Une stratégie pour sensibles à grande échelle quantitatives métabolomique

1Division of Nutritional Sciences, Cornell University, 2Field of Biochemistry, and Molecular Cell Biology, Cornell University
Published 5/27/2014
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Biology

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Summary

Métabolite profilage a été un atout précieux dans l'étude du métabolisme de la santé et de la maladie. Utilisant chromatographie liquide normale progressive couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution avec changement de polarité et un cycle de service rapide, nous décrivons un protocole pour analyser la composition métabolique polaire de matériel biologique avec une grande sensibilité, la précision et la résolution.

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Liu, X., Ser, Z., Cluntun, A. A., Mentch, S. J., Locasale, J. W. A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics. J. Vis. Exp. (87), e51358, doi:10.3791/51358 (2014).

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Abstract

Métabolite profilage a été un atout précieux dans l'étude du métabolisme de la santé et de la maladie. Toutefois, les plates-formes actuelles ont des facteurs limitants, comme la main-d'œuvre intensive préparation des échantillons, les limites de détection basses, la vitesse de balayage lent, méthode intensive optimisation pour chaque métabolite, et l'incapacité de mesurer à la fois positivement et des ions chargés négativement dans des expériences simples. Par conséquent, un nouveau protocole de métabolomique pourrait faire progresser les études de métabolomique. Chromatographie hydrophile à base d'amide permet l'analyse des métabolites polaire sans dérivation chimique. SM à haute résolution à l'aide du Q-Exactive (QE-MS) a amélioré optique ionique, l'augmentation de la vitesse de balayage (256 ms avec une résolution de 70 000), et a la capacité d'effectuer la commutation positive / négative. En utilisant une stratégie d'extraction de méthanol froid, et le couplage d'une colonne d'amide avec QE-MS permet une détection robuste de 168 metabolites polaires ciblées et beaucoup d'autres fonctions simultanément. Datun traitement est effectué avec le logiciel disponible dans le commerce d'une manière très efficace, et des caractéristiques inconnues extraites à partir des spectres de masse peut être interrogé dans les bases de données.

Introduction

Métabolomique, définis comme une expérience qui mesure plusieurs métabolites simultanément, a été une zone d'intérêt intense. Métabolomique fournit une lecture directe de la physiologie moléculaire et a donné un aperçu dans le développement et la maladie comme le cancer 1-4. Résonance magnétique nucléaire (RMN) et la chromatographie-spectrométrie de masse gazeuse (GC-MS) sont parmi les instruments les plus couramment utilisés 5-9. RMN, en particulier a été utilisé pour des expériences de flux depuis composés marqués d'isotopes lourds, tels que 13 métabolites C marqués, sont actif en RMN 10,11. Cependant, cette stratégie nécessite la pureté de l'échantillon relativement élevée et grande quantité de l'échantillon, ce qui limite ses applications en métabolomique. Pendant ce temps, les données recueillies à partir de l'analyse des besoins RMN intensive et l'attribution composé de spectres RMN complexe est difficile. GC-MS a été largement utilisé pour les métabolites polaires et des études de lipides, mais il faut compoun volatileds et donc souvent une dérivatisation de métabolites, ce qui implique parfois chimie complexe qui peut prendre beaucoup de temps et introduit du bruit expérimental.

Chromatographie en phase liquide (LC) couplée à la spectrométrie de masse quadripolaire triple utilise le premier quadrupôle pour la sélection des ions parents intacts, qui sont ensuite fragmentés dans le second quadripôle, tandis que le troisième quadripole est utilisé pour sélectionner des fragments caractéristiques ou des ions fils. Cette méthode, qui enregistre le passage de la ions parents à ions fils spécifiques, est appelé surveillance de réaction multiple (MRM). MRM est une méthode très sensible, spécifique et robuste à la fois petite molécule et la quantification des protéines 12-15,21. Cependant, MRM a ses limites. Pour obtenir une grande spécificité d'une méthode MRM doit être construit pour chaque métabolite. Cette méthode consiste à identifier un fragment spécifique et l'énergie de collision optimisées, ce qui nécessite une connaissance préalable de la prope correspondantles parties prenantes des métabolites d'intérêt, tels que les informations de structure chimique. Par conséquent, à quelques exceptions impliquant la perte de neutre de fragments communs, il n'est pas possible d'identifier des metabolites inconnus avec cette méthode.

Dans les dernières années, à haute résolution (spectrométrie de masse) HRMS instruments ont été libérés, tels que la série LTQ-Orbitrap et Exactive, la QuanTof, et TripleTOF 5600 16-18,22. HRMS peuvent fournir un rapport masse sur charge (m / z) des ions intacts à l'intérieur d'une erreur de quelques ppm. Par conséquent, un instrument de gestion des ressources humaines exploité par la détection de tous les ions précurseurs (c'est à dire en mode balayage complet) peut obtenir des informations structurales directe de la masse exacte et la composition élémentaire résultant de l'analyte, et cette information peut être utilisée pour identifier des métabolites potentiels. En effet, toutes les informations sur un composé peut être obtenu avec une masse exacte, au niveau des isomères structuraux. En outre, un pleinméthode d'analyse ne nécessite pas de connaissance préalable de métabolites et ne nécessite pas l'optimisation des méthodes. En outre, étant donné que tous les ions avec m / z tomber dans la plage de balayage peuvent être analysés, HRMS a une capacité presque illimitée en termes de nombre de métabolites qui peuvent être quantifiés en un seul passage par rapport à la méthode de MRM. HRMS est également comparable à un MRM quadripolaire triple de la capacité quantitative due au cycle de service de courte entraîne un certain nombre comparable de points de données qui peuvent être obtenus dans une analyse complète du MS. Par conséquent, HRMS fournit une approche alternative pour la métabolomique quantitative. Récemment, une version améliorée de gestion des ressources humaines appelé Q-Exactive spectrométrie de masse (QE-MS) peut être utilisé sous la commutation entre les modes positifs et négatifs avec des temps de cycle suffisamment rapide en une seule méthode, qui élargit la gamme de détection 19. Ici, nous décrivons notre stratégie de métabolomique utilisant le QE-MS.

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Protocol

1. Préparation de LC-MS réactifs, mise en place d'une méthode de chromatographie, et mise en place de procédures opérationnelles instruments

  1. Préparation de solvants LC
    1. Préparer 500 ml phases mobiles. A est l'acétate d'ammonium 20 mM et 15 mM d'hydroxyde d'ammonium à 3% d'acétonitrile / eau, pH final de 9,0; et B est à 100% d'acétonitrile.
    2. Plafonner de manière lâche la bouteille, placez-le dans un bain sonique de l'eau, et soniquer pendant 10 minutes sans chauffage d'appoint. (Cette étape est de s'assurer que tous les sels d'ammonium se dissolvent complètement et qu'il n'y a pas de bulles d'air résiduelles.)
    3. Transférer 250 ml de solvant dans un flacon de 250 ml en verre pour un usage LC-MS, et de garder le reste à 4 ° C.
  2. Préparer la solution d'étalonnage bas de gamme de masse. Il est important d'utiliser un mélange d'étalonnage de la gamme basse de masse sur mesure pour les applications métabolomique pour s'assurer que les masses précises sont détectés à de faibles poids moléculaires.
    1. Peser 5 mg de deux Sodium fluoracétate et de l'acide homovanillique et les dissoudre dans 5 ml d'eau pour obtenir une concentration finale de 1 mg / ml. Dissoudre le diazinon dans du methanol pour obtenir une concentration finale de 10 mg / ml.
    2. Pour préparer 1 ml de solution négative faible d'étalonnage de masse, mélange 960 ml d'une solution thermo négatif d'étalonnage avec 20 ml d'fluoroaceate de sodium et une solution d'acide homovanillique. Pour faire 1 ml de solution positive d'étalonnage de faible masse, mélanger 990 ml de solution d'étalonnage thermique positif et 10 ml de solution de diazinon. (La solution d'étalonnage de faible masse doit être conservé à 4 ° C et être préparée tous les 2 mois.)
  3. Calibration de QE-MS à une gamme basse de masse
    1. Avant d'effectuer l'étalonnage de gamme basse de masse, effectuer un étalonnage de masse standard (m / z, 150-2,000) dans les modes à la fois positifs et négatifs en fonction des instructions du fabricant.
    2. Une fois qu'un calibrage de masse régulier passe, réglez la plage de balayage de 60 à 900 m / z dans le panneau de contrôle de l'instrumentet un CID de la source de 25 eV pour le mode positif et 35 eV pour le mode négatif est appliqué. (Cela donnera signaux robustes de la caféine et de l'ion fragment de l'ion sulfate. L'intervalle de balayage est fixé ici, parce que la dernière m / z ne doit pas être plus grand que 15 fois de la m début / z)
    3. Une fois que la source d'ions est stable, alors effectuer l'étalonnage sur mesure. Remarque: une source stable est définie comme étant inférieure à 10% de la variation de courant ionique totale en mode positif, et moins de 15% en mode négatif. Les ions d'étalonnage et de mesure correspondant à m / z sont indiquées au tableau 1.
  4. Établir l'instrumentation LC-MS pour l'analyse des métabolites polaires. LC est couplé à un QE-MS pour la séparation et la détection de métabolites.
    1. Équiper le QE-MS avec une sonde d'ionisation électrospray chauffée (H-ESI). Définissez les paramètres de réglage correspondant à la sonde comme indiqué: la température de chauffage, 120 ° C; gaz de gaine, 30; gaz auxiliaire, 10; balayer gaz, 3; pulvériser tension, 3,6 kV pourmode positif et 2,5 kV en mode négatif. Régler la température du capillaire à 320 ° C, et S-lentille à 55.
    2. Construire une méthode analyse complète comme suit: Gamme complète de balayage: 60 à 900 (m / z); résolution: 70 000; temps d'injection maximale: 200 ms avec un temps typique d'injection autour de 50 ms; commande automatique de gain (AGC): 3000000 ions. Ces paramètres conduisent à un cycle de travail de l'ordre de 550 ms pour effectuer des analyses en mode à la fois positif et négatif.
    3. Établir la méthode de chromatographie. Employer une colonne amide (100 x 2.1 mm de diamètre, 3,5 mm) pour la séparation de composé à la température ambiante 13,15. La phase mobile A est tel que décrit ci-dessus, et la phase mobile B est de l'acétonitrile. Utilisez un dégradé linéaire comme suit: 0 min, 85% de B; 1,5 min, 85% B, 5,5 min, 35% de B; 10 min, 35% B, 10,5 min, 35% B, 14,5 min, 35% B, 15 min, 85% de B, et de 20 min, 85% de B. Le débit est de 0,15 ml / min de 0 à 10 min et 15 à 20 min, et 0,3 ml / min 10,5 à 14,5 min.

2. Pra séparation des échantillons de métabolites

  1. Préparer un solvant d'extraction. Mélanger 40 ml de méthanol (LC-MS grade) et 10 ml d'eau (LC-MS grade) dans un tube de 50 ml, et le garder en -80 ° C congélateur pendant au moins 1 heure avant de l'utiliser. Remarque: Cette procédure et les étapes ci-dessous peuvent être modifiés pour l'extraction des tissus biologiques et des échantillons de fluide.
    1. Culture côlon HCT cancer de huit cellules dans trois boîtes de 10 cm ou des plaques à 6 puits avec du milieu de croissance complet, RPMI 1640 additionné de 10% inactivé par la chaleur de sérum bovin fœtal et 100 000 unités / L de pénicilline et 100 mg / L de streptomycine.
    2. Lorsque les cellules atteignent 80% de confluence, enlever rapidement le milieu, et placez le plat ou la plaque sur le dessus de 13,15 de la glace sèche. Ajouter 1 ml extraction par solvant immédiatement (80% de méthanol / eau), et transférer la plaque au congélateur à -80 ° C. Pour une boîte de 10 cm de côté, ajouter 3 ml de solvant d'extraction dans chaque puits. (Essayez de retirer le milieu autant que possible pour éviter l'effet de la suppression d'ions due aux sels résiduels du milieu.)
    3. Laisser la plaque pendant 15 min. Retirer du congélateur et gratter les cellules dans le solvant sur glace sèche. Transférer la solution dans 1,7 ml des tubes Eppendorf et centrifuger à la vitesse de 20 000 xg à 4 ° C pendant 10 min. (Préparer métabolites cellulaires de trois plats séparés pour faire trois échantillons répétés. L'objectif de maintenir deux tubes est d'avoir un comme une sauvegarde.)
    4. Transférer le surnageant dans deux nouveaux tubes Eppendorf, et les sécher dans un vide de vitesse. Cela prend environ 3-6 heures selon le vide de vitesse utilisée. (Les échantillons peuvent également être séchés pendant une nuit sous azote gazeux.)
    5. Après séchage tubes, magasins de chaque échantillon dans le congélateur à -80 ° C. Lorsque vous êtes prêt, reconstituer un échantillon dans 20 ml d'eau (LC-MS grade), et injecter 5 ml de LC-QE-MS pour l'analyse.

3. Configuration de la séquence de l'échantillon

  1. Une fois le calibrage a été correctement effectuée sur le QE-MS, équilibrer la colonne LC pendant 5 min avec 85% Un à un débittaux de 0,15 ml / min, ce qui est la condition de départ du gradient de LC.
  2. Mettre en place la séquence d'échantillons dans un ordre aléatoire. Remarque: De cette manière, on répartit les variations introduites par la LC-MS pour chaque échantillon et assure une comparaison plus précise entre les différents échantillons. Tous les six échantillons, ajouter un cycle de lavage, qui partage la même méthode MS, à l'exception du gradient de LC est de 95% de A pendant 10 min, suivie d'une colonne d'équilibrage de 5 min à 85% de A avec un débit de 0,15 ml / min. Ajouter échantillons blancs (100% d'eau) après chaque cycle de lavage pour évaluer le fond du système et reporter les quantités.
  3. Enregistrer la séquence et une fois la colonne LC indique la pression stable, autour de 400 psi, lancer le cycle de la séquence. S'il n'y a pas d'autre échantillon est à courir après cette séquence, puis ajouter une course d'arrêt à la fin de la séquence, qui a un débit de 0 ml / min à la fin de la pente et choisissez "veille" après avoir terminé la séquence.
  4. Ré-exécuter le même échantillon mis 12 heures après l'étalonnage. (I Cettes d'évaluer la fluctuation d'erreur de masse après le calibrage.)

4. Poster analyse Instrument de nettoyage et d'entretien

  1. A la fin de la séquence, laver la colonne avec 95% A à un débit de 0,2 ml / min pendant 2 h de débit, et, si nécessaire, d'inverser la colonne avant le lavage.
  2. Supprimez la colonne LC et connecter directement la LC à la source d'ions par un syndicat. Préparer un solvant de nettoyage, / méthanol eau / acide formique (v: v: v, 90:10:0.2), mis en MS en mode veille, et le système de lavage LC-MS à un taux de 0,1 flux ml / min pendant 1 heure pour éliminer le précipité résiduel sels ou d'autres impuretés. Abaissez le débit si la pression du système trop.
  3. Réglez la température capillaire à 50 ° C, et retirer la cage d'ions. Prendre avec précaution le cône de balayage ionique et du tube de transfert d'ions après que la température du capillaire chute à 50 ° C. Utiliser un maillage grossier, tel que du papier de verre, pour éliminer les impuretés laissées sur la surface du cône de balayage ionique.
  4. Placer le transfert d'ionstube dans un tube Falcon de 15 ml contenant 10 ml d'eau à 90% / méthanol avec de l'acide formique à 0,1%. Après sonication dans le tube un sonicateur à bain-marie pendant 20 min, décanter le solvant à l'intérieur, le remplacer par 10 ml de méthanol pur et sonication pendant 20 minutes. (Le cas échéant, la sonication peut être effectuée à 40 ° C ou à une température encore plus élevée pour obtenir de meilleurs résultats de nettoyage.)

5. Analyse des données LC-MS

  1. Pour assurer la séquence d'échantillons fonctionne bien, après avoir terminé les deux premiers échantillons de la séquence, consultez pics de métabolites inconnus. Utilisez un fichier csv Liste des noms de métabolites, formule chimique neutre et le mode de détection (positif ou négatif), que le fichier d'entrée, et le fichier de sortie contient des pics extraits et erreur de masse en ppm. Si la forme du pic est anormal ou l'erreur de masse est désactivée par plus de 5 ppm, puis le reste de la séquence doit être arrêté et le dépannage doit être fait.
  2. Choisissez la méthode de "l'alignement de pointeet l'extraction de cadre "sur les logiciels disponibles dans le commerce. Sélectionnez les données brutes de LC-MS et les regrouper. Choisir des échantillons dans le milieu de la séquence d'exécution comme échantillon de référence pour l'alignement de la Chromatographie de crête. Envoyez une graine de cadre y compris les métabolites connus pour l'analyse des métabolites ciblés avec des données collectées et la graine de trame correspondant.
  3. Effectuer l'analyse des données en mode positif et négatif séparément. Utilisez le paramètre par défaut pour les autres paramètres. Désactiver la fonction de recherche de base de données et exécuter le flux de travail. Exporter les données traitées comme une feuille Excel contenant l'aire du pic de chaque image. Les premières séries de cadres correspondent aux métabolites dans la liste ciblée. Remarque: Pour une analyse de métabolite ciblée, on obtient les informations de métabolites sur la base des études antérieures 13,15.
  4. Pour une analyse de métabolite non ciblée, choisir la méthode de "l'extraction de composants". Charger des échantillons vierges pour soustraction de fond. Réglez l'intensité du pic seuil, unet 10 5, m / z largeur de 10 ppm et le rapport signal sur bruit de 3.
  5. Utilisez la base de données métabolome humain pour l'identification des composés inconnus. Utilisez un filtre de CV pour supprimer les composants avec de grandes CV dans des échantillons répétés. Aller manuellement dans chaque composant et choisir ceux avec un pic bien défini ou relativement grande différence dans différents types de la recherche de base de données des échantillons. Exporter des données avec succès dans la base de données. (Alignement de pointe pourrait être contournée si le score d'alignement de pointe est trop faible.)

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Representative Results

L'exactitude des données de métabolomique dépend fortement de la performance de l'instrument LC-QE-MS. Afin de déterminer si l'instrument fonctionne dans de bonnes conditions, et si la méthode appliquée est correcte, plusieurs pics LC de métabolites connus sont extraites à partir de la chromatographie ionique total (CIT), comme représenté sur la figure 1. Metabolites polaires, y compris des acides aminés, des produits intermédiaires de la glycolyse , intermédiaires de TCA, les nucléotides, les vitamines, les ATP, NADP + et ainsi de suite avec une bonne rétention sur la colonne et de la bonne pointe formes dans la colonne amide dans des conditions de LC actuelles. Pendant ce temps, un test d'erreur de masse est effectuée dans les 24 heures après l'étalonnage de masse faible, comme illustré sur la figure 2. Six concentrations différentes d'échantillons en triple exemplaire sont exécutées deux fois après l'étalonnage, et l'ensemble de la gamme de temps couvre presque 24 h. L'erreur de masse est évaluée en comparant le rapport m / z théorique détectée au m / z de métabolites ciblés. Voici les métabolites ciblés ont un m / zallant de 74 (glycine) à 744 (NADP +). L'axe des Y ici représente le pourcentage cumulé de métabolites dans certaine gamme d'erreur de masse. La courbe bleue montre le résultat de 0 à 12 heures, tandis que la courbe de couleur rouge présente les données recueillies 12 à 24 heures. Figure 2 indique clairement que plus de 90% des métabolites sont à moins de 5 ppm d'erreur de masse, ce qui signifie la diminution de la masse méthode d'étalonnage de gamme développée ici est suffisante pour maintenir 5 ppm erreur de masse pour la détection de faible gamme de masse.

Un autre problème à résoudre est la sensibilité de l'instrument avec la méthode actuelle et la configuration de l'instrument. Une dilution en série des échantillons en triple à partir de 10 cm de boîte de Petri a été réalisée 5 fois avec un facteur de dilution de 6, de se retrouver avec 6 concentrations différentes d'échantillons. Ces échantillons représentent la quantité de métabolites extraits de 10 7, de 1,67 x 10 6, 10 5 2,78 x, 4,63 x 10 4, de 7,72 x 10 3 et 1.293 x 10 cellules, respectivement. Etant donné que chaque concentration d'échantillon est préparé en trois exemplaires, un total de 18 échantillons sont analysés dans le LC-MS-QE. Une liste ciblée est utilisée pour évaluer le nombre de métabolites détectés à la concentration de l'échantillon différentes. Le résultat sur ​​la figure 3 indique que le nombre optimal de métabolites ciblés détectées est comprise entre 2,78 x 10 5 et 1,67 x 10 6 cellules, tandis que 1 x 10 7 cellules donnent un plus petit nombre de métabolites détectés, ce qui est dû à des effets de suppression d'ions. Ce résultat indique que la quantité optimale de l'extrait des cellules pour cette analyse est à peu près celle d'un puits d'une plaque à 6 puits.

Pour l'analyse des métabolites non ciblée, une coupure de CV de 20% et une valeur d'intensité moyenne de 10 7 sont utilisés pour filtrer la table des composants. Ces CV et l'intensité moyenne des valeurs seuils rigides sont utilisés pour cet objectif de démonstration. Pour améliorer la reproductibilité, les valeurs de coupure CV peuvent êtreaugmenté (par exemple, 30%), tandis que les valeurs moyennes d'intensité doivent être diminué (par exemple, 5 10) pour inclure plus de pics. Après vérification manuelle des pics, des composants avec de bonnes formes sont sélectionnés et recherchés dans la base de données métabolome humain. Les résultats sont présentés dans le tableau 2. Tableau 2A présente les résultats à partir de données collectées en mode positif, tandis que le tableau 2B montre les résultats de mode négatif. Certains des métabolites identifiés ici se chevauchent avec les métabolites dans la liste ciblée, tels que le glutathion, la proline et ainsi de suite, mais en attendant, les métabolites supplémentaires absents de la liste ciblée sont explorées, comme methyglyoxal, qui peut être dérivée de la glycolyse, et une -palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine, qui est détectée en positif, avec un temps de rétention de 3,2 min, ce qui est raisonnable pour une rétention des phospholipides sur une colonne d'amide. Un protocole sur la recherche de base de données non ciblées métabolite a été previously rapporté 20.

Figure 1
Figure 1. Exemples de LC-MS des pics de chromatographie. Ici, la chromatographie en phase reconstruit est généré avec une fenêtre de 10 ppm de masse (m / z ± 5 ppm). L'axe des X montre le temps de rétention, tandis que l'axe des Y montre l'intensité relative, et l'intensité de crête est indiqué ci-dessus chaque métabolite. A montre des pics détectés en mode positif, tandis que B montre des pics de mode négatif. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 2
Figure 2. 60;. Évaluation de calibration bas de gamme de masse L'axe des Y est le pourcentage cumulé de métabolites avec l'erreur de détection de masse à moins de 5 ppm. L'axe des X correspond à la plage d'erreur de masse en ppm. Courbes bleues et rouges représentent 0-12 h et 12-24 h, respectivement. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 3
. Figure 3 Évaluation de la quantité d'échantillon -. Certain nombre de métabolites ciblés détectés en fonction du nombre de HCT 8 cellules carrés rouges représentent les métabolites détectés en mode positif, cercles bleus signifient métabolites mesurés en mode négatif, et les triangles noirs sont le nombre total de métabolites de deux mode positif et négatif. L'axe des X indique le nombre de HCT 8 cellules.upload/51358/51358fig3highres.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir l'image.

<td> NA
Normes M / Z, le mode positif M / Z, mode négatif Formule neutre Masse neutre
n-butylamine 74.096425 NA C 4 H 11 N 73.089149
fragment de caféine 138.066188 NA C 6 H 8 N 3 O 137.058912
Caféine 195.087652 NA C 8 H 11 N 4 O 2 194.080376
Le diazinon 305.108329 NA C 12 H 20 N 2 O 3 PS 304.101053
MRFA peptide 524.264966 C 23 H 37 N 7 O 5 S 523,25769
Fluoracétate N / A 77.004432 C 2 H 3 FO 2 78.011708
Sulfate N / A 96.960106 H 2 SO 4 97.967382
Acide Homovanillic N / A 181.050634 C 9 H 10 O 4 182,05791
Dodécylsulfate N / A 265.147906 C 12 H 26 SO 4 266.155182
Taurocholate N / A 514.2844 C 26 H 45 NO 7 S 515.291676

Tableau 1. Des normes d'étalonnage de la gamme de faible masse et leur exacte m / z.

<td> 131,05901
CSID Nom Formule Monoisotopique masse Rechercher masse Erreur (ppm) RT (min)
234 bêta-alanine C 3 H 7 NO 2 89,04800 89,04805 0,62 8.08
1057 Sarcosine C 3 H 7 NO 2 89,04768 89,04805 4.22 8.08
5735 alanine C 3 H 7 NO 2 89,04768 89,04805 4.22 8.08
568 Créatinine C 4 H 7 N 3 O 113,05900 113,05889 1.00 4.41
128566 Proline C 5 H 9 NO 2 115,06333 115,06338 0,41 7.54
6050 L-(+)-Valine C 5 H 11 NO 2 117,07898 117,07896 0,18 7.42
7762 Le nitrite d'amyle je C 5 H 11 NO 2 117,07898 117,07896 0,18 7.42
135 5-amino acide valérique C 5 H 11 NO 2 117,07900 117,07896 0,38 7.42
242 triméthylglycine C 5 H 11 NO 2 117,07900 117,07896 0,38 7.42
911 Niacinamide C6H6N2O 122,04800 122,04793 0,55 2.60
1091 Taurin C 2 H 7 NO 3 S 125,01466 125,01469 0.20 7.61
1030 Acide hydroxy pyrroline C 5 H 7 NO 3 129,04259 129,04259 0,02 8.51
7127 PCA C 5 H 7 NO 3 129,04259 129,04259 0,02 8.51
90657 N-acryloylglycine C 5 H 7 NO 3 129,04259 129,04259 0,02 8.51
388752 5-oxo-D-proline C 5 H 7 NO 3 129,04259 129,04259 0,02 8.51
389257 3-Hydroxy-3 ,4-dihydro-2H-pyrrole-5-carboxylique C 5 H 7 NO 3 129,04259 129,04259 0,02 8.51
8031176 Acide pyrrolidone C 5 H 7 NO 3 129,04259 129,04259 0,03 8.51
5605 Hydroxyproline C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05901 5.83 8.08
7068 N-Acetylalanin C 5 H 9 NO 3 131,05824 5.83 8.08
79449 Ac-Ala-OH C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05901 5.83 8.08
89122 Ethylformylglycine C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05901 5.83 8.08
167744 L-glutamique-gamma-semialdéhyde C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05901 5.83 8.08
388519 5-Amino-2-oxopentanoïque acide C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05901 5.83 8.08
134 Aminolévulinique C 5 H 9 NO 3 131,05800 131,05901 </ Td> 7,70 8.08
9312313 3-hydroxy-L-proline C 5 H 9 NO 3 131,05800 131,05901 7,70 8.08
566 Créatine C 4 H 9 N 3 O 2 131,06900 131,06905 0,36 8.08
5880 L-(+)-leucine C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09455 0,68 6,96
6067 L-(+)-Isoleucine C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09455 0,68 6,96
19964 L-norleucine C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09455 0,68 6,96 </ Td>
388796 bêta-Leucine C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09455 0,68 6,96
548 Aminocaproïque C 6 H 13 NO 2 131,09500 131,09455 3.48 6,96
6031 L-(-)-Asparagine C 4 H 8 N 2 O 3 132,05350 132,05348 0,10 8.31
109 Acide Ureidopropionic C 4 H 8 N 2 O 3 132,05299 132,05348 3.71 8.31
6026 L-Ornithine C 5 H 12 N 2 O 2 132,08987 132,08988 0,02 10.37
64236 D-Ornithine C 5 H 12 N 2 O 2 132,08987 132,08988 0,02 10.37
5746 Glutamine C 5 H 10 N 2 O 3 146,06914 146,06900 0,93 8.25
128633 D-glutamine C 5 H 10 N 2 O 3 146,06914 146,06900 0,93 8.25
141172 Acide Ureidoisobutyric C 5 H 10 N 2 O 3 146,06914 146,06900 0,93 8.25
21436 N-méthyl-D <scp> </ scp> acide aspartique C 5 H 9 NO 4 147,05316 147,05300 1.13 8.06
21814 D-- acide glutamique () C 5 H 9 NO 4 147,05316 147,05300 1.13 8.06
30572 L'acide L-(+)-glutamique C 5 H 9 NO 4 147,05316 147,05300 1.13 8.06
58744 N-acétyl-L-sérine C 5 H 9 NO 4 147,05316 147,05300 1.13 8.06
5907 L-(-)-méthionine C 5 H 11 NO 2 S 149,05106 149,05095 0,70 7.39
6038 Histidine C 6 H 9 N 3 O 2 155,06947 155,06940 0,48 8.33
5910 L-(-)-phénylalanine C 9 H 11 NO 2 165,07898 165,07887 0,63 6,60
1025 Pyridoxine C 8 H 11 NO 3 169,07390 169,07376 0,80 3.24
4463 Oxidopamine [USAN: DCI] C 8 H 11 NO 3 169,07390 169,07376 0,80 3.24
102750 5 - (2-amino-éthyl)-pyrogallol C 8 H 11 NO 3 169,07390 169,07376 0,80 3.24
388394 Noradrénaline C 8 H 11 NO 3 169,07390 169,07376 0,80 3.24
6082 L-(+)-arginine C 6 H 14 N 4 O 2 174,11168 174,11144 1,39 10.77
64224 D-Arg C 6 H 14 N 4 O 2 174,11168 174,11144 1,39 10.77
780 hétéroauxine C 10 H 9 NO 2 175,06300 175,06304 0,18 2.32
67261 Indole-3-acétaldéhyde, le 5-hydroxy- C 10 H 9 NO 2 175,06332 175,06304 1,65 2.32
3574185 Indole-2-acétique C 10 H 9 NO 2 175,06332 175,06304 1,65 2.32
5833 L-(-)-tyrosine C 9 H 11 NO 3 181,07390 181,07378 0,66 7,48
389285 3-Amino-3-(4-hydroxy-phényl) propanoïque C 9 H 11 NO 3 181,07390 181,07378 0,66 7,48
13628311 L-thréo-3-phénylsérine C 9 H 11 NO 3 181,07390 181,07378 0,66 7,48
425 4-hydroxy-4-(3-pyridyl)-butanoïque C 9 H 11 NO 3 181,07401 181,07378 1,25 7,48
13899 3 - (1H-indol-3-yl) acrylique C 11 H 9 NO 2 187,06332 187,06330 0,15 6.44
10607876 Acide indole C 11 H 9 NO 2 187,06332 187,06330 0,15 6.44
389120 N6, N6, N6-triméthyl-L-lysine C 9 H 20 N 2 O 2 188,15248 188,15221 1,45 10.87
388321 5 «S-méthyl-5"-thioadénosine C 11 H 15 N 5 O 3 S 297,08957 297,08898 2.00 2.56
144 9 - (5-s-méthyl-5-thiopentofuranosyl)-9H-purin-6-amine C 11 H 15 N 5 O 3 S 297,09000 297,08898 3.43 2.56
111188 Le glutathion C 10H 17 N 3 O 6 S 307,08380 307,08345 1.14 8.02

Tableau 2A.

5 H 9 NO 3 11 H 19 NO 9
CSID Nom Formule Monoisotopique masse Rechercher masse Erreur (ppm) RT (min)
857 Methylglyoxal C 3 H 4 O 2 72,02100 72,02108 1.03 7,70
1057 Sarcosine C 3 H 7 NO 2 89,04768 89,04747 2.33 8.19
5735 alanine C 3 H 7 NO 2 89,04768 89,04747 2.33 8.19
234 bêta-alanine C 3 H 7 NO 2 89,04800 89,04747 5,93 8.19
55423 acide R-lactique C 3 H 6 O 3 90,03169 90,03143 2.91 5.12
61460 Hydroxypropionique C 3 H 6 O 3 90,03169 90,03143 2.91 5.12
96860 L'acide L-(+)-lactique C 3 H 6 O 3 90,03169 90,03143 2.91 5.12
592 Acide lactique C 3 H 6 O 3 90,03200 90,03143 6.29 5.12
650 Dihydroxyacétone C 3 H 6 O 3 90,03200 90,03143 6.29 5.12
731 Glyceraldehyde C 3 H 6 O 3 90,03200 90,03143 6.29 5.12
1086 Acide sulfurique H 2 O 4 S 97,96738 97,96683 5,63 8.13
128566 Proline C 5 H 9 NO 2 115,06333 115,06302 2.67 7.78
1078 L'acide succinique C 4 H 6 O 4 118,02661 118,02630 2.66 7.72
466979 Erythrono-1 ,4-lactone C4 H 6 O 4 118,02661 118,02630 2.66 7.72
4483398 D-g-lactone érythronique C 4 H 6 O 4 118,02661 118,02630 2.66 7.72
473 Acide méthylmalonique C 4 H 6 O 4 118,02700 118,02630 5,96 7.72
8527138 (3S, 4R) -3,4-Dihydroxydihydrofuran-2 (3H)-one C 4 H 6 O 4 118,02700 118,02630 5,96 7.72
140384 L'acide 2-ketocaproic C 6 H 10 O 3 130,06299 130,06270 2.24 2.35
164251 Acide Methyloxovaleric C 6 H 10 O 3 130,06299 130,06270 2.24 2.35
388419 (3S)-2-3-Methyl oxopentanoïque acide C 6 H 10 O 3 130,06299 130,06270 2.24 2.35
15642233 Ketoleucine C 6 H 10 O 3 130,06299 130,06270 2.24 2.35
46 un-oxo-b-méthylvalérique C 6 H 10 O 3 130,06300 130,06270 2.36 2.35
69 L'acide alpha-ketoisocaproic C 6 H 10 O 3 130,06300 130,06270 2.36 2.35
134 Aminolévulinique 131,05800 131,05795 0,36 8.19
9312313 3-hydroxy-L-proline C 5 H 9 NO 3 131,05800 131,05795 0,36 8.19
5605 HYDROXYPROLINE C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05795 2.23 8.19
7068 N-Acetylalanin C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05795 2.23 8.19
79449 Ac-Ala-OH C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05795 2.23 8.19
89122 Ethylformylglycine C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05795 2.23 8.19
167744 L-glutamique-gamma-semialdéhyde C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05795 2.23 8.19
388519 5-Amino-2-oxopentanoïque acide C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05795 2.23 8.19
5880 L-(+)-leucine C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09419 3.39 7.09
6067 L-(+)-Isoleucine C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09419 3.39 7.09
19964 L-norleucine C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09419 3.39 7.09
388796 bêta-Leucine C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09419 3.39 7.09
548 Aminocaproïque C 6 H 13 NO 2 131,09500 131,09419 6.18 7.09
109 Acide Ureidopropionic C 4 H 8 N 2 O 3 132,05299 132,05321 1,60 8.28
6031 L-(-)-Asparagine C 4 H 8 N 2 O 3 132,05350 132,05321 2.21 8.28
6026 L-Ornithine C 5 H 12 N 2 O 2 132,08987 132,08961 1,98 10.36
64236 D-Ornithine C 5 H 12 N 2 O 2 132,08987 132,08961 1,98 10.36
193317 L - acide malique () C 4 H 6 O 5 134,02153 134,02130 1,72 7.95
510 (±)-acide malique C 4 H 6 O 5 134,02200 134,02130 5,25 7.95
133224 thréonique C 4 H 8 O 5 136,03717 136,03688 2.14 7,70
388628 L'acide 2,3,4-Trihydroxybutanoic C 4 H 8 O 5 136,03717 136,03688 2.14 7,70
2061231 acide DL-érythronique C 4 H 8 O 5 136,03717 136,03688 2.14 7,70
21436 N-méthyl-D <scp> </ scp> acide aspartique C 5 H 9 NO 4 147,05316 147,05299 1.16 8.05
21814 D-- acide glutamique () C 5 H 9 NO 4 147,05316 147,05299 1.16 8.05
30572 L'acide L-(+)-glutamique C 5 H 9 NO 4 147,05316 147,05299 1.16 8.05
58744 N-acétyl-L-sérine C 5 H 9 NO 4 147,05316 147,05299 1.16 8.05
6038 Histidine C 6 H 9 N 3 O 2 155,06947 155,06930 1,09 8.36
199 Allantoïne C 4 H 6 N 4 O 3 158,04401 158,04387 0,88 4,76
6082 L-(+)-arginine C 6 H 14 N 4 O 2 174,11168 174,11154 0,80 10,76
64224 D-Arg C 6 H 14 N 4 O 2 174,11168 174,11154 0,80 10,76
58576 L'acide N-acétyl-L-aspartique C 6 H 9 NO 5 175,04807 175,04803 0,18 7.87
996 Acide pyrophosphorique H 4 O 7 P 2 177,94299 177,94331 1,79 8.42
5589 Glucose C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0,41 7.53
17893 Mannose C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0,41 7.53
58238 . ß-D-glucopyranose C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0,41 7.53
71358 . Alpha-D-glucopyranose C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0,41 7.53
134838 3-désoxy-arabino-hexonique acide C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0,41 7.53
388332 L-sorbopyranose C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0,41 7.53
388476 bêta-D-galactopyranose C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0,41 7.53
388480 . AD-galactopyranose C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0,41 7.53
388775 bêta-D-fructofuranose C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0,41 7.53
10239179 Inositol C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0,41 7.53
16736992 Cis-inositol C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0,41 7.53
17216070 allose C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0,41 7.53
17216093 L-Sorbose C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0,41 7.53
201 hexopyranose C 6 H 12 O 6 180,06300 180,06346 2.53 7.53
868 1,2,3,4,5,6-Cyclohexanhexol C 6 H 12 O 6 180,06300 180,06346 2.53 7.53
2068 Théophylline C 7 H 8 N 4 O 2 180,06473 180,06346 7.04 7.53
4525 1,7-diméthyl-xanthine C 7 H 8 N 4 O 2 180,06473 180,06346 7.04 7.53
5236 La théobromine C 7 H 8 N 4 O 2 180,06473 180,06346 7.04 7.53
1161 isocitrique C 6 H 8 O 7 192,02701 192,02704 0,15 8.18
305 Ciacide gastrique C 6 H 8 O 7 192,02699 192,02704 0,23 8.18
963 acide pantothénique C 9 H 17 NO 5 219,11067 219,11049 0,84 6.72
6361 l'acide D-pantothénique C 9 H 17 NO 5 219,11067 219,11049 0,84 6.72
960 l'acide palmitique C 16 H 32 O 2 256,23999 256,24000 0,05 1,73
111188 Le glutathion C 10 H 17 N 3 O 6 S 307,08380 307,08339 1,35 8.03
388337 L'acide N-acétylneuraminique 309,10599 309,10585 0,45 7.43
392681 N-acétyl-neuraminique, l'acide alpha- C 11 H 19 NO 9 309,10599 309,10585 0,45 7.43
392810 L'acide sialique Neu5Ac C 11 H 19 NO 9 309,10599 309,10585 0,45 7.43

Tableau 2B.

. Tableau 2 Liste des métabolites non ciblées détectés dans HCT 8 cellules (2,78 x 10 5 cellules équivalence) Tableau 2A et 2B comprend des composants d'informations d'extraction:. ChemSpider ID (: temps de rétention, m / pendant ce temps, les résultats de recherche de base de données z et erreur de masse, et CSID), nom, formule, etc. Voici les échantillons analysés sont équationl de métabolites extraites de 2,78 x 10 5 cellules, et le seuil de l'intensité est de 1 x 10 7 à éviter résultat fastidieux pour but de démonstration.

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Discussion

Les étapes les plus importantes pour la réussite de profilage des métabolites dans les cellules à l'aide de ce protocole sont: 1) le contrôle du milieu de croissance et l'extraction minutieuse des cellules; 2) l'ajustement de la méthode de LC basée sur MS méthode configuration pour s'assurer qu'il ya suffisamment (habituellement au moins 10) points de données à travers un pic pour la quantification; 3) faire un étalonnage de faible masse avant d'exécuter les échantillons; 4) l'injection d'au plus 5 ml d'éviter les temps de rétention et de déplacement élargissement des pics due à l'eau; et 5) la préparation et l'analyse des échantillons de comparaison dans le même lot de minimiser les effets de lots.

Les normes (tableau 1) choisie ici pour l'étalonnage bas de gamme de masse sont interchangeables. Tout composé connu avec un m / z qui tombe dans la plage de balayage de masse, se comporte bien dans une source H-ESI, et est soluble dans l'eau, le méthanol, l'acétonitrile ou sont candidats raisonnables pour les normes d'étalonnage. Il est fortement recommandé de stocker tout des solutions d'étalonnage unet 4 ° C afin de stabiliser la caféine et également pour réduire au minimum l'évaporation du méthanol ou de l'acétonitrile dans la solution d'étalonnage de telle sorte que l'exécution de l'étalonnage peut être plus reproductible. Par rapport à une gamme de masse régulier, m / z de 150 à 2000, l'étalonnage de gamme basse de masse doit être fait le plus souvent, au moins une fois tous les deux jours.

Ce flux de travail, de l'extraction par solvant, solvant de reconstitution, phase mobile LC, à faible gamme d'étalonnage de masse et MS numériser gamme a été optimisé pour mesurer les métabolites polaires. Cela inclut les acides aminés, les acides aminés, acétyle intermédiaires de la voie de la glycolyse, les nucléosides, les produits intermédiaires du cycle du TCA, certains intermédiaires de la voie de métabolisme une teneur en carbone et ainsi de suite. Toutefois, les modifications de ce protocole pour les autres classes de métabolites, tels que la coenzyme A (CoA) espèces, folates, les phospholipides sont possibles. Par exemple, la CoA sont plus stables dans des conditions acides, de sorte que l'addition d'un acide à 80% de méthanol / eau sera utile pour impsensibilité rove CoA. Aussi, CoA et les lipides ont tendance à avoir de grands poids moléculaires beaucoup, donc le m / z plage de balayage doit être ajusté de 60 à 900 pour la bonne plage qui couvrira ces métabolites.

Même si quelques-uns des résultats de la recherche de base de données de composants non ciblés se chevauchent avec la liste ciblée, il est toujours important pour construire cette liste ciblée, basée sur la priorité de la recherche. Etant donné que les metabolites dans la liste cible est inférieur au seuil d'intensité moyenne, des informations sur ces métabolites sera supprimé pendant le traitement. La liste ciblée comprend les informations de temps de rétention, ce qui nous donne une plus grande confiance pour l'identification et la quantification des métabolites. Un autre avantage de la configuration QE-MS est que la spectrométrie de masse en tandem peut permettre en outre l'identification des métabolites.

Un problème lié à ce flux de travail est que l'aiguille insécurité H-ESIrt est sensible à la teneur en sel des échantillons, comme la sensibilité sera grandement compromise si il existe de grandes quantités de sels non volatils. Par conséquent, minimiser la teneur en sel des échantillons, et le nettoyage de routine de la colonne et l'aiguille insert H-ESI sera utile pour s'assurer que les données de bonne qualité et d'augmenter la durée de vie de la colonne.

En résumé, ce protocole utilise LC-QE-MS pour analyser avec succès métabolites polaires à partir de cellules en culture, avec l'échantillon étapes de préparation minimum et acquisition de données rapide. De petites modifications dans la préparation d'échantillons peuvent être effectuées pour obtenir des données provenant d'autres sources biologiques tels que le sérum et les tissus. Par exemple, comme le méthanol pur peut être ajouté au sérum liquide ajouté pour obtenir une concentration finale en methanol à 80% pour l'extraction des métabolites polaire. Pour les échantillons de tissus, l'agitation et le mélange rigoureux est nécessaire pour parvenir à une meilleure efficacité de l'extraction. Habituellement 10 ml de sérum ou1 mg de tissu est suffisant pour l'analyse des métabolites. Les données brutes peuvent être analysés à la fois en mode ciblé, s'il existe des métabolites connus dans les échantillons, et de façon non ciblée HRMS suivie par une recherche de base de données. Métabolomique HRMS base est encore à ses premiers stades. Pour les avances à venir, les techniques expérimentales peuvent être optimisées, un complément d'information de gestion des ressources humaines des métabolites et des motifs de fragmentation MS / MS seront algorithmes utiles et pertinentes, telles que l'alignement de pointe, l'intégration de pointe, le regroupement des isotopes et ainsi de suite, peut améliorer l'efficacité et la précision des le traitement des données. En fin de compte, cependant, la plupart des questions que nos adresses de laboratoire dans le métabolisme sont limités par une interprétation prudente des données après le traitement. Avec ces techniques de métabolomique à grande échelle, nous sommes souvent limités par notre interprétation des données et l'évaluation des hypothèses générées. Par conséquent, toutes les expériences de la métabolomique ont besoin d'être formulés autour de questions spécifiques.

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Disclosures

Les auteurs déclarent aucun conflit d'intérêt.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier Detlef Schumann, Jennifer Sutton (Thermo Fisher Scientific) et Nathaniel Snyder (Université de Pennsylvanie) pour des discussions utiles sur l'étalonnage de masse et le traitement des données. Recherche présentée dans cette publication a été soutenue par le National Cancer Institute des National Institutes of Health en vertu Prix Nombre R00CA168997. Le contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Positive calibration mix Thermo Scientific #88323 It is light sensitive. Store at 4 °C
Negative calibration mix Thermo Scientific #88324 Store at 4 °C
Diazinon Sant Cruz Biotechnology #C0413 It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 °C
H-ESI needle insert Fisher Scientific #1303200 This could be replaced or cleaned with 5% formic acid/water (remove rubber ring) if clogged.
Xbridge amide column Waters #186004860 Guard column is recommend to increase column lifetime.

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