Perfiles de Células Madre Embrionarias Humanas individual por RT-PCR cuantitativa

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Biology

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Summary

Se necesita ensayo de expresión de un solo gen celular para comprender las heterogeneidades de células madre.

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Lim, H., Choi, I. Y., Lee, G. Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR. J. Vis. Exp. (87), e51408, doi:10.3791/51408 (2014).

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Abstract

La heterogeneidad de la población de células madre dificulta la comprensión detallada de la biología de células madre, tales como su propensión hacia la diferenciación de diferentes linajes. Un único ensayo transcriptoma de células puede ser un nuevo enfoque para la disección de la variación individual. Hemos desarrollado el método de QRT-PCR de una sola célula, y confirmado que este método funciona bien en varios perfiles de expresión génica. En el nivel de una sola célula, cada célula madre embrionarias humanas, ordenados por OCT4 :: células positivas EGFP, tiene una alta expresión en OCT4, pero un nivel diferente de expresión NANOG. Nuestro ensayo de expresión solo gen celular debe ser útil para interrogar a las heterogeneidades de la población.

Introduction

Poblaciones eucariotas más altas son heterogéneos por lo tanto con el análisis de la población total combinada, a menudo es difícil de interpretar sus características celulares. Las células individuales dentro de una población pueden ser sutilmente diferente, y estas diferencias pueden tener consecuencias importantes para la propiedad y el funcionamiento de toda la población de 1, 2. Especialmente, las células madre embrionarias humanas (hESCs) son conocidos por ser heterogéneo, lo que provoca diferentes niveles de pluripotencia y diversas posibilidades para la especificación de linaje en delicadamente formas distintivas 3, 4. Por ejemplo, diferentes antígenos de superficie celular se pueden utilizar para clasificar las células madre pluripotentes no diferenciadas, 5 y el grupo de Austin Smith propuesto diferentes niveles de la pluripotencia en células madre embrionarias de ratón, sobre la base de su morfología, la propensión diferenciación y la dependencia de la vía de señalización 6. Este fenómeno se planteó la hipótesis de embrión humanolas células madre de la NIC 7. Mientras que los estudios se realizaron en general entre las diferentes líneas de células madre, las células madre no solo individuo, que podría ser muy interesante para analizar los diferentes niveles de la pluripotencia en el nivel de células individuales, lo que potencialmente afecta a su capacidad de diferenciación hacia todos los linajes de células somáticas.

Heterogeneidad celular y molecular podría ser dictada por la transcripción de perfiles, que se llama la 'transcriptoma de células individuales "y hace hincapié en nuevos enfoques para cuantificar los niveles de expresión de genes 8-10. Para el análisis de los niveles de expresión de genes en células individuales, hemos desarrollado un protocolo sencillo, pero robusto de una sola célula RT-PCR cuantitativa. Se confirmó la eficacia y la viabilidad de nuestro protocolo mediante la comparación de cada mitad de lisados ​​de células individuales, así como diluidos en serie RNAs totales de hESCs, dando como resultado variaciones técnicas mínimas y las diferencias. Además, se utilizó una línea reportero genética para aislar p homogéneaoblación de hESCs utilizando sistema de selección de genes. El vector donante para la orientación locus Oct4 (Oct4-2A-EGFP-PGK-Puro construir) y un par de plásmidos TALEN se utilizaron 11. El vector de donantes y un par de plásmidos Talen se introdujeron en hESCs (H9, WA09) utilizando nuestra nucleofection y protocolo de selección clonal y el mantenimiento de hESCs se realizó sobre la base de nuestro protocolo de rutina 12. Se confirmó esta línea genética reportero expresar EGFP para la expresión OCT4 en OCT4 :: EGFP hESCs.

Nuestro resultado demuestra que hESCs individuales (ordenados por OCT4 :: células fuertemente positivas EGFP) mantienen altos niveles de expresión OCT4, pero diferentes niveles de expresión de NANOG. Así, nuestro ensayo de expresión solo gen celular debe ser útil para estudiar las heterogeneidades de la población de células madre pluripotentes.

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Protocol

1. Preparación de una placa de 96 pocillos

  1. Mezclar 1 l de Single Cell Dnase1 a 9 l Single Cell Lysis Solution.
  2. Ponga la 10 l solución mixta en cada pocillo de placas de 96 pocillos PCR.

2. Extracción hESCs para FACS Purificación

  1. Separar Oct4 :: línea celular EGFP ES desde el plato de 60 mm con 1 ml de Accutase durante 20 min, a 37 ° C, la cual se neutralizó con los medios de comunicación ES humana.
  2. Preparar población de células en 1 ml de tampón FACS y ajustar la celda a 1 x 10 6 células / ml.
  3. Pasar la muestra de células a través de un tubo con tapa de filtro de células de 35 micras.
  4. Guarde el tubo en hielo antes de la clasificación de células.

3. Lisis de purificado FACS celda única en cada pocillo de la placa de 96 pocillos

  1. Ordene la muestra para células positivas EGFP en un clasificador de células con un operador entrenado. Ponga la única célula en una solución Lysis/DNase1 Single Cell en placas de 96 pocillos PCR. Si es necesario, el 9Placa de 6 pocillos con muestra puede ser almacenada en un -80 ° C congelador menos de un mes.
  2. Incubar las muestras 5 min a TA durante la lisis celular.
  3. Añadir 1 l de solución de parada para detener la reacción de lisis.
  4. Incubar 2 min a TA.

4. Transcripción inversa

  1. Añadir en cada una alícuota de 0,5 l de 20 mM SMA-T15, SMA-A.
  2. Añadir 4 l de tampón 5X, 2 l de DTT, 1 l de la transcriptasa inversa, y 1 l de dNTP a cada pocillo.
  3. Realizar la transcripción inversa en un termociclador.
    1. Establecer el programa térmica a 42 ° C × 90 min e inactivar la transcriptasa inversa a 85 ° C × 5 min.

5. Amplificación

  1. Añadir 4 l de reactivo ExoSAP-IT a cada muestra invertir transcritas.
    1. Incubar las muestras a 37 ° C durante 15 min y 80 ° C durante 15 minutos para inactivar el reactivo ExoSAP-IT.
  2. Prepare la mezcla de reacción de PCR wITH SMA-P2 (2 nM)
  3. Añadir 10 l de mezcla de reacción de PCR para cada muestra transcripción inversa.
  4. Realizar la amplificación, que consta de 20 ciclos de desnaturalización (94 ° C durante 30 segundos), recocido (57 ° C durante 30 seg), y extensión (68 ° C durante 10 min).

6. Rendimiento QRT-PCR

  1. Añadir 10 l de 2X SYBR Green PCR Master Mix, 1 l de ADNc amplificado, 2 nM primers, y 7 l de agua a cada pocillo.
    1. Establecer el programa seguido de 95 ° C durante 3 segundos, 60 ° C durante 30 seg x 40 ciclos.
  2. Lleve a cabo por duplicado de los errores técnicos.

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Representative Results

Amplificación de ARN de una sola célula eficiente y robusto

Para reducir al mínimo la variación transcripcional entre hESCs, utilizamos OCT4 :: EGFP células madre clon para la purificación FACS. Después de la clasificación Oct4 :: células EGFP positivas en una placa de 96 pocillos, cada célula se lisaron en tampón de lisis y se convierte poli (A) + ARN a ADNc de longitud completa usando SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) y cebador de anclaje con SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG ) mediante el uso de la tecnología de la plantilla de conmutación inteligente. Se digirieron los exceso de oligonucleótidos con el reactivo ExoSAP-IT, a continuación, seguido de 18-20 ciclos de amplificación por PCR de ADNc con SMA-P2 (GACATGTATCCGGATGT) 13. Se utilizó el ADNc amplificado para hacer que la plantilla para QRT-PCR (Figura 1). Hay varios estudios para la longitud de la secuencia de ARN completo y la medición de la variabilidad de ARN mediante el uso de bajas cantidades de células y células individuales 3, 14, 15. Para our conocimiento, que diluye el ARN total de hESCs (cantidades de microgramos) a niveles de nano-y pico-gramos y se aplica el protocolo para evaluar la variabilidad técnica y la detección de la diferencia en bajas cantidades de ARN total. Se determinó la reproducibilidad en los niveles de expresión de genes generadas a partir de ARN diluido y células individuales. Análisis del ARN diluido en serie muestra la correlación entre cada muestra y los resultados QRT-PCR con varias células individuales muestran los valores de Ct similares en el gen GAPDH (Figura 2).

La evaluación cuantitativa de los perfiles de genes de células individuales

Para validar la coherencia entre los diferentes lotes de reacciones de transcripción inversa, dividimos lisados ​​de células individuales purificados por FACS en la mitad y aplicamos nuestro protocolo por separado a cada medio de lisados ​​para comparaciones lotes. Clasificamos fuertes células positivas EGFP mediante FACS clasificador (Figura 3), por lo que el nivel de expresión OCT4 fue alta en EGFPcélulas positivas, pero el nivel de expresión de NANOG es variada. El resultado muestra una correlación significativa entre el valor Oct4 Ct de cada medio de lisados ​​de células individuales (Figura 4).

El análisis de los perfiles de genes de células madre embrionarias

Clasificamos hESCs individuales y analizamos su nivel de expresión génica utilizando nuestro protocolo, que muestra el nivel constante de expresión OCT4, y luego nos registramos otro gen NANOG marcador de células madre en hESCs. Como resultado, el nivel de expresión de genes Oct4 fue alta en cada célula, pero NANOG muestra diferentes patrones (Figura 5).

Figura 1
Figura 1. Esquema general de células madre embrionarias humanas sola QRT-PCR después de la purificación FACS.

Figura 2
Figura 2. Real-time RT-PCR de GAPDH mRNA utilizando diluido en serie de las células madre de embriones humanos agrupados. Cada punto muestra el valor Ct de serie diluido ARNm y el ARNm de células individuales, ordenados por FACS. Total RNAs se diluyeron de 10 ng / ul de 0,1 pg / ul. Repetimos mismos experimentos para la comparación y hecha trama lineal.

Figura 3
Figura 3. Análisis FACS de células positivas octubre. Estamos ordenados de células positivas EGFP mediante el uso de un clasificador FACS. Oct4 :: EGFP línea de células madre reportero muestra la población positiva alrededor de 60% ​​en comparación con EGFP negativo de la población (B). Seleccionamos fuertes células positivas EGFP (A).

Figura 4
Figura 4. Comparación del nivel de expresión de genes en cada medio de lisados ​​de células individuales. Para validar la coherencia entre los diferentes lotes de transcripción y amplificación de reacciones inversas, hemos dividido lisados ​​de células individuales en medio, y aplicado nuestro protocolo para la comparación por lotes.

La figura 5
Figura 5.60;. Mapa de calor presentación de un solo embrión expresión génica de células madre humanas análisis de la expresión génica de células individuales purificados por FACS muestra sólida expresión de Oct4, pero diferente nivel de expresión en NANOG.

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Discussion

Solo gen celular de perfiles podría ser una herramienta importante para predecir la funcionalidad de una sola célula o una población entera. Debido a limitaciones técnicas, todo el análisis de perfiles de genes se ha restringido a los promedios de la población. Se han propuesto variaciones en los patrones y niveles entre las células individuales y las subpoblaciones de expresión de genes para causar una interpretación errónea. Estos aspectos celulares diversos se pueden encontrar en hESCs y su heterogeneidad hace que sutilmente diferente capacidad para mantener la pluripotencia y el proceso de especificación del destino.

Hemos desarrollado y validado por una sola célula cuantitativa RT-PCR, que proporciona un método simple, pero sólida para el estudio de la expresión génica en las células individuales. Para validar nuestro protocolo, lisados ​​de células individuales purificado-FACS se dividen en medio y se aplican a este método para el control de precisión. Nuestro resultado con células individuales se corroboró con muestras de ARN total de serie diluido y encontramos resultados consistentes bntre cada medio de lisado de células (Figura 4). Sin embargo, con nuestro protocolo, hay algunas limitaciones. Hemos podido detectar el nivel de expresión de más de 40 genes, pero la información específica de la transcripción (por ejemplo, ARNm no polyadenylated, miARN transcripciones, desconocidos, etc) puede no ser detectable. También, hay algunas oportunidades para optimizar los cebadores para los genes diana. La longitud del cebador es aceptado por lo general 18-22 pares de bases. Las temperaturas de hibridación de los cebadores trabajan generalmente en el intervalo de 50-60 ° C. El contenido de GC de imprimación pueden ser afectados por la capacidad de recocido del cebador. En este trabajo, hemos eliminado la etapa de recocido en qPCR para reducir el error de hibridación del cebador. Sólo mostramos el gen GAPDH como control, pero la otra casa de mantenimiento de genes puede ser útil como un control. Actualmente estamos optimizando nuestro protocolo de secuenciación enfoque ARN, que destapará transcriptoma más detallada de las células individuales aisladas en un futuro próximo. La otra limitación es precisacracia de purificación FACS para aislar células individuales. Máquina FACS destina principalmente a las células individuales en cada pozo, pero no podemos excluir la posibilidad de que cada pozo puede contener más de una célula, que puede ser calculado con el avance técnico del sistema de purificación de FACS. Sin embargo, el protocolo puede ser directamente aplicable a cualquier laboratorio con un mínimo esfuerzo y rentable para el perfil de expresión génica de células individuales.

Como se muestra en la Figura 5, OCT4 :: células individuales positivas EGFP por FACS ordenados mantienen el mismo nivel de expresión del gen Oct4, pero NANOG mostraron patrón de expresión diversa, lo que podría sugiere los diferentes estados de la pluripotencia de hESCs o proceso de reprogramación 1 . Uno puede perfilar otra expresión de genes pluripotencia de las células individuales de hESCs utilizando diferentes marcadores de superficie celular (TRA-1-60, SSEA3, ICAM1, CD44), y / o del sistema reportero genética (NANOG, REX1, STELLA, ESRRB, etc) 5-7 . Mediante el uso de este protocolo, el enfoque de la expresión de un solo gen de las células es un método fácil y eficaz para poblaciones heterogéneas como hESCs u otros tipos de células madre.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Nos gustaría dar las gracias a los miembros del laboratorio Lee valiosa para los debates sobre el manuscrito. El trabajo en el laboratorio de Lee fue apoyado por becas de Robertson Investigator Award de la Fundación de Células Madre de Nueva York y de Maryland Stem Cell Research Fund (TEDCO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well PCR Plate USA scientific 1402-8900
Ambion Cell Lysis Kit Life Technologies 4458235
SMARTScribe Reverse Transcriptase Clonetech 639536
ExoSAP-IT USB 78200
Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity Invitrogen 11304
10 mM dNTP Mix, PCR Grade Invitrogen 18427
SYBR Universal 2X Master Mix Kapa biosystem KR0389
Accutase Innovative Cell Tech S-1100-1
FACS buffer 45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 μl DNase, filter sterilized
35 μm cell strainer cap tubes BD Biosciences 352235

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