, dopo aver terminato i primi due campioni della sequenza, controllare i picchi di metaboliti sconosciuti. Utilizzare un file csv che elenca i nomi dei metaboliti, formula chimica neutro e modalità di rilevamento (positivo o negativo), come file di input, e il file di output contiene picchi estratti ed errori di massa in ppm. Se la forma del picco è anormale o l'errore di massa è spento da più di 5 ppm, il resto della sequenza deve essere fermato e risoluzione di problemi deve essere fatto.
  2. Scegliere il metodo di "allineamento piccoed estrazione frame "sul software disponibile in commercio. Selezionare i dati grezzi da LC-MS e di gruppo. Scegli campioni nel mezzo della sequenza di esecuzione come campione di riferimento cromatografia per l'allineamento di picco. Carica un seme telaio compresi i metaboliti noti per l'analisi dei metaboliti mirato con i dati raccolti e il relativo seme telaio.
  3. Effettuare l'analisi dei dati in modalità positiva e negativa separatamente. Utilizzare l'impostazione predefinita per gli altri parametri. Disattivare la funzione di ricerca del database ed eseguire il flusso di lavoro. Esportare i dati elaborati da un foglio excel contenente area del picco di ogni frame. Il primo set di fotogrammi corrispondono ai metaboliti nel elenco mirato. Nota: Per un'analisi metabolita mirata, le informazioni metaboliti è ottenuta sulla base degli studi precedenti 13,15.
  4. Per un'analisi metabolita non mirati, scegliere il metodo di "estrazione componente". Caricare i campioni in bianco per sottrazione del fondo. Impostare picco di intensità soglia di unt 10 5, larghezza m / z di 10 ppm e rapporto segnale-rumore di 3.
  5. Utilizzare il database metabolome umano per l'identificazione di composti sconosciuti. Utilizzare un filtro CV a rimuovere i componenti con grandi curricula all'interno di campioni replicati. Passare manualmente ogni componente e scegliere quelli con picchi ben definiti o relativamente grande differenza in diversi tipi di campioni per la ricerca nel database. I dati di esportazione con risultati in database. (Allineamento Peak potrebbe essere aggirato se il punteggio di allineamento picco è troppo bassa.)

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Representative Results

L'accuratezza dei dati metabolomica dipende molto dalle prestazioni LC-QE-MS strumento. Per valutare se lo strumento funziona in buone condizioni, e se il metodo applicato è corretto, diversi metaboliti noto picchi LC sono estratte dal cromatografia ionica totale (TIC), come mostrato nella Figura 1. Metaboliti polari inclusi amminoacidi, intermedi glicolisi , intermedi TCA, nucleotidi, vitamine, ATP, NADP + e così via hanno una buona conservazione delle colonne e buon picco di forme nella colonna ammide in condizioni di LC attuali. Nel frattempo, una prova di errore massa avviene entro 24 ore dopo la calibrazione bassa massa, come illustrato nella Figura 2. 6 differenti concentrazioni dei campioni in triplice copia vengono eseguite due volte dopo la calibrazione, e l'intero intervallo di tempo copre quasi 24 hr. L'errore di massa viene valutata confrontando la rilevata m / z alla teorica m / z di metaboliti mirati. Qui i metaboliti mirati di un m / zda 74 (glicina) a 744 (NADP +). L'asse Y qui rappresenta la percentuale cumulativa di metaboliti entro un certo intervallo di errore di massa. La curva blu mostra il risultato 0-12 ore, mentre la curva di colore rosso indica i dati raccolti 12-24 ore. Figura 2 indica chiaramente che oltre il 90% dei metaboliti si trovano a 5 ppm errore di massa, il che significa che la massa bassa metodo di calibrazione gamma sviluppata qui è sufficiente a mantenere errore di massa 5 ppm per il rilevamento gamma bassa di massa.

Un altro problema da affrontare è la sensibilità dello strumento con il metodo corrente e la configurazione dello strumento. Una diluizione seriale di campioni in triplicato da 10 cm piastra di Petri è stato fatto 5 volte con un fattore di diluizione di 6, finendo con 6 differenti concentrazioni dei campioni. Questi campioni rappresentano la quantità di metaboliti estratti da 10 7, 1,67 x 10 6, 2,78 x 10 5, 4,63 x 10 4, 7,72 x 10 3, e 1,29x 10 3 cellule, rispettivamente. Poiché ciascuna concentrazione di campione viene preparato in triplice copia, un totale di 18 campioni sono analizzati in LC-QE-MS. Un elenco mirato viene utilizzato per valutare il numero di metaboliti individuati a per diverse concentrazioni di campione. Il risultato in figura 3 indica che il numero ottimale di metaboliti mirati rilevate è tra 2,78 x 10 5 e 1,67 x 10 6 cellule, mentre 1 x 10 7 cellule danno un minor numero di metaboliti identificati, che è causa di effetti di soppressione ionica. Questo risultato indica che la quantità ottimale di cellule per estrarre per questa analisi è all'incirca quella di un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.

Per l'analisi metabolita non mirati, un cutoff CV del 20% e un valore medio di intensità di 10 7 vengono usati per filtrare la tabella componenti. Questi valori soglia CV e l'intensità media rigidi sono utilizzati per questo scopo dimostrativo. Per migliorare la riproducibilità, valori di cutoff CV possono essereaumentato (per esempio, 30%), mentre i valori di intensità media devono essere diminuito (per esempio, 10 5) per includere più picchi. Dopo aver controllato manualmente i picchi, vengono selezionati i componenti con buone forme e cercato nel database metabolome umana. I risultati sono mostrati nella Tabella 2. Tabella 2A elenca i risultati dei dati raccolti in modalità positiva, mentre la tabella 2B mostra i risultati di modalità negativa. Alcuni dei metaboliti identificati qui sovrapporsi ai metaboliti in elenco mirato, come il glutatione, prolina e così via, ma nel frattempo, metaboliti aggiuntivi fuori dalla lista mirata sono esplorate, come methyglyoxal, che può essere derivato dalla glicolisi, e 1 -palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina, che viene rilevata in positivo con un tempo di ritenzione di 3,2 min, che è una ritenzione ragionevole per fosfolipidi su una colonna ammide. Un protocollo sulla mirati ricerca del database metabolita è stato previously riportato 20.

Figura 1
Figura 1. Esempi di LC-MS picchi cromatografici. Qui, la cromatografia ricostruita viene generato con una finestra di 10 ppm di massa (m / z ± 5 ppm). L'asse X mostra il tempo di ritenzione, mentre l'asse Y indica la relativa intensità, e il picco di intensità è elencata sopra di ogni metabolita. Una mostra picchi rilevati dal modo positivo, mentre B mostra picchi dal modo negativo. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 2
Figura 2. 60;. Valutazione della calibrazione gamma bassa massa L'asse Y è la percentuale cumulativa di metaboliti con l'errore di rilevamento di massa entro 5 ppm. L'asse X è l'intervallo di errore di massa in ppm. Curve blu e quella rossa 0-12 ore e 12-24 ore, rispettivamente. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 3
. Figura 3 Valutazione delle quantità di campione -. Numero di metaboliti mirati individuati funzione del numero di HCT 8 celle quadrati rossi rappresentano metaboliti identificati in modo positivo, cerchi blu significano metaboliti misurati in modo negativo, ed i triangoli neri sono i numeri totali di metaboliti sia da modalità positiva e negativa. L'asse X mostra il numero di HCT 8 celle.upload/51358/51358fig3highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

<td> NA
Standards M / Z, modalità positiva M / Z, modalità negativa Formula Neutral Massa Neutral
n-Butylamine 74.096425 NA C 4 H 11 N 73.089149
Frammento Caffeina 138.066188 NA C 6 H 8 N 3 O 137.058912
Caffeina 195.087652 NA C 8 H 11 N 4 O 2 194.080376
Diazinon 305.108329 NA C 12 H 20 N 2 O 3 PS 304.101053
MRFA peptide 524.264966 C 23 H 37 N 7 O 5 S 523,25769
Fluoroacetate N / A 77.004432 C 2 H 3 FO 2 78.011708
Solfato N / A 96.960106 H 2 SO 4 97.967382
L'acido omovanillico N / A 181.050634 C 9 H 10 O 4 182,05791
Solfato Dodecyl N / A 265.147906 C 12 H 26 SO 4 266.155182
Taurocolato N / A 514.2844 C 26 H 45 NO 7 S 515.291676

Tabella 1. Standard di calibrazione gamma bassa massa e la loro esatta m / z.

<td> 131,05901
CSID Nome Formula Monoisotopico Mass Cerca di massa Errore (ppm) RT (min)
234 beta-alanina C 3 H 7 NO 2 89,04800 89,04805 0.62 8.08
1057 Sarcosina C 3 H 7 NO 2 89,04768 89,04805 4.22 8.08
5735 alanina C 3 H 7 NO 2 89,04768 89,04805 4.22 8.08
568 Creatinina C 4 H 7 N 3 O 113,05900 113,05889 1.00 4.41
128.566 Proline C 5 H 9 NO 2 115,06333 115,06338 0.41 7.54
6050 L-(+)-Valina C 5 H 11 NO 2 117,07898 117,07896 0.18 7.42
7762 Nitrito di amile I C 5 H 11 NO 2 117,07898 117,07896 0.18 7.42
135 Acido 5-ammino valeric C 5 H 11 NO 2 117,07900 117,07896 0.38 7.42
242 trimetilglicina C 5 H 11 NO 2 117,07900 117,07896 0.38 7.42
911 Niacinamide C6H6N2O 122,04800 122,04793 0.55 2.60
1091 Taurin C 2 H 7 NO 3 S 125,01466 125,01469 0.20 7.61
1030 L'acido idrossicarbossilico pirrolina C 5 H 7 NO 3 129,04259 129,04259 0.02 8.51
7127 PCA C 5 H 7 NO 3 129,04259 129,04259 0.02 8.51
90.657 N-Acryloylglycine C 5 H 7 NO 3 129,04259 129,04259 0.02 8.51
388.752 5-Oxo-D-prolina C 5 H 7 NO 3 129,04259 129,04259 0.02 8.51
389257 3-idrossi-3 ,4-diidro-2H-pirrolo-5-carbossilico C 5 H 7 NO 3 129,04259 129,04259 0.02 8.51
8031176 L'acido Pyrrolidonecarboxylic C 5 H 7 NO 3 129,04259 129,04259 0.03 8.51
5605 Idrossiprolina C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05901 5.83 8.08
7068 N-Acetylalanin C 5 H 9 NO 3 131,05824 5.83 8.08
79.449 Ac-Ala-OH C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05901 5.83 8.08
89122 Ethylformylglycine C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05901 5.83 8.08
167.744 L-glutammico-gamma-semialdeide C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05901 5.83 8.08
388.519 5-ammino-2-oxo-pentanoico acido C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05901 5.83 8.08
134 L'acido aminolevulinico C 5 H 9 NO 3 131,05800 131,05901 </ Td> 7.70 8.08
9312313 3-idrossi-L-prolina C 5 H 9 NO 3 131,05800 131,05901 7.70 8.08
566 Creatina C 4 H 9 N 3 O 2 131,06900 131,06905 0.36 8.08
5880 L-(+)-Leucina C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09455 0.68 6,96
6067 L-(+)-Isoleucina C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09455 0.68 6,96
19964 L-Norleucine C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09455 0.68 6,96 </ Td>
388.796 beta-Leucina C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09455 0.68 6,96
548 L'acido aminocaproicum C 6 H 13 NO 2 131,09500 131,09455 3.48 6,96
6031 L-(-)-Asparagina C 4 H 8 N 2 O 3 132,05350 132,05348 0.10 8.31
109 L'acido ureidopropionico C 4 H 8 N 2 O 3 132,05299 132,05348 3.71 8.31
6026 L-ornitina C 5 H 12 N 2 O 2 132,08987 132,08988 0.02 10.37
64236 D-ornitina C 5 H 12 N 2 O 2 132,08987 132,08988 0.02 10.37
5746 Glutammina C 5 H 10 N 2 O 3 146,06914 146,06900 0.93 8.25
128.633 D-glutammina C 5 H 10 N 2 O 3 146,06914 146,06900 0.93 8.25
141.172 L'acido Ureidoisobutyric C 5 H 10 N 2 O 3 146,06914 146,06900 0.93 8.25
21436 N-Metil-D <scp> </ scp> acido aspartico C 5 H 9 NO 4 147,05316 147.05300 1.13 8.06
21814 D-(-)-Acido glutammico C 5 H 9 NO 4 147,05316 147,05300 1.13 8.06
30572 L-acido (+)-glutammico C 5 H 9 NO 4 147,05316 147,05300 1.13 8.06
58744 N-acetil-L-serina C 5 H 9 NO 4 147,05316 147,05300 1.13 8.06
5907 L-(-)-metionina C 5 H 11 NO 2 S 149,05106 149,05095 0.70 7.39
6038 Istidina C 6 H 9 N 3 O 2 155,06947 155,06940 0.48 8.33
5910 L-(-)-Fenilalanina C 9 H 11 NO 2 165,07898 165,07887 0.63 6.60
1025 Piridossina C 8 H 11 NO 3 169,07390 169,07376 0.80 3.24
4463 Oxidopamine [USAN: INN] C 8 H 11 NO 3 169,07390 169,07376 0.80 3.24
102.750 5 - (2-amminoetil)-Pyrogallol C 8 H 11 NO 3 169,07390 169,07376 0.80 3.24
388.394 Noradrenalina C 8 H 11 NO 3 169,07390 169,07376 0.80 3.24
6082 L-(+)-Arginina C 6 H 14 N 4 O 2 174,11168 174,11144 1.39 10.77
64224 D-Arg C 6 H 14 N 4 O 2 174,11168 174,11144 1.39 10.77
780 heteroauxin C 10 H 9 NO 2 175,06300 175,06304 0.18 2.32
67261 Indolo-3-acetaldeide, 5-idrossi- C 10 H 9 NO 2 175,06332 175,06304 1.65 2.32
3574185 Indolo-2-acido acetico C 10 H 9 NO 2 175,06332 175,06304 1.65 2.32
5833 L-(-)-Tirosina C 9 H 11 NO 3 181,07390 181,07378 0.66 7.48
389.285 3-ammino-3-(4-idrossifenil) propanoico C 9 H 11 NO 3 181,07390 181,07378 0.66 7.48
13628311 L-treo-3-phenylserine C 9 H 11 NO 3 181,07390 181,07378 0.66 7.48
425 4-idrossi-4-(3-piridile) butanoic acido C 9 H 11 NO 3 181,07401 181,07378 1.25 7.48
13899 3 - (1H-indol-3-yl) acrilico C 11 H 9 NO 2 187,06332 187,06330 0.15 6.44
10607876 L'acido Indoleacrylic C 11 H 9 NO 2 187,06332 187,06330 0.15 6.44
389.120 N6, N6, N6-trimetil-L-lisina C 9 H 20 N 2 O 2 188,15248 188,15221 1.45 10.87
388.321 5 "-S-metil-5"-thioadenosine C 11 H 15 N 5 O 3 S 297,08957 297,08898 2.00 2.56
144 9 - (5-s-metil-5-thiopentofuranosyl)-9H-purin-6-ammina C 11 H 15 N 5 O 3 S 297,09000 297,08898 3.43 2.56
111.188 Glutatione C 10H 17 N 3 O 6 S 307,08380 307,08345 1.14 8.02

Tabella 2A.

5 H 9 NO 3 11 H 19 NO 9
CSID Nome Formula Monoisotopico Mass Cerca di massa Errore (ppm) RT (min)
857 Methylglyoxal C 3 H 4 O 2 72,02100 72,02108 1.03 7.70
1057 Sarcosina C 3 H 7 NO 2 89,04768 89,04747 2.33 8.19
5735 alanina C 3 H 7 NO 2 89,04768 89,04747 2.33 8.19
234 beta-alanina C 3 H 7 NO 2 89,04800 89,04747 5.93 8.19
55423 L'acido R-lattico C 3 H 6 O 3 90,03169 90,03143 2.91 5.12
61.460 L'acido idrossipropionico C 3 H 6 O 3 90,03169 90,03143 2.91 5.12
96.860 L-acido (+)-lattico C 3 H 6 O 3 90,03169 90,03143 2.91 5.12
592 Acido lattico C 3 H 6 O 3 90,03200 90,03143 6.29 5.12
650 Diidrossiacetone C 3 H 6 O 3 90,03200 90,03143 6.29 5.12
731 Gliceraldeide C 3 H 6 O 3 90,03200 90,03143 6.29 5.12
1086 Acido solforico H 2 O 4 S 97,96738 97,96683 5.63 8.13
128.566 Proline C 5 H 9 NO 2 115,06333 115,06302 2.67 7.78
1078 L'acido succinico C 4 H 6 O 4 118,02661 118,02630 2.66 7.72
466.979 Erythrono-1 ,4-lattone C4 H 6 O 4 118,02661 118,02630 2.66 7.72
4483398 D-Erythronic g-lattone C 4 H 6 O 4 118,02661 118,02630 2.66 7.72
473 Acido metilmalonico C 4 H 6 O 4 118,02700 118,02630 5.96 7.72
8527138 (3S, 4R) -3,4-Dihydroxydihydrofuran-2 (3H)-one C 4 H 6 O 4 118,02700 118,02630 5.96 7.72
140.384 Acido 2-ketocaproic C 6 H 10 O 3 130,06299 130,06270 2.24 2.35
164.251 L'acido Methyloxovaleric C 6 H 10 O 3 130,06299 130,06270 2.24 2.35
388.419 (3S)-3-metil-2-oxo-pentanoico acido C 6 H 10 O 3 130,06299 130,06270 2.24 2.35
15642233 Ketoleucine C 6 H 10 O 3 130,06299 130,06270 2.24 2.35
46 a-Oxo-b-methylvaleric acido C 6 H 10 O 3 130,06300 130,06270 2.36 2.35
69 Acido alfa-ketoisocaproic C 6 H 10 O 3 130,06300 130,06270 2.36 2.35
134 L'acido aminolevulinico 131,05800 131,05795 0.36 8.19
9312313 3-idrossi-L-prolina C 5 H 9 NO 3 131,05800 131,05795 0.36 8.19
5605 IDROSSIPROLINA C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05795 2.23 8.19
7068 N-Acetylalanin C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05795 2.23 8.19
79.449 Ac-Ala-OH C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05795 2.23 8.19
89122 Ethylformylglycine C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05795 2.23 8.19
167.744 L-glutammico-gamma-semialdeide C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05795 2.23 8.19
388.519 5-ammino-2-oxo-pentanoico acido C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05795 2.23 8.19
5880 L-(+)-Leucina C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09419 3.39 7.09
6067 L-(+)-Isoleucina C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09419 3.39 7.09
19964 L-Norleucine C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09419 3.39 7.09
388.796 beta-Leucina C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09419 3.39 7.09
548 L'acido aminocaproicum C 6 H 13 NO 2 131,09500 131,09419 6.18 7.09
109 L'acido ureidopropionico C 4 H 8 N 2 O 3 132,05299 132,05321 1.60 8.28
6031 L-(-)-Asparagina C 4 H 8 N 2 O 3 132,05350 132,05321 2.21 8.28
6026 L-ornitina C 5 H 12 N 2 O 2 132,08987 132,08961 1.98 10.36
64236 D-ornitina C 5 H 12 N 2 O 2 132,08987 132,08961 1.98 10.36
193.317 L-(-)-acido malico C 4 H 6 O 5 134,02153 134,02130 1.72 7.95
510 (±)-malico C 4 H 6 O 5 134,02200 134,02130 5.25 7.95
133.224 L'acido treonico C 4 H 8 O 5 136,03717 136,03688 2.14 7.70
388.628 L'acido 2,3,4-Trihydroxybutanoic C 4 H 8 O 5 136,03717 136,03688 2.14 7.70
2061231 L'acido DL-erythronic C 4 H 8 O 5 136,03717 136,03688 2.14 7.70
21436 N-Metil-D <scp> </ scp> acido aspartico C 5 H 9 NO 4 147,05316 147,05299 1.16 8.05
21814 D-(-)-Acido glutammico C 5 H 9 NO 4 147,05316 147,05299 1.16 8.05
30572 L-acido (+)-glutammico C 5 H 9 NO 4 147,05316 147,05299 1.16 8.05
58744 N-acetil-L-serina C 5 H 9 NO 4 147.05316 147,05299 1.16 8.05
6038 Istidina C 6 H 9 N 3 O 2 155,06947 155,06930 1.09 8.36
199 Allantoina C 4 H 6 N 4 O 3 158,04401 158,04387 0.88 4.76
6082 L-(+)-Arginina C 6 H 14 N 4 O 2 174,11168 174,11154 0.80 10.76
64224 D-Arg C 6 H 14 N 4 O 2 174,11168 174,11154 0.80 10.76
58576 Acido N-acetil-L-aspartico C 6 H 9 NO 5 175,04807 175,04803 0.18 7.87
996 Acid pirofosforico H 4 O 7 P 2 177,94299 177,94331 1.79 8.42
5589 Glucosio C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0.41 7.53
17893 Mannosio C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0.41 7.53
58.238 . Beta.-D-Glucopyranose C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0.41 7.53
71.358 . Alpha.-D-Glucopyranose C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0.41 7.53
134.838 3-deossi-arabino-hexonic acido C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0.41 7.53
388.332 L-Sorbopyranose C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0.41 7.53
388.476 beta-D-galattopiranosio C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0.41 7.53
388.480 . Alpha.-D-galattopiranosio C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0.41 7.53
388.775 beta-D-Fructofuranose C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0.41 7.53
10239179 Inositolo C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0.41 7.53
16736992 Cis-inositolo C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0.41 7.53
17216070 allosio C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0.41 7.53
17216093 L-sorbosio C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0.41 7.53
201 hexopyranose C 6 H 12 O 6 180,06300 180,06346 2.53 7.53
868 1,2,3,4,5,6-Cyclohexanhexol C 6 H 12 O 6 180,06300 180,06346 2.53 7.53
2068 Teofillina C 7 H 8 N 4 O 2 180,06473 180,06346 7.04 7.53
4525 1,7-dimetil-xantina C 7 H 8 N 4 O 2 180,06473 180,06346 7.04 7.53
5236 Teobromina C 7 H 8 N 4 O 2 180,06473 180,06346 7.04 7.53
1161 L'acido isocitrico C 6 H 8 O 7 192,02701 192,02704 0.15 8.18
305 CiL'acido Tric C 6 H 8 O 7 192,02699 192,02704 0.23 8.18
963 acido pantotenico C 9 H 17 NO 5 219,11067 219,11049 0.84 6.72
6361 L'acido D-pantotenico C 9 H 17 NO 5 219,11067 219,11049 0.84 6.72
960 acido palmitico C 16 H 32 O 2 256,23999 256,24000 0.05 1.73
111.188 Glutatione C 10 H 17 N 3 O 6 S 307,08380 307,08339 1.35 8.03
388.337 Acido N-acetilneuraminico 309,10599 309,10585 0.45 7.43
392.681 N-acetil-alfa-neuraminico acido C 11 H 19 NO 9 309,10599 309,10585 0.45 7.43
392.810 L'acido sialico Neu5Ac C 11 H 19 NO 9 309,10599 309,10585 0.45 7.43

Tabella 2B.

. Tabella 2 Elenco dei metaboliti non mirati individuati in HCT 8 celle (2.78 x 10 5 cellule equivalenza) 2A e 2B Tabella includono componenti estrazione di informazioni:. Tempo di ritenzione, m / z e l'errore di massa, e nel frattempo, i risultati di ricerca di database: ChemSpider ID ( CSID), nome, formula, e così via. Qui i campioni analizzati sono Equal di metaboliti estratti da 2,78 x 10 5 cellule, e la soglia di intensità è 1 x 10 7 per evitare risultato noioso per scopo dimostrativo.

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Discussion

I passaggi più critici per successo profiling metabolita in cellule usando questo protocollo sono: 1) controllo del mezzo di crescita e attenta estrazione delle cellule; 2) regolazione del metodo LC basato su MS configurazione metodo per assicurarsi che ci sia un numero sufficiente (di solito almeno 10) punti dati attraverso un picco per la quantificazione; 3) fare una calibrazione bassa massa prima di eseguire campioni; 4) l'iniezione non più di 5 ml di evitare tempi di ritenzione spostamento e allargamento della cuspide causati da acqua; e 5) la preparazione e l'esecuzione dei campioni per il confronto nella stessa partita per minimizzare gli effetti batch.

Le norme (Tabella 1), scelto qui per la calibrazione gamma bassa massa sono intercambiabili. Qualsiasi composto noto con m / z che cade nel campo di scansione di massa, è ben comportata in una sorgente H-ESI, ed è solubile in acqua, metanolo, acetonitrile o sono candidati ragionevoli per gli standard di calibrazione. Si consiglia vivamente di memorizzare tutte le soluzioni di taratura di unt 4 ° C per stabilizzare la caffeina e anche a minimizzare l'evaporazione del metanolo o acetonitrile nella soluzione di calibrazione in modo che le prestazioni di calibrazione può essere più riproducibile. Rispetto ad un intervallo di massa regolare, m / z da 150 a 2.000, deve essere calibrato gamma bassa massa essere fatto più frequentemente, almeno una volta ogni due giorni.

Questo flusso di lavoro, dal solvente di estrazione, la ricostituzione con solvente, LC fase mobile, a partire calibrazione range di massa e MS scansione di gamma è stato ottimizzato per misurare i metaboliti polari. Questo include aminoacidi, acetile aminoacidi, intermedi glicolisi pathway, nucleosidi, intermedi del ciclo TCA, alcuni intermedi del metabolismo pathway monocarboniose e così via. Tuttavia, le modifiche del presente protocollo per altre classi di metaboliti, quali le specie coenzima A (CoA), folati, fosfolipidi sono possibili. Ad esempio, CoAs sono più stabili in condizioni acide, per cui l'aggiunta di un acido al 80% di metanolo / acqua sarà utile per impsensibilità rove CoA. Inoltre, CoA e lipidi tendono ad avere grandi pesi molecolari molto, così la gamma di scansione m / z deve essere regolato 60-900 alla gamma adeguata che riguarderà questi metaboliti.

Anche se alcuni dei risultati di ricerca mirati di database componente di sovrapposizione con l'elenco mirato, è ancora importante per costruire questa lista mirata in base alla priorità di ricerca. Poiché i metaboliti della lista mirata sono inferiori alla soglia media intensità, informazioni su questi metaboliti verrà rimosso durante la lavorazione. L'elenco mirato include le informazioni di tempo di ritenzione, che ci dà maggiore fiducia per l'identificazione del metabolita e la quantificazione. Un ulteriore vantaggio con il setup QE-MS è che la spettrometria di massa tandem può consentire un'ulteriore identificazione di metaboliti.

Un problema associato a questo flusso di lavoro è che l'ago insi H-ESIrt è sensibile alla salinità dei campioni, come la sensibilità sarà notevolmente compromessa se ci sono elevate quantità di sali non volatili. Pertanto, riducendo al minimo contenuto di sali da campioni, e la pulizia di routine della colonna e la H-ESI inserimento dell'ago sarà utile a garantire i dati di buona qualità e aumentare la vita della colonna.

In sintesi, questo protocollo impiega LC-QE-MS per analizzare correttamente metaboliti polari da cellule in coltura, con minime fasi di preparazione del campione e rapida acquisizione dei dati. Piccole modifiche nella preparazione di campioni possono essere effettuate per ottenere dati da altre fonti biologici quali siero e nei tessuti. Per esempio, dal metanolo puro può essere aggiunto siero liquido aggiunto per rendere una concentrazione finale di metanolo al 80% per l'estrazione metaboliti polari. Per i campioni di tessuto, è necessario agitazione rigorosa e miscelazione per ottenere una migliore efficienza di estrazione. Di solito 10 ml di siero o1 mg di tessuto sufficiente per l'analisi metaboliti. I dati grezzi possono essere analizzati sia in modo mirato, se vi sono metaboliti noti nei campioni, e in modo non-targeting seguito da HRMS ricerca di database. Metabolomica HRMS based è ancora nelle sue fasi iniziali. Per i futuri progressi, le tecniche sperimentali possono essere ulteriormente ottimizzati, ulteriori informazioni HRMS metaboliti e dei modelli di frammentazione MS / MS saranno utili e pertinenti algoritmi, come l'allineamento di picco, l'integrazione picco, isotopo clustering e così via, può migliorare l'efficienza e l'accuratezza delle elaborazione dei dati. In definitiva, tuttavia, molte delle domande che i nostri indirizzi di laboratorio nel metabolismo sono limitati da un'attenta interpretazione dei dati dopo l'elaborazione. Con queste tecniche metabolomica su larga scala, siamo spesso limitati dalla nostra interpretazione dei dati e la valutazione di ipotesi generate. Pertanto, tutti gli esperimenti di metabolomica bisogno di essere formulate intorno a domande specifiche.

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Disclosures

Gli autori dichiarano assenza di conflitti di interesse.

Acknowledgements

Gli autori vorrebbero riconoscere Detlef Schumann, Jennifer Sutton (Thermo Fisher Scientific) e Nathaniel Snyder (Università della Pennsylvania) per le discussioni importanti sul calibrazione di massa ed elaborazione dei dati. Ricerca riportata in questa pubblicazione è stato sostenuto dal National Cancer Institute dei National Institutes of Health nel quadro Premio Numero R00CA168997. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Positive calibration mix Thermo Scientific #88323 It is light sensitive. Store at 4 °C
Negative calibration mix Thermo Scientific #88324 Store at 4 °C
Diazinon Sant Cruz Biotechnology #C0413 It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 °C
H-ESI needle insert Fisher Scientific #1303200 This could be replaced or cleaned with 5% formic acid/water (remove rubber ring) if clogged.
Xbridge amide column Waters #186004860 Guard column is recommend to increase column lifetime.

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